白骨壤NAC83和NAC29基因的克隆和功能初探

引言1.1研究背景盐胁迫，是一种非生物胁迫，在干旱、半干旱土地区域以及依赖灌溉系统的农业地带中尤为显著。据统计，全球的盐碱地总面积约为9.54亿公顷。在中国，盐碱地面积达到了9913万公顷，反映出中国盐碱地问题的普遍性和严重性。盐碱地是指由盐成土构成，土壤所含盐分影响到作物正常生长[1]。随着人类活动的加剧和全球的气候变暖，生态环境遭受到了严重的破坏，从而使土地盐碱化日益严重。盐胁迫主要通过渗透胁迫、离子胁迫以及高盐引起的营养缺陷等一系列的次生胁迫对植物造成危害以至于植物的生长发育会受到抑制[1]。因此，了解植物耐盐性的同时，研究怎么提高植物的抗逆性是十分重要的[2]。为了解决植物盐胁迫这一类问题，我们可以鉴定植物耐盐基因、通过基因工程手段提高植物的耐盐性能，有效改善植物盐胁迫和盐碱地土壤利用问题是提高盐碱地利用率的有效方法。基因表达调控是植物适应外部环境的基础，也是植物生长发育的关键[3]。植物在面对盐胁迫的严酷挑战时，体内起着关键作用的转录因子能够感应环境中盐分的浓度变化，迅速响应。通过调控基因表达而形成了一套响应调节机制，以应对非生物胁迫。NAC家族成员在植物非生物胁迫反应中担任了非常重要的角色[3]。随着研究的发展，该家族的许多基因已经在拟南芥、水稻、大豆、葡萄、番茄等物种中发现[5]。研究发现，在大豆中部分NAC基因参与了盐胁迫响应反应，例如，NAC181通过直接调控大豆中NINa表达，促进共生结瘤和耐盐性[6]；在拟南芥经过盐胁迫诱导后，研究者发现AtNAC40突变导致其种子萌发率升高[7]；在辣椒耐盐材料中，CaNAC36在根和茎的部分表达量有显著地提高。经过深入分析，研究者推测CaNAC36转录因子在盐胁迫初期感知发挥了关键的作用，这类基因不仅能够感知到盐环境地变化，还能迅速地将盐信号进行传递并且调控相关的耐盐基因应答[8]。水稻中有40个NAC家族成员在盐胁迫的响应反应过程中，调控大量胁迫相关基因的表达。然而，在盐生植物白骨壤中，NAC转录因子未被鉴定，功能也未被阐明。白骨壤（Avicenniamarina

)，学名海榄雌，是分布在热带亚热带海岸潮间带的泌盐性红树植物[9]，其叶片或茎表皮细胞可分化成盐腺，将体内过剩的盐分排除，保持植物体内盐含量较低的状态，植物受盐胁迫的危害就可以得到减轻[10]，在长期受到低温、高盐、淹水、土壤缺氧和潮水冲击等诸多恶劣因素的影响下，白骨壤在长期的进化过程中形成了一系列适应性调控机制来应对不良因素[11]，其中包括了形态结构、水分、光合作用、蒸腾作用、气孔导度等[12]。然而，白骨壤耐盐基因极少被鉴定、其耐盐分子机理仍有待阐明。目前，NAC家族基因在白骨壤逆境胁迫反应中的功能研究尚未见报道，红树植物NAC家族成员功能研究工作目前较为缺乏。白骨壤基因组数据的公开发表以及耐盐基因家族的初步鉴定，为我们开展基因功能研究提供良好的数据支持[13]，在前期研究工作中，我们已经完成了白骨壤NAC基因家族成员全基因组水平上的鉴定，转录组数据显示，该家族的成员基因在根、茎和叶等部位进行了表达，并且多个家族基因响应了盐胁迫处理。前期研究发现（图1-1A、图1-1B），在盐胁迫处理白骨壤条件下，AmNAC29和AmNAC83在白骨壤的叶片和根部组织中表达，说明该基因可能参与了白骨壤盐胁迫响应过程。本项目主要工作拟在前期工作的基础上，通过克隆已鉴定为有耐盐功能的基因，载体构建、拟南芥遗传转化等技术进一步探究其功能明确其在红树植物生长发育及盐胁迫响应过程中的作用、阐明其耐盐调控机制，为我国抗逆育种工程及沿海生态环境的修复提供理论基础依据。图1-1A：AmNAC基因盐胁迫响应模式分析B:AmNAC基因组织表达模式分析1.2技术路线2方法与材料2.1材料本研究选择在潮滩繁育的三月龄的白骨壤幼苗，再移栽至营养土，给白骨壤幼苗浇灌淡水，在温室内（25-30℃、12小时光照、12小时黑暗）恢复一周。将白骨壤幼苗实验组分别浸没在含0mM、500mMNaCl的蒸馏水中，每个处理设置三个生物学重复，分别在处理0h，6h，12h，24h和48h取叶片，液氮速冻备用。2.2实验方法2.2.1RNA的提取及cDNA的获得用RNAprepPure多糖多酚植物总RNA提取试剂盒（天根，中国)提取白骨壤地上呼吸根、地下呼吸根、幼根、幼叶、成熟叶、老叶、成熟果、幼果、花的RNA，操作流程按说明书的步骤进行白骨壤各器官RNA提取实验，具体方法如以下步骤：匀浆处理:50-100mg白骨壤各个器官剪碎后在液氮中快速研磨成粉末状态，加入1mLRNAZol溶液，让RNAZol溶液与白骨壤在液氮中研磨成粉末状的各个器官充分混匀；利用涡旋仪进行涡旋，剧烈震荡；离心后吸取上清；加入氯仿后盖上管盖，进行震荡；在4℃，离心后，吸取水样层加入异丙醇溶液，盖上管盖后手腕轻柔画八字混匀，在室温下静置；在4℃，离心后丢弃上清液；吸取上清液；加入乙醇溶液洗涤RNA沉淀；在4℃，离心后丢弃上清液，在室内温度放置3min，直到RNA晾干后加入Rnasefreewater，得到的RNA在-70℃冰箱保存。经浓度检测、琼脂糖凝胶电泳检测目的条带大小正确后，用于cDNA反转录。使用TransScriptOne-StepgDNARemovalandcDNASynthesisSuperMix试剂盒（全式金，北京)进行反转录以获得cDNA操作流程按说明书进行。方法如下：第一条cDNA合成和gDNA去除，反应体系在表2-1中列出；轻轻混匀后，42℃孵育30min；85℃加热5s失活TransScriptRT/RI与gDNARemover。使用内参引物，以cDNA作为模板进行PCR，PCR反应体系如表2-2，PCR反应程序如表2-3。经琼脂糖凝胶电泳检测，判断cDNA目的条带是否能用于后续的AmNAC29和AmNAC83基因的组织表达模式分析实验。表2-1白骨壤不同组织RNA反转录获得第一条cDNA合成和去除gDNA反应体系试剂用量2×TSReactionMix10μLTransScriptRT/RIEnzymeMix1μLgDNARemover1μLAnchoredOligo(dT)18primer(0.5μg/μL)1μLTotalRNA/mRNA5μLRNase-freeWater补足至20μL2-2验证白骨壤不同组织cDNA反应体系试剂用量2×magicGreenTaqSuperMix5μLTemplatecDNA1μLPrimerF0.5μLPrimerR0.5μLddH2OUpto10μL2-3验证白骨壤不同组织cDNA反应程序组分温度时间预变性变性退火延伸终延伸95℃95℃58℃72℃72℃3min10s10s35cycles20s5min2.2.2AmNAC29和AmNAC83基因的组织表达模式分析分别以AmNAC29和AmNAC83基因编码序列为模板设计实时定量PCR特异性引物，以白骨壤的地上呼吸根、地下呼吸根、幼根、幼叶、成熟叶、老叶、成熟果、幼果、花的cDNA为模板，使用ChamQUniversalSYBRqPCRMasterMix试剂盒进行实时荧光定量PCR（qPCR），qPCR反应体系如下：2×ChamQUniversalSYBRqPCRMasterMix*10μL，目的基因正、反方向引物各0.5μL，灭菌水8μL，白骨壤不同部位cDNA1μL，检测目的基因在白骨壤不同部位的表达情况。每个组织样品设置三个生物学重复。反应程序如表2-4所示：表2-4AmNAC29和AmNAC83基因组织表达模式分析的反应程序程序名称温度时间循环数Stage1预变性95℃2min1Stage2循环反应95℃60℃72℃10s10s25s4095℃10sStage3溶解曲线65℃1min195℃Stage4冷却40℃30s1数据处理方法：将qPCR得到的CP值使用Excel表格打开，求内参基因为引物下白骨壤不同组织的三个生物学重复CP值的平均值；用目的基因的CP值减去相对应白骨壤不同组织内参基因CP平均值可以得到Δcp=目的基因cp-内参基因cp均值；选对照组，用不同组织的三个生物学重复ΔCP值减去对照组ΔCP值得到ΔΔCP值；对不同组织三个生物学重复ΔΔcp值求2-ΔΔct；得到2-ΔΔct，求mean2-ΔΔct相对表达量值；求不同组织三个生物学重复ΔΔCP值的误差；将数据用柱状图表示。2.2.3白骨壤AmNAC29和AmNAC83的克隆进一步探究AmNAC29和AmNAC83的生物学功能。根据这两个基因的编码序列，用软件Primerpremier5设计特异性全长扩增引物(表2-5）。提取白骨壤根部的RNA，用得到的RNA反转录得到cDNA，提取方法如2.2.2提取白骨壤各器官的RNA和cDNA方法相同。用2×MagicGreenTaqSuperMix试剂盒（吐露港，中国）设置62.5℃、61.9℃、61℃、59.6℃、57.9℃梯度退火温度，进行PCR扩增，操作流程按说明书进行。AmNAC29、AmNAC83PCR扩增反应体系如表2-6、表2-7所示，反应程序如表2-8所示。表2-5AmNAC29和AmNAC83基因全长扩增引物序列基因名称基因ID引物序列（5'-3'）AmNAC29AM14G136FATTTGCACAGATTGTGAGTAATCCRCCAGAAGTTGGGACATTGAGGAmNAC83AM11G813FTTCATTTGCTCACATTGGCACRTTCAGAATCTGCGAGATCGAGT表2-6验证AmNAC29基因全长扩增引物反应体系试剂用量2×phataMaxMasterMix5μLAmNAC29-R0.5μLAmNAC29-F0.5μLcDNA1μLddH2O3μL表2-7验证AmNAC83基因全长扩增引物反应体系试剂用量2×phataMaxMasterMix5μLAmNAC83-R0.5μLAmNAC83-F0.5μLcDNA1μLddH2O3μL表2-8AmNAC29和AmNAC83基因全长扩增PCR反应程序组分温度时间预变性变性退火延伸终延伸95℃95℃55-62.5℃72℃72℃3min15s15s30cycles1min10s5minPCR扩增反应结束后，获得的PCR产物经琼脂糖凝胶电泳检测条带大小，正确后继续使用高保真酶进行扩增，反应体系如表2-9、2-10所示，反应程序如表2-11所示。表2-9高保真酶对AmNAC29基因全长扩增反应体系试剂用量2×phataMaxMasterMix25μLAmNAC29-R2μLAmNAC29-F2μLcDNA3μLddH2O18μL表2-10高保真酶对AmNAC83基因全长扩增反应体系试剂用量2×phataMaxMasterMix25μLAmNAC83-R2μLAmNAC83-F2μLcDNA3μLddH2O18μL表2-11高保真酶对AmNAC29和AmNAC83基因全长扩增反应程序组分温度时间预变性变性退火延伸终延伸95℃95℃59℃72℃72℃3min15s15s32cycles1min5min将扩增产物用EasyPureQuickGelExtractionKitDNA凝胶快速纯化试剂盒进行浓度为1.5%琼脂糖凝胶电泳，以检测目的基因的长度。跑胶结束后对目的条带进行切胶回收，方法如下：1.用刀片对目的DNA条带进行切割，放入干净的离心管中称重；2.向离心管里加入GSB溶液，在水浴锅中水浴溶解，融化后观察溶液颜色，可以加入适量的醋酸钠来调整成颜色和GSB溶液颜色相同的黄色；3.加入异丙醇，等凝胶溶液温度下降后离心；4.加入WB溶液，离心丢弃流出液；再次离心去除残留的WB溶液；5.打开盖子静置，让残留乙醇溶液得到挥发，向离心柱正上方加入EB溶液，进行离心，洗脱DNA，将洗脱的DNA放置-20℃保存。胶回收产物经浓度和纯度测定，-20℃条件下冻存或者用于后续重组载体的构建。2.2.4目的基因片段与表达载体重组首先从大肠杆菌提取出环状质粒pBInGlyRED（Red1），对质粒进行酶切制备线性载体，选用的酶是XmaⅠ和EcoRⅠ。构建重组的表达载体35S-AmNAC29-OE和35S-AmNAC83-OE。进行酶切制备线性载体反应体系如表2-12所示。目的基因与线性载体重组的反应体系如表2-13所示。表2-12双酶切制备线性载体反应体系试剂用量10×NEBufferRed1EcoRIXmaIddH2O5μL10μL1μL1μL33μL表2-13胶回收目的基因片段与线性载体重组反应体系试剂用量5×CEIIBufferExnaseII线性化载体插入片段ddH2O1μL0.5μL1.5μL2μLto5μL反应条件为：在PCR仪上设置反应程序37℃反应30min，立即放置于冰上冷却用于大肠杆菌的转化。2.2.5大肠杆菌的转化及阳性克隆的筛选胶回收的目的基因与线性载体重组完成后，将重组后的表达载体转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，方法如下：1.将DH5α感受态细胞从冰箱拿出插入冰上，待菌快要融化时加入胶回收目的基因片段与线性载体重组的产物，盖上盖子并用手把离心管轻捏在拇指和食指中，用另一只手的食指轻轻地拨打离心管底部，混匀后于冰上静置30min；2.水浴后取出插到冰上静置；3.向离心管中加入液体培养基，离心后在温度为37℃中复苏60min；4.离心收菌，吸取上清液留取200μL上清液，涂布到培养基上；5.培养基于37℃培养箱倒置过夜培养3-4天。大肠杆菌DH5α感受态细胞经过夜培养后，用于后续的阳性克隆的筛选工作。筛选方法如下：1.将过夜培养的培养基取出，挑单菌落；2.将挑出的单菌在含有LB液体培养基的离心管中转圈吹打；3.将离心管盖上盖子后，缠上封口膜放置培养箱中培养；4.取菌液进行PCR扩增，验证是否含有目的基因，PCR扩增反应体系如表2-14所示；PCR反应程序如表2-15所示。表2-14大肠杆菌菌液PCR鉴定反应体系试剂用量2×MagicGreenTaqSuperMixRED3-FRED3-R模板ddH2O5μL0.5μL0.5μL1μL3μL表2-15大肠杆菌菌液PCR鉴定反应程序组分温度时间预变性变性退火延伸终延伸95℃95℃56℃72℃72℃3min10s10s35cycles1min15s5min将PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，如结果有目的条带并且条带大小正确，则摇菌，提质粒琼脂糖凝胶电泳检测结果正确后则可送去测序。序列正确的菌液加入等体积50%的甘油，放在-80℃冰箱保存。2.2.6大肠杆菌质粒的提取及鉴定将含有目的基因的大肠杆菌经过挑菌、摇菌后使用质粒小提试剂盒按照说明书提取质粒具体实验方法步骤如下：向吸附柱CP3加入BL平衡液；离心把收集到的废液丢弃；把过夜培养的菌液加到离心管中，离心后丢弃上清物；在留有菌块沉淀的离心管中加入溶液P1，用涡旋仪把细菌沉淀悬浮加入溶液P2后加入溶液P3温和混匀，进行离心；把步骤三收集到的上清液吸取到吸附柱CP3中，离心；加入漂洗液PW进行离心，丢弃废液；接着再次离心除去残留的漂洗液，打开盖子待残留的漂洗液晾干向吸附柱膜的中间加入洗脱液EB，室温下放置后，离心把质粒溶液收集到离心管。获得的质粒溶液经浓度检测、琼脂糖凝胶电泳检测条带大小，测序正确则可用于农杆菌的转化。2.2.7农杆菌感受态GV3101的转化及阳性转化子的筛选将验证后的质粒与农杆菌进行转化，方法如下：把农杆菌感受态细胞从冰箱中取出放在冰上融化；向含有感受态细胞离心管里加入质粒，轻轻混匀；混匀之后按先后顺序分别在冰上，液氮和水浴锅各静置5min；向离心管加入液体LB培养基；培养6h后，进行离心保留200μL上清液，混匀涂布到LB培养基上，避光倒置培养3天。培养结束后，进行菌落PCR，反应体系如表2-16所示，反应程序如表2-17所示。表2-16农杆菌菌落PCR反应体系试剂用量2×MagicGreenTaqSuperMixRED3-FRED3-R模板（菌液）ddH2O5μL0.5μL0.5μL1μL3μL表2-17农杆菌菌落PCR鉴定反应程序组分温度时间预变性变性退火延伸终延伸95℃95℃58℃72℃72℃5min30s20s30cycles1min30s10min经琼脂糖凝胶电泳检测后条带大小正确，进行摇菌，保菌工作。将保的菌进行画线培养、挑菌、摇菌工作，用于后续的野生型拟南芥浸染实验。2.2.8拟南芥种植及花序浸染拟南芥种植方法：把营养土与蛭石按照3：1的比例混合均匀装入小盆中填装时注意不要将土压的太紧，在种植前需要将种子春化4天，保证种子一致。将春化好的种子播撒在土壤上，盖上一层较薄保鲜膜，保证湿度。在大约一周至半月左右长出3-4片叶后去除薄膜。浇水时用营养液喷洒在表面。室内培养温度为18-24℃。花序浸染：在浸染前，需要挑取划线培养的农杆菌感受态细胞单菌落，进行摇菌。每个培养基挑取两个单菌落进行摇小扩增，每个培养基小摇的菌液选取一瓶进行大摇扩增后加入蔗糖悬浮液。制备完成后，用于野生型拟南芥的浸染具体方法如下：1.划线培养：每个基因划两个含有抗生素培养基，28℃避光培养3天；2.每个培养基挑取两个单菌落进行摇菌，挑取后放到含有无菌水的离心管中混匀，加入LB液体培养基中，培养18h后于4℃冰箱保存；3.每个培养基小摇的菌液选取一个进行扩大培养，把小摇后的菌液加到LB液体培养基，培养10h后，检测OD600值。将大摇后的菌液离心后倒掉上清液。4.离心管中加入提前配好的蔗糖悬浮液吹打混匀，倒入浸染容器中再加入适量的悬浮液使OD值保持在0.4-0.6之间。5.将花序全部浸入菌液1min左右后取出，用不透光盒子罩住避光培养10h后揭开盖子。花序浸染每隔4天重复一次。重复4次花序浸染即可。浸染结束后得到T0代拟南芥株系。2.2.9拟南芥阳性转基因株系的筛选应用花序浸染法获得拟南芥T0代株系。T0代拟南芥收获的种子用75%乙醇消毒后，春化4天左右，春化结束后，将种子用移液枪吸取平铺在含卡那霉素的MS培养基上萌发，因为质粒pBInGlyRED含有编码红色荧光蛋白的基因片段，在卤素灯照射下阳性幼苗叶片会显示红色，选取叶片为红色的幼苗移入土壤中，待长大后采取转化后的T1拟南芥株系叶片，使用TransDirectPlantTissuePCRKit植物组织直接PCR试剂盒提取DNA进行阳性鉴定；提取DNA反应体系如表2-18所示，PCR反应程序如表2-19所示。表2-18阳性鉴定PCR反应体系试剂用量2×TransDirectSuperMixForward-FReverse-R模板（菌液）ddH2O5μL0.2μL0.2μL2μL2.6μL表2-19阳性鉴定PCR反应程序组分温度时间预变性变性退火延伸终延伸94℃94℃56℃72℃72℃10min30s30s36cycles1min10s8min3结果与分析3.1RNA的提取及cDNA的获得使用RNAprepPure多糖多酚植物总RNA提取试剂盒(天根，中国)提取白骨壤地上呼吸根、地下呼吸根、幼根、幼叶、成熟叶、老叶、成熟果、幼果、花的RNA，进行琼脂糖凝胶电泳检测，结果如图3-1所示。图3-1白骨壤不同器官RNA琼脂糖凝胶电泳注：1：白骨壤的花；2：成熟果；3：幼果；4：幼叶；5：成熟叶；经琼脂糖凝胶电泳检测，没有出现5SrRNA条带，RNA提取质量较高，可以用于后续的反转录实验。图3-2白骨壤不同器官cDNA的验证注：1：白骨壤的花；2：成熟果；3：幼果；4：幼叶；5：成熟叶；6：老叶；7：幼根；8：地下呼吸根；9：地上呼吸根将反转录得到的cDNA为模板，内参基因为引物进行琼脂糖凝胶电泳检测，条带大小正确，证明cDNA质量较好可用于白骨壤组织表达模式分析。3.2AmNAC29和AmNAC83基因的组织表达模式分析以AmNAC29、AmNAC83基因序列为模板设计定量PCR特异性引物，以白骨壤的地上呼吸根、地下呼吸根、幼根、幼叶、成熟叶、老叶、成熟果、幼果、花的cDNA为模板，通过实时荧光定量PCR，检测目的基因AmNAC29、AmNAC83在白骨壤不同部位的表达情况。结果表示，AmNAC29和AmNAC83基因在老叶中表达量最高，其次AmNAC29基因在地下呼吸根、幼根和成熟叶中表达量比地上呼吸根、幼叶、成熟果和幼果高，结果如图3-3所示。AmNAC83在地下呼吸根、幼根和花中表达量比成熟果、幼果和幼叶、成熟叶高，结果如图3-4所示。图3-3AmNAC29基因在白骨壤各个器官中的相对表达量图3-4AmNAC83基因在白骨壤各个器官中的相对表达量3.3白骨壤AmNAC29和AmNAC83的克隆用2×MagicGreenTaqSuperMix试剂盒（吐露港，中国）验证AmNAC29、AmNAC83全长基因克隆引物，设置62.5℃、61.9℃、61℃、59.6℃、57.9℃梯度退火温度，进行PCR扩增。结果如图3-5所示，AmNAC29、AmNAC83两个基因的引物条带在61.9℃和62.5℃两个退火温度比较明亮，可以继续用高保真酶进行全长基因克隆。图3-5白骨壤AmNAC29、AmNAC83基因克隆引物琼脂糖凝胶电泳验证注：M:Marker；29：AmNAC29基因全长基因克隆引物；83：AmNAC83基因全长基因克隆引物将AmNAC29、AmNAC83特异性引物继续扩增。通过琼脂糖凝胶电泳检测，如图3-6所示。结果表明PCR产物与目的基因长度基本一致，可以进行切胶，纯化回收。图3-6AmNAC29、AmNAC83基因全长引物PCR扩增琼脂糖凝胶电泳注：M：Marker；29：AmNAC29；83：AmNAC833.4目的基因片段与表达载体重组目的基因片段与表达载体重组选用的载体为pBInGlyRED，如图3-7所示。通过无缝克隆的方法将纯化后的PCR产物克隆进pBInGlyRED线性载体中，得到35S-AmNAC29-OE和35S-AmNAC83-OE的表达载体。阳性细菌克隆提取质粒进行测序确认。图3-7pBInGlyRED质粒图3.5大肠杆菌的转化及阳性克隆的筛选将重组的表达载体转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，经过夜培养后菌液PCR，检测表达载体是否已转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，AmNAC29基因大肠杆菌菌液琼脂糖凝胶电泳检测结果如图3-8所示。AmNAC83基因大肠杆菌菌液琼脂糖凝胶电泳检测结果如图3-9所示。图3-8AmNAC29基因大肠杆菌菌液PCR扩增琼脂糖凝胶电泳图3-9AmNAC83基因大肠杆菌菌液PCR扩增琼脂糖凝胶电泳经琼脂糖凝胶电泳检测，重组的表达载体已转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，选取三个条带明亮的菌液进行扩大培养及重组质粒的。3.6大肠杆菌质粒的提取及鉴定将含有重组载体的大肠杆菌提取质粒，将提取的质粒进行琼脂糖凝胶电泳检测，结果如图3-10所示。图3-10AmNAC29、AmNAC83质粒琼脂糖凝胶电泳检测结果显示，条带大小正确，质粒可以用于后续的农杆菌感受态细胞转化实验。3.7农杆菌感受态GV3101的转化及阳性转化子的筛选将提取的质粒经琼脂糖凝胶电泳检测后，进行农杆菌转化，将含有质粒的农杆菌菌落PCR，检测质粒是否已成功转化农杆菌。AmNAC29菌落PCR扩增检测结果如图3-11、3-12所示，AmNAC83菌落PCR扩增检测结果如图3-13所示。图3-11AmNAC29基因农杆菌菌落PCR扩增琼脂糖凝胶电泳图3-12AmNAC29基因农杆菌菌落PCR扩增琼脂糖凝胶电泳图3-13AmNAC83基因农杆菌菌落PCR扩增琼脂糖凝胶电泳从上述的琼脂糖凝胶电泳图可以看到，重组的质粒已经成功转化进农杆菌，可以进行后续的野生型拟南芥浸染实验。3.8拟南芥种植及花序浸染将含有质粒的农杆菌，每个基因的培养基挑取两个菌落进行摇菌，利用花序浸染法，得到转化后的拟南芥株系。将花序全部浸入菌液1min左右后取出，避光培养10h后转入正常光下培养。花序浸染每隔4天重复一次。浸染结束后得到T0代拟南芥株系。3.9拟南芥阳性转基因株系的筛选花序浸染结束后得到的T0代拟南芥，经培养收获种子进行播种，得到转化后的T1拟南芥株系。剪取对照组野生型拟南芥及T1代转化后的拟南芥叶片提取DNA为模板，进行琼脂糖凝胶电泳。将T0代拟南芥收获的种子进行播种，经培养，一共获得了20棵T1代AmNAC29基因转化后的拟南芥株系，琼脂糖凝胶电泳检测结果如图3-14所示。经培养一共获得了18棵T1代AmNAC83基因转化后的拟南芥株系，琼脂糖凝胶电泳检测如图3-15-A和3-15-B所示。图3-14T1代AmNAC29基因转化后的拟南芥株系阳性鉴定琼脂糖凝胶电泳经检测，有20株T1代AmNAC29基因转化后的拟南芥株系出现条带，且条带大小正确为阳性转基因株系。图3-15-AT1代AmNAC83基因转化后的拟南芥1-12号株系阳性鉴定琼脂糖凝胶电泳图3-15-BT1代AmNAC83基因转化后的拟南芥13-18号株系阳性鉴定琼脂糖凝胶电泳经检测，有6株T1代AmNAC83基因转化后的拟南芥株系出现条带，且条带大小正确为阳性转基因株系。4讨论与结论近年来，土地盐渍化是影响植物生长的原因之一[14]，NAC转录因子是植物中的一个超大的基因家族，因为其多样化的结构类型，在植物的生长，生理活动、抵御胁迫等不良环境中幼丰富的调控功能[15]。尤其在逆境胁迫的调控时，起着非常重要的作用[16]。随着研究的发展，该家族的许多基因已经在拟南芥、水稻、大豆、葡萄、番茄等物种中发现，但在白骨壤逆境胁迫反应中的功能研究尚未见报道。本研究中，从耐盐的红树植物种类白骨壤中克隆得到了AmNAC29、AmNAC83两个基因。通过基因在器官中的表达模式分析结果显示，AmNAC29基因同样是在老叶中表达量最高，表达量紧跟其后的是在地下呼吸根、幼根和成熟叶这些部位。AmNAC83基因在老叶中表达量最高，其次是地下呼吸根、幼根和花朵这些器官的表达量比其他器官高。这两个基因在根、叶、花、果实中的表达量都存在着非常明显的差异，根据表达模式分析图可以直观地看到，这两个基因主要是在叶片、根部中表达，但在果实和花中的表达量比叶片、根部要低.推测AmNAC29、AmNAC83两个基因可能主要是在根部和叶片中进行表达，发挥调控作用。结合翟允汝[17]的研究可以知道，在盐胁迫前，NnNAC35基因的表达在荷花中各个器官的表达量都有显著的差异，说明NAC家族基因可能具有器官表达特异性。本研究克隆AmNAC29和AmNAC83基因，通过构建过表达载体利用农杆菌介导法转化拟南芥，在经过培育后获得了T1代转化后的拟南芥，并筛选获得阳性转基因拟南芥株系，为后期研究T2代转基因拟南芥株系奠定基础。参考文献[1]周振玲.耐盐性不同水稻品种对盐胁迫响应的机制与调控[D].扬州大学,2024.DOI:10.27441/ki.gyzdu.2023.000113.[2]卢海峰.盐胁迫、干旱胁迫对紫花苜蓿生长和生理及叶片氮特征的影响[D].扬州大学,2023.DOI:10.27441/ki.gyzdu.2022.001247.[3]宋松波.转录因子ZmNAC20调控玉米响应干旱胁迫的分子机制[D].河南农业大学,2024.DOI:10.27117/ki.ghenu.2023.000408.[4