高二 人教版-生物学选择性必修3 第3章《基因工程的基本操作程序（第3课时）》课件

高二—人教版—生物学选择性必修3—第3章基因工程的基本操作程序（第3课时）PCR是聚合酶链式反应的缩写，是一种高效的核酸体外扩增技术。PCR技术在生物学实验中具有非常广泛的用途，不仅应用在基因工程的基本操作程序中，还应用在遗传病的诊断、刑侦破案、新型冠状病毒核酸检测等多个领域。

探究∙实践DNA片段的扩增及电泳鉴定目的要求：1、了解PCR和电泳鉴定的基本原理。2、尝试进行PCR的基本操作，以及用琼脂糖凝胶电泳对PCR产物鉴定。一、DNA片段的扩增——PCR（一）实验原理2.PCR还利用了DNA的热变性原理，通过调节温度来控制DNA双链的解聚与结合。1.

PCR扩增DNA片段的原理：DNA半保留复制。一次PCR一般要经历30次循环。回顾：PCR反应过程变性（超过90℃，解旋）↓复性（50℃左右，引物与模板结合）↓延伸（72℃左右，合成新的DNA链）（二）材料用具1.PCR仪：自动控温的仪器，实现DNA的扩增。一、DNA片段的扩增——PCR2.微量离心管：进行PCR反应的场所。总容量为0.2mL（左）和0.5mL(右）的微量离心管PCR仪器（二）材料用具3.微量移液器：用于量取转移PCR配方中的液体。一、DNA片段的扩增——PCR4.一次性吸液枪头：微量移液器吸取一种试剂更换一次枪头。不同型号的微量移液器吸取溶液的体积（量程）不同。如：0.5-10μL，20—200μL，100—1000μL，1000—5000μL等。一次性枪头设定吸取体积时，严禁将体积刻度调到超出微量移液器量程范围，用完后调到最大刻度。（二）材料用具一、DNA片段的扩增——PCR5.微量移液器的使用容量设定吸液枪头安装吸液放液卸去吸液枪头利用调节旋钮设定。旋转安装法，用力不能过猛。按压推动杆至第一停点，然后将吸液枪头垂直进入液面，再平稳松开。枪头紧贴容器壁，按压推动杆至第一停点，稍作停顿后再按压至第二停点，以确保吸液枪头内没有液体残留。按压卸载枪头按钮。一、DNA片段的扩增——PCR视频微量移液器的使用（二）材料用具5.微量移液器的使用（二）材料用具一、DNA片段的扩增——PCR6.

PCR反应体系：PCR反应体系的配方模拟体内DNA半保留复制PCR反应体系：1.DNA模板；2.原料：4种脱氧核苷酸；3.引物：2种；4.DNA聚合酶；5.合适的反应条件：pH、Mg2+等。模板DNA5～10μL20mmol/L的4种脱氧核苷酸的等量混合液（实际为dNTP）1μL20μmol/L的引物Ⅰ2.5μL20μmol/L的引物Ⅱ2.5μL1—5U/μL的TaqDNA聚合酶（即耐高温的DNA聚合酶）1～2U10倍浓缩的扩增缓冲液（含Mg2+）5μLH2O（无菌水）28～33μL总体积50μL注：模板DNA的用量为用量为1pg-1μg。（二）材料用具一、DNA片段的扩增——PCR6.

PCR反应体系：知识链接：dNTP是指四种脱氧核苷酸三磷酸（dATP、dTTP、dGTP和dCTP）。脱氧核苷酸在DNA聚合酶催化新链合成的过程中，每掺入一个脱氧核苷酸，伴随着两个高能磷酸键的断裂，由此释放出的能量可以满足脱氧核苷酸聚合反应的需求。dNTP分子结构示意图下列关于PCR的说法，错误的是（

单选

）A.PCR是体外复制DNA的技术B.PCR过程中只需要一个模板DNA、两种引物分子、大量脱氧核苷酸原料C.TaqDNA聚合酶要具有耐高温的特点D.PCR利用了DNA的热变性原理答案：B（三）方法步骤视频PCR操作一、DNA片段的扩增——PCR用微量移液器把PCR配方中各组分加入到微量离心管中。将微量离心管放入离心机里，离心约10s，使反应液集中在离心管的底部。设置好PCR仪循环程序。将装有反应液的微量离心管放入PCR仪中。循环程序变性复性延伸预变性94℃，5min30次94℃，30s55℃，30s72℃，1min最后一次94℃，1min55℃，30s72℃，1min移液离心扩增（三）方法步骤预变性：使DNA充分变性，以利于引物更好地和模板结合。一、DNA片段的扩增——PCR原理：材料用具：基本操作步骤：PCR小结琼脂糖凝胶电泳产物鉴定DNA半保留复制、DNA热变性。PCR仪、微量离心管、微量移液器、一次性枪头、PCR反应体系配方。移液→离心→扩增。（一）实验原理二、PCR产物的鉴定——电泳1.电泳是指在电场作用下，带电分子向着与它所带电荷相反的电极移动的现象。

2.DNA分子具有可解离的基团，在一定的pH下，这些基团可以带上正电荷或负电荷。相同长度的DNA双链具有等量的净电荷，因此，同样大小的DNA在电场中会以相同的速率向一极移动。（一）实验原理二、PCR产物的鉴定——电泳PCR产物——DNA的鉴定一般用琼脂糖凝胶电泳。

在凝胶中DNA分子的迁移速率与凝胶的浓度、DNA分子的大小和构像等有关。4.凝胶中的DNA分子通过染色，可以在波长为300nm的紫外灯下被检测出来。下列有关电泳的叙述，不正确的是（

单选）

A．电泳是指带电粒子在电场的作用下发生迁移的过程

B．待测样品中DNA分子的大小和构象、凝胶的浓度等都会影响DNA的迁移速率

C．进行电泳时，带电粒子会向着与其所带电荷相同的电极移动

D．PCR的产物一般通过琼脂糖凝胶电泳来鉴定答案：C1.电泳装置（包括电泳仪、电泳槽等）（二）材料用具二、PCR产物的鉴定——电泳梳子制胶槽制胶板制胶工具（二）材料用具二、PCR产物的鉴定——电泳2.电泳缓冲液：主要作用是维持合适的pH，以及使溶液具有一定的导电性以利于DNA的迁移。目前常用的有1×TAE和0.5×TBE缓冲液。内含指示剂，PCR产物与其混合后再进行加样。凝胶载样缓冲液：琼脂糖核酸染料（三）方法步骤二、PCR产物的鉴定——电泳视频琼脂糖凝胶电泳操作用电泳缓冲液配制质量分数为0.8%—1.2%的琼脂糖溶液，加热至琼脂糖熔化，稍冷却后，加入适量的核酸染料混匀。将温热的琼脂糖溶液迅速倒入模具，并插入合适大小的梳子。凝胶溶液完全凝固后拔出梳子，形成加样孔。取出凝胶放入电泳槽内。将电泳缓冲液加入电泳槽中。将扩增得到的PCR产物与凝胶载样缓冲液混合，再用微量移液器将混合液缓慢注入凝胶的加样孔内。留一个加样孔加入指示分子大小的标准参照物（Marker）。配制琼脂糖溶液制备凝胶加样电泳、观察接通电源，待指示剂前沿迁移接近凝胶边缘时，停止电泳。取出凝胶置于紫外灯下观察和照相。（三）方法步骤二、PCR产物的鉴定——电泳原理：材料用具：基本操作步骤：PCR小结原理：材料用具：基本操作步骤：琼脂糖凝胶电泳产物鉴定DNA半保留复制、DNA热变性。PCR仪、微量离心管、微量移液器、一次性枪头、PCR反应体系配方。移液→离心→扩增。电泳装置（包括电泳仪、电泳槽等）、电泳缓冲液、凝胶载样缓冲液、琼脂糖、核酸染料。配制琼脂糖溶液→制备凝胶→加样→电泳→观察。电泳原理、影响凝胶中DNA分子迁移速率因素、染色检测。1.为避免外源DNA等因素的污染，PCR实验中使用的微量离心管、枪头和蒸馏水等在使用前必须进行高压灭菌处理。2.该实验所需材料可以直接从公司购买，缓冲液和酶应分装成小份，并在—20℃储存。使用前，将所需试剂从冰箱拿出，放在冰块上缓慢融化。3.在向微量离心管中添加反应组分时，每吸取一种试剂后，移液器上的枪头都必须更换。4.在进行操作时，一定要戴好一次性手套。5.PCR扩增不要随意加大试剂用量。注意事项:小结谢谢观看！高二—人教版—生物学选择性必修3—第3章基因工程的基本操作程序（第3课时）答疑同一块凝胶中，DNA分子量大小与迁移速率的关系是怎样的？同一块凝胶中，DNA分子越大，迁移速率越慢，反之越快。结束电泳时，DNA分子越大，迁移距离越短，离点样孔越近。判断是否成功扩增出DNA片段的依据是什么？（1）观察DNA条带的分布。如对比标准参照物（Maker），可知扩增出的DNA片段大小。（2）观察DNA条带的粗细程度。如果电泳鉴定结果没有条带，或不止一条条带，请分析产生这个结果的可能原因。如果扩增结果没有条带，即扩增不成功，可能的原因有：漏加了PCR的反应成分；各反应成分的用量不当；PCR程序设置不当等。如果扩增结果不止一条条带，可能的原因有：引物设计不合理，它们与非目的序列有同源性或容易形成二聚体；复性温度过低；DNA聚合酶的质量不好等。PCR实验中如何设置对照？对照1（阴性对照）：PCR反应体系中不加入模板DNA，而是以无菌水补足总体积，其他成分不变。以排除反应体系等对实验结果的干扰。对照2（阳性对照）：PCR反应体系中不加入模板DNA，而是加入已知的包含目的基因的片段，其他成分不变，以检测PCR的效率。用PCR方法检测