《百香果品种鉴定技术规程SSR分子标记法》

Q/LB.□XXXXX-XXXX百香果品种鉴定技术规程SSR分子标记法范围本文件规定了利用简单重复序列（SSR）分子标记进行百香果品种鉴定的操作程序、数据记录与统计、判定方法。本文件适用于百香果品种SSR指纹数据采集及品种真实性鉴定。规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB19489实验室生物安全通用要求GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法NY/T2517植物新品种特异性、一致性和稳定性测试指南西番莲NY/T2594植物品种鉴定DNA分子标记法总则术语和定义下列术语和定义适用于本文件。推荐引物recommendedprimer品种鉴定中优先选用一套简单重复序列（SSR）引物，其检测位点具有多态性高、重复性好等综合特性。对照品种controlvariety对照品种具有所用SSR位点上不同等位变异的特性。对照品种用于辅助确定待测样品的等位变异，校正仪器设备的系统误差。原理不同品种百香果的遗传组成不同，其基因组（DNA）中SSR的重复次数存在差异，根据SSR的差异，通过PCR扩增及电泳技术可以鉴定百香果品种。材料和试剂除另有说明外，本标准中使用分析纯（含）以上试剂，水为符合GB/T6682规定的二级水，其中PCR用水要求达到一级水指标。试剂三羟甲基氨基甲烷（C4H11NO3）：纯度＞99%。乙二胺四乙酸二钠(EDTA·2Na)：纯度≥99.0%。硼酸（H3BO3）：ρ=1.43g/cm³，含量≥99.5%。十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）：ρ=1.32g/mL，纯度≥99.0%。氯化钠（NaCl）：ρ=2.165g/cm³，含量≥99.5%。琼脂糖。过硫酸铵（(NH4)2S2O8）：ρ=1.98g/cm³，含量≥98.0%。氢氧化钠(NaOH）：ρ=2.13g/cm³，含量≥96.0%。硝酸银（AgNO3）：ρ=4.35g/cm³，含量≥98.0%。甲醛（HCHO）：ρ=0.815g/cm³。液氮（N2）：ρ=0.81g/cm³。三氯甲烷（CHCl3）：ρ=1.50g/cm³。无水乙醇（CH3CH2OH）：ρ=0.79g/cm³，含量≥99.7%。DNA分析仪用LIZ500分子量内标。去离子甲酰胺（CH3NO）：ρ=1.133g/mL。40%丙烯酰胺/甲叉双丙烯酰胺溶液（Acryl/BisSolution(29:1)）。四甲基乙二胺（TEMED）：ρ=1.32g/mL。DNA分子量标准（DNAmarker）：可以清楚区分50bp～500bp的DNA片段。2×TaqPlusPCR预混试剂：0.1U/μLTaqPlusPolymerase、500μmol/LdNTPeach、20mmol/LTris-HCl(pH=8.3)、100mmol/LKCl、3mMMgCl2、稳定剂、增强剂。溶液配制5×TBE缓冲液称取5.4g三羟甲基氨基甲烷（5.1.1）、0.372g乙二胺四乙酸二钠（5.1.2）和2.75g硼酸（5.1.3）溶于70mL纯水中，定容至100mL，在103.4kPa（121℃）条件下灭菌20min。0.5×TBE缓冲液量取100mL浓度5×TBE（5.2.1）缓冲液于烧杯中，加入900mL纯水混匀。CTAB提取溶液称取4g十六烷基三甲基溴化铵（5.1.4）、16.38g氯化钠（5.1.5）、1.21g三羟甲基氨基甲烷（5.1.1）、1.49g乙二胺四乙酸二钠（5.1.2）溶于70mL纯水，定容至200mL，在103.4kPa（121℃）条件下灭菌20min。无菌纯水纯水在103.4kPa（121℃）条件下灭菌20min。1%琼脂糖溶液1g琼脂糖（5.1.6）溶于100mL的0.5×TBE缓冲液（5.2.2），适当加热融化。10%过硫酸铵溶液称取10g过硫酸铵（5.1.7），加入100mL纯水溶解。电泳缓冲液称取108g三羟甲基氨基甲烷（5.1.1）、7.44g乙二胺四乙酸二钠（5.1.2）、55g硼酸（5.1.3）、0.8g氢氧化钠（5.1.8），加入10L纯水溶解。染色液称取0.2g硝酸银（5.1.9），加入400mL纯水溶解。显色液称取4g氢氧化钠（5.1.8），加入400mL纯水溶解，临用时再加1.6mL甲醛（5.1.10）。仪器和设备电子天平：感量为1mg。水浴锅。高速冷冻离心机。PCR扩增仪。垂直板电泳系统。凝胶成像系统。毛细管电泳仪。胶片观察灯。SSR引物序列信息引物序列信息见附录A。操作步骤样品采集用不锈钢剪刀采集种植的已知品种的百香果嫩叶放入塑料样品袋中，做好标识，放入0-8℃保温箱中，带回实验室，于-18℃冰箱中保存备用。DNA的提取取8.1中适量百香果叶片用自来水冲洗干净，再用纯水冲洗两遍，自然晾干后用不锈钢剪刀剪碎放入研钵中，加入液氮（5.1.11）研磨成粉末状，分取100mg放入1.5mL离心管中，加入750µLCTAB提取溶液（5.2.3），涡旋振荡混匀后于65℃水浴45min~60min，期间每隔15min颠倒离心管混匀；加入500µL的三氯甲烷（5.1.12），颠倒混匀，12000rpm离心3min，转移上清液约0.5mL至新离心管中，加入等体积（即0.5mL）预冷至约4℃的无水乙醇（5.1.13），颠倒混匀，-18℃冰箱下静置1h，12000rpm离心3min，去上清液，室温下干燥沉淀。加入50µL无菌纯水（5.2.4）于-18℃冰箱中保存备用。以上为推荐的DNA提取方法。其他能够达到PCR扩增质量要求的DNA提取方法也适用于本规程。PCR扩增PCR反应体系PCR反应体系见表1。PCR反应体系试剂终浓度体积灭菌纯水-8.5µL2×TaqTaqPlusPCR预混试剂1×12.5µL10µmol/L正向引物0.4µmol/L1.0µL10µmol/L反向引物0.4µmol/L1.0µL25ng/µLDNA模板2.0ng/µL2.0µL总体积25.0µLPCR反应程序94℃预变性5min；94℃变性30s，退火30s（退火温度见附录A推荐引物表），72℃延伸30s，35个循环；最后72℃下延伸7min。PCR产物检测非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测聚丙烯酰胺凝胶制备在一对玻璃板间插入1.0mm宽的间隔片，在封口处注入1%琼脂糖溶液（5.2.5），让其凝固密封。在50mL量杯中依次加入7.5mL5×TBE缓冲液（5.2.1），7.5mL40%Acryl/BisSolution(29:1)（5.1.16），搅拌并用纯净水定容至30mL；加入200µL10%过硫酸铵（5.2.6）和12µL四甲基乙二胺溶液（5.1.17），混匀后倒入凝胶板之间，随即插好样品梳，使其在50min~60min内聚合凝固，凝胶高度应不小于10cm。电泳将玻璃板固定于垂直电泳槽上，在电泳槽中加入电泳缓冲液（5.2.7），小心拔下样品梳。用加样器吸取1µL不同引物（附录A）PCR产物，加入样品孔中，同时在同一块胶中加入1µLDNAmarker（5.1.18）。电泳选用的电压梯度为1~5V/cm，2×TaqPlus预混试剂（5.1.19）的蓝色指示带从上到下分别到达胶板1/2、2/3处（大约1h）后结束电泳。银染显色将附着凝胶的玻璃板用去离子水冲洗30s~60s后，将凝胶放入方形不锈钢盘中，加入染色液（5.2.8）覆盖凝胶，轻摇5min~10min进行染色；倒掉染色液，用去离子水快速漂洗，放入显色液（5.2.9）中，轻摇至显色出清晰带纹；取出凝胶用纯水冲洗两遍，沥干后进行拍照。毛细管电泳检测PCR产物样品准备分别取等体积的稀释后不同引物（附录A）PCR扩增产物溶液混合，从混合液中吸取1µL按序号加入到DNA分析仪专用96孔板孔中，板中各孔分别再加入0.1µLDNALIZ500分子量内标（5.1.14）和8.9µL去离子甲酰胺（5.1.15）。将样品在PCR仪上95℃变性5min，取出，迅速置于碎冰块上，冷却10-15min。将整个96孔板置于离心机中，离心10s后放置到DNA分析仪上待检。电泳检测按照仪器操作规程，编辑样品表及运行程序，执行运行程序，仪器自动给出检测结果，保存并记录数据。数据记录与统计样品每个SSR位点等位变异采用扩增片段长度表示；对于毛细管电泳检测方法，使用对照品种消除DNA分析仪间可能存在的系统误差，使用片段分析软件读取位点等位变异。对于非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测方法，将待检样品与对照品种的等位变异片段进行比较，明确待检样品位点等位变异。纯合位点结合等位变异大小数据记为X/X，其中X为该位点等位变异的大小；杂合位点的等位变异大小数据记录为X/Y，其中X、Y分别为该位点上的2个等位变异的大小，小片段数据在前、大片段数据在后；缺失位点的等位变异大小数据记录为0/0。样品在某个位点上仅出现1个等位变异，大小为160bp，则该位点的等位变异数据记录为160/160。样品在某个位点上仅出现2个等位变异，大小为160bp、165bp，则该位点的等位变异数据记录为160/165。判定方法当待检样品和对照品种间差异位点数≥2，则判定为“不同品种”；当待检样品和对照品种间差异位点数=1，判定为“近似品种”；当样品间差异位点数=0，判定为“极近似品种或相同品种”。

（规范性）

推荐引物推荐引物见表A.1引物编号及引物扩增信息序号引物名称条带大小（bp）引物退火温度（℃）引物序列（5’-3’）1PeRM1000195-10750正向：GCATGGACTTGATTTGTATATTCT反向：GAGAACAATGATGTCACTTTCATA2PeRM1000598-14050正向：TAGTGACATAACTGAAAACGCTAT反向：GAGTTACCGCTGAAGTTTTCTA3PeRM10006149-19050正向：TCATTAACATCGTAAACAAAGATT反向：AATTCGACAAGATTTACTGATACA4PeRM1000795-10650正向：GTAGTAGGAGAATATTTGAGGGAA反向：CTATTTTGTGATCCAAGGAAGT5PeRM10008105-12350正向：GTCACTATCATCCCATAAAAATTC反向：AGGTAAAATTAATATGATAAGCGAA6PeRM10009135-14550正向：GATTGATTTGTGGATGGATACT反向：CACTTGTTTCACTCGTACAATAAT7PeRM10011120-13010955正向：ATGGAGAAGACTTCAGAGTCAC’反向：AGAGATATTTTTCACTCACTGGAT8PeRM10012135-18015150正向：CTCCATATCAGATTAAGTAACCAC反向：CTCAAATAAAAACAAACCTGTTAC9PeRM10014130-14050正向：CATTTATAAAGGAATTGACAAGAA反向：CTGAGTTAATGCTGTGATTAAGAT10PeRM1001614950正向：AATTTTCTTGGCTTAAAACACTAC反向：TTGACTTCACTGCTATGGTATTAG11PeRM10017146-17650正向：AAGACACTGATAGTTCTCTGAGG反向：CAAATTATGATAAGAAACTTGGAA12PeRM10018160-17050正向：ACAGAAAAGAAAGATAAAGCAAAT反向：TTCAGTATCCAACTGAACACAC13PeRM10019142-15050正向：TGGTAGTCAATCAGAAAACTAAGA反向：GAGTTGTTAGGTCTCCTCAACTTA14PeRM10020132-14250正向：AACAGGGTATACTGTAAATCATTG反向：GTTTATTCCTTTCTCTTCTAGTGC15Pa_F-P10A1022050正向：TGGAATGTGATTTGCATGG反向：TAGGTATTGCTGGCGAAG16Pa_F+R-Contig11429050正向：CTTGCCTCTCTCCCTCTC反向：GGGTTTTGGGTTTGACAG表A.1引物编号及引物扩增信息（续）序号引物名称条带大小（bp）引物退火温度（℃）引物序列（5’-3’）17Pa_F-Contig1329350正向：CAGAAGGAAAACCAGCAAG反向：CCCCATCATCATCACTTTC18Pa_F-P7E10240-25550正向：TTAATGCCACAGCCCAAC反向：TGACCCAAAATCAAACACC19Pa_F+R-Contig80360-38055正向：TGTTCAAGCCCATCTTCG反向：GCTCTCGCTCTTGTCGTAG20Pa_F-P6H04280-29555正向：GAATAGGGTCAGCAGGAGG反向：GAGTGTGTCATCGGAGTCC21PE222353正向：GATCGGTCCTCGGTTAGAC反向：AGTCACACAGCATGAGAAATC22PE625853正向：GCAATTTCACCATCTTCTGCT反向：CCACGGTCATGGATGTTC