生物素材：教材梳理专题课题土壤中分解尿素的细菌的分离与计数

学必求其心得，业必贵于专精学必求其心得，业必贵于专精学必求其心得，业必贵于专精庖丁巧解牛知识•巧学一、筛选菌株1。PCR技术是一种在体外将少量DNA大量复制的技术，PCR技术的原理是：如果DNA片段两端的序列是已知的，那么采用PCR就可以很容易地将此DNA片段从整个DNA分子中扩增出来。进行PCR需要一段寡聚核苷酸链作为引物,它们各自与要扩增的靶DNA片段末端互补，引物与模板DNA相结合并沿模板DNA延伸，以扩增靶DNA序列.PCR技术需要使用耐高温的DNA聚合酶，这种酶要能够忍受93℃左右的高温。深化升华PCR的过程由三个基本反应组成：（热）变性、复性、延伸,这样构成一个循环的复制,新合成的DNA链又可以作为模板进行下一轮复制，重复3步操作。DNA片段呈2的指数增长，在1～2小时内可完成25～30次的循环，扩增的DNA片段数可增至106～107倍。2。选择培养基是指允许特定种类的微生物生长，同时抑制或阻止其他种类微生物生长的培养基。二、统计菌落数目1.直接计数法这种方法是指利用特定的细菌计数板或者血细胞计数板,在显微镜下计算一定容积样品中微生物的数量.计数板是一块特制的载玻片，上面有一个面积为1mm2和高0。1mm的计数室，该计数室又均分成400个小格.测量时将稀释的样品滴加在计数板上，盖上盖玻片，然后在显微镜下数出每个小格所含的细菌的平均数，再按下面的公式求出每毫升样品所含的细菌数。每毫升原液所含的细菌数＝每小格平均细菌数×400×1000×稀释倍数要点提示此方法的缺点是分不清活菌和死菌。2.间接计数法稀释涂布平板法，常用来统计样品中的活菌数，此法是根据微生物在固体培养基上所形成的一个菌落是由一个细菌繁殖而成的现象进行的，也就是说一个菌落就代表一个细菌。计数时先将待测样品进行一系列的稀释,再取一定量的稀释菌液接种在固体培养基上，使其较均匀地分布，经过一段时间的培养后，统计菌落数目，即可求出原液中的细菌数.疑点突破这种方法计算出的为活菌数目，但是该数目往往比实际数目要小，原因是如果稀释的倍数不够大,很可能出现两个或者更多的细菌在一起共同形成一个菌落的情况,在最后计算时,我们却是按照一个细菌来计算的。联想发散还可以用红细胞法来测量细菌的数目。该法要求先将数目已知的红细胞与已经稀释的菌液混合均匀,然后在显微镜下观察一滴菌液，计算出红细胞和细菌的数目比例,然后根据其比例推算出细菌的数目.由于这种方法偶然性较大，所以可以多观察几个视野,然后取平均值。三、设置对照对照实验是指除了被测试条件之外，其他条件都相同的实验。设置对照的主要目的是排除实验组中非测试因素对实验结果的影响,提高实验结果的可信度.利用稀释平板涂布法来统计样品的活菌数，步骤复杂,测定值可能会受到各种因素的影响,因而一定要设立对照。例如为了排除“培养基中混入了其他含氮物质”这种可能，可以设立一对照组，在该对照组中接种某种不能利用尿素的细菌如大肠杆菌，看一下这种细菌能否在培养基上生长，如果能生长,则说明该培养基中确实混入了其他含氮物质,如果不能生长则说明没有混入其他含氮物质.知识拓展常用的对照方式有四种:空白对照、自身对照、相互对照和条件对照。(1）空白对照就是不给对照组任何处理，如本实验中可以将一只培养皿（内有培养基）作为对照组,它可以检测出培养基是否被污染(目的是排除这种可能）。（2）自身对照是指对照组和实验组在同一对象上进行，也就是说把对象分成几部分,分别给予不同的处理.（3)相互对照是指不设对照组,几个实验组相互比较.（4）条件对照是指给予对照组一种被证明为有效因素的处理，例如研究者正在研究一种新的抗衰老药物,实验组使用这种药物，条件对照组就用已经被证明有抗衰老作用的维生素E来处理。如果实验结果相同,则说明该药物有抗衰老作用,否则就证明没有。误区警示不同的微生物培养时所需的温度和培养时间都不同，不能一概而论。例如细菌一般需要在30~37℃培养1～2天；放线菌一般在25~28℃培养5～7天；霉菌一般在25～28℃培养3～4天。三、实验设计方案：样品的稀释和稀释液的取样培养1.仪器、材料和用具：灭过菌的小铁铲、氮源为尿素的培养基、1mL的无菌吸管、无菌水、试管、无菌培养皿、无菌信封、酒精灯、烧瓶、涂布器。2.操作步骤：（1)在富含有机质、pH为接近中性的潮湿土壤中,用无菌小铁铲铲去表层土,迅速铲取土壤装入无菌信封，密封。然后在火焰旁称取土壤10g，倒入烧瓶中，塞好棉塞。（2）将称取的样品用无菌水稀释101、102、103、104、105、106倍,制备成菌液.（3）将上述培养基的9个平板分成3组，分别标记为104、105、106倍,用3支吸管分别吸取对应的菌液,滴入平板后用涂布器涂布。每组另外再设立两个对照,分别对含有硝酸盐和尿素（灭菌）、未严格灭菌（不含硝酸盐和尿素）的培养基进行涂布。（4）将平板放在30～37℃的温度下培养2天，菌落数目稳定后做记录,算出同一稀释度的3个平板的菌落平均数。要点提示(1）整个过程中要注意无菌操作，一定要建立“有菌观念"，知道杂菌无处不在。对不同的器具要选择不同的灭菌方法.(2）做好标记:整个操作中所用的培养皿、试管、吸管等都很多，因此要事先做好标记，避免混淆。（3）规划时间：微生物培养实验都是耗时很长的实验，因此要事先规划好时间，以便提高工作效率。（4)实验完成后，不同的实验小组要对结果进行比较，如果结果相差很大，一定要分析其原因。问题•探究问题1自生固氮菌是土壤中一种常见菌，以土壤中的腐殖质为营养物质来源,它能够利用空气中的氮气合成自身能够利用的氨，试探究其分离方法。思路:由题目提供的材料可知，自生固氮菌是异养微生物，因此培养基中必须添加有机碳源；一般微生物都不能直接利用氮气，而自生固氮菌可以利用氮气，利用这一特点可以配制选择培养基分离自生固氮菌。探究：配制固体培养基，其中加入有机碳源如葡萄糖、生长因子、水、无机盐,但一定要注意培养基内不能含有氮元素，灭菌后用涂布器涂布土壤稀释液，放在30℃下培养4天，培养基上所生菌落即是自生固氮菌的菌落。问题2培养基灭菌不彻底或者灭菌后使用之前被杂菌污染都能影响实验结果，试探究怎样鉴别培养基中是否有杂菌。思路：如果培养基中含有杂菌,那么在适宜的环境中它能繁殖而形成菌落.探究：将待检测培养基放在恒温箱内（35℃）培养2～4天，如果培养基上长出菌落，则说明培养基中含有杂菌，否则就没有杂菌，可以放心使用.典题•热题例1在微生物学中,将允许特定种类的微生物生长，同时又能抑制或者阻止其他种类微生物生长的培养基称作（）A.鉴别培养基 B.加富培养基C.选择培养基 D。基础培养基解析：考查培养基的分类.基础培养基是含有一般微生物生长繁殖所需基本营养物质的培养基，例如牛肉膏蛋白胨培养基；加富培养基一般用来培养营养要求比较苛刻的异养型微生物；鉴别培养基是在培养基中加入某种特殊的化学物质，微生物的代谢产物能与该物质产生特定的化学反应，产生明显的特征变化，如出现某种特定颜色等，从而鉴别出微生物种类；选择培养基是在培养基中加入某种物质，促进需要的微生物生长、抑制不需要的微生物生长，从而选择出某种微生物。答案:C拓展延伸培养基的分类标准有很多，因此类别也很多,不同类别的培养基所培养的微生物的种类和生长状况都是不同的，例如液体培养基常用于工业生产，而观察菌落就只能用固体培养基,分离菌种常用选择培养基，发酵工程常用天然培养基等。例2能够测定样品活菌数的方法是()A.稀释涂布平板法 B.直接计数法C。重量法 D.比浊法解析：考查各种计数方法的区别。直接计数法是利用计数板，在显微镜下计算出微生物的数量，该法不能区分死菌与活菌；重量法又分成干重和湿重法，主要用于测定微生物的群体生长量，也不能区分菌的死活;比浊法的原理是在一定范围内，菌液的浓度和浑浊度成正比，即与光密度成正比，该法也不能区分菌的死活;平板涂布法是先让细菌形成菌落，然后根据菌落数推算菌数的方法，由于只有活菌能形成菌落，因此该法能测定样品活菌数。答案：A.巧妙变式统计菌落数目的方法有(）①涂布平板法②重量法③直接计数法④比浊法⑤生理指标法⑥膜过滤法A.①②③⑥ B。③④⑤⑥ C.①D。①③解析:考查微生物的计数方法,解答时要抓住“菌落”这个关键要求。答案：C例3在做土壤中分解尿素的细菌的分离与计数实验时,甲组用氮源只有尿素的培养基，乙组实验用氮源除尿素外还有硝酸盐的培养基,其他的成分都相同，在相同的条件下培养、观察。乙组实验为（）A。空白对照 B。标准对照C.相互对照 D.条件对照解析：考查对照的分类。本实验的目的应该是证明只有分解尿素的细菌才能利用尿素，其他细菌不能利用尿素。由于硝酸盐是常用的氮源，这一点是已知的，因此该对照应该是条件对照。答案:D方法点拨在解析对照实验的作用时，一定先要根据实验目的，比较出实验组和对照组的不同因素，一般情况下这一因素就是单因子变量（有时也不是)，然后再确定对照的类型和所起的作用.例4某同学用101、102、103倍稀释液涂布平板时得到的平均菌落数为2760、295、和46，则菌落总个数为（）A.2。76×104个/mLB。2。95×104个/mLC.4.6×104个/mLD.3。775×104个/mL解析:对菌落计数时,要选择平板的平均菌落数在30～300个之间的稀释倍数，当只有一个稀释倍数符合此条件时，则对应平板的菌落数乘以稀释倍数就是该样品的细菌总数,若两个稀释倍数