高效液相色谱课件

172高效液相色谱17高效液相色谱172高效液相色谱主要内容§1概述§2高效液相色谱仪§3高效液相色谱法的类型§4应用172高效液相色谱§1概述一、HPLC与经典LC的比较

高速

HPLC只需数分钟;而经典LC完成一次分析需时数小时。

高效

HPLC柱效很高;可以在数分钟内完成数百种物质的分离。灵敏度高检测器灵敏度极高：UV—10-9g,荧光检测器—10-11g。172高效液相色谱§1概述二、HPLC与GC的比较分析对象及范围：

GC分析只限于气体和低沸点的稳定化合物，占有机物总数的20%；

HPLC可以分析高沸点、高分子量的稳定或不稳定化合物，这类物质占有机物总数的80%。172高效液相色谱§1概述二、HPLC与GC的比较流动相的选择：

GC采用的流动相中为有限的几种“惰性”气体，对组分作用小；

HPLC采用的流动相为液体或各种液体的混合，可与组分作用，并与固定相对组分的作用产生竞争，可通过溶剂来控制和改进分离。172高效液相色谱§1概述二、HPLC与GC的比较操作温度：

GC需高温；HPLC通常在室温下进行。

172高效液相色谱§2高效液相色谱仪

仪器结构示意见下图，分为4个主要部分：高压输液系统，进样系统，分离系统和检测系统。此外还配有辅助装置：如梯度淋洗，自动进样及数据处理等。172高效液相色谱§2§2高效液相色谱仪172高效液相色谱§2高效液相色谱仪一、高压输液系统它是高效液相色谱仪最重要的部件，一般由储液罐、高压输液泵、过滤器、压力脉动阻力器等组成，其中高压输液泵是核心部件。§2172高效液相色谱§2高效液相色谱仪一、高压输液系统1、贮液罐2、高压泵3、梯度洗脱装置§2172高效液相色谱§2高效液相色谱仪1、贮液罐贮液罐为不锈钢、玻璃或氟塑料制成的容器，容量为0.5~2L，用来贮存足够数量、符合要求的流动相。溶剂使用前，必须先脱气。脱气方法：低压脱气、超声脱气、吹氦气脱气等。§2172高效液相色谱§2高效液相色谱仪2、高压泵高压输液泵是高效液相色谱仪中关键部件之一，是流动相的动力源。要求：流量稳定、输出压力高、流量范围宽、耐酸碱和缓冲液的腐蚀、压力变动小、空间小、易于清洗和更换溶剂、具有梯度洗脱功能。§2172高效液相色谱§2高效液相色谱仪2、高压泵类型：恒压泵、恒流泵两大类，多使用恒流泵。往复柱塞泵是目前使用最广泛的一种恒流泵；由偏心轮带动活塞往复移动，恒流输出，并通过改变电机转速调节流量。§2172高效液相色谱§2高效液相色谱仪§2播放172高效液相色谱§2高效液相色谱仪3、梯度洗脱装置梯度洗脱就是在分离过程中使两种或两种以上不同极性的溶剂按一定程序连续改变它们之间的比例，从而使流动相的强度、极性、pH值或离子强度相应地变化，达到提高分离效果，缩短分析时间的目的。§2172高效液相色谱§2高效液相色谱仪3、梯度洗脱装置

1）低压梯度（外梯度）装置，流动相在常温常压下混合，用高压泵压至柱系统，仅需一台泵即可。

2）高压梯度（内梯度）装置，先将两种溶剂分别用泵增压后，再由泵按程序压入混合室，混合，再注入色谱柱。§2172高效液相色谱§2高效液相色谱仪二、进样系统进样系统包括进样口、注射器和进样阀等，它的作用是把分析试样有效地送入色谱柱上进行分离。要求：重复性好、死体积小、保证柱中心进样、流量波动小、便于实现自动化§2172高效液相色谱§2高效液相色谱仪1、进样器进样

优点：可柱头进样，减小死体积，充分发挥柱的效能，简单便宜。缺点：是高压进样时漏液．会产生误差，隔垫使用次数有限，进样量小，重复性差。§2172高效液相色谱§2高效液相色谱仪2、六通阀进样目前，广泛采用六通进样阀，它可以承受很高的压力，由于进样量是由进样定量管决定的，因此，可以获得好的重复性，更换不同体积的进样定量管，可调整进样量。§2172高效液相色谱§2高效液相色谱仪§2172高效液相色谱§2高效液相色谱仪三、色谱分离系统色谱柱包括柱管和固定相两部分

固定相的要求：柱效高、选择性好、分析速率快粒度一般为2，5，7，10μm，理论塔板数每米16万~5万§2172高效液相色谱§2高效液相色谱仪四、检测系统在液相色谱中，有两种基本类型的检测器。一类是通用型检测器，它仅对被分离组分的物理或化学特性有响应。另一类是选择性检测器，它对试样和洗脱液总的物理或化学性质有响应。§2172高效液相色谱§2高效液相色谱仪1）紫外检测器：应用最广，对大部分有机化合物有响应。特点：灵敏度高；线形范围高；流通池可做的很小（1mm×10mm，容积8μL）；对流动相的流速和温度变化不敏感；波长可选，易于操作；可用于梯度洗脱。§2172高效液相色谱§2高效液相色谱仪§2172高效液相色谱§2§2高效液相色谱仪2）二极管阵列检测器172高效液相色谱§2高效液相色谱仪§2172高效液相色谱§2高效液相色谱仪3）荧光检测器灵敏度高，选择性好，可用于梯度洗脱。§2172高效液相色谱§2高效液相色谱仪4）电化学检测器电导检测器安培检测器§2172高效液相色谱§3高效液相色谱法的类型一、HPLC的固定相和流动相二、液固吸附色谱法三、液液分配色谱四、化学键合相色谱法五、离子交换色谱六、凝胶色谱法172高效液相色谱§3§3高效液相色谱法的类型一、HPLC的固定相和流动相1.固定相高效液相色谱固定相以承受高压能力来分类，可分为：刚性固体和硬胶固定相按孔隙深度分类可分为：表面多孔型和全多孔型固定相172高效液相色谱§3§3高效液相色谱法的类型一、HPLC的固定相和流动相1.固定相刚性固体以二氧化硅为基质，可承受7.0

108～1.0

109Pa的高压，可制成直径、形状、孔隙度不同的颗粒。是目前最广泛使用的一种固定相。172高效液相色谱§3高效液相色谱法的类型一、HPLC的固定相和流动相1.固定相

硬胶主要用于离子交换和尺寸排阻色谱中，它由聚苯乙烯与二乙烯苯基交联而成。可承受压力上限为3.5

108Pa。§3172高效液相色谱§3高效液相色谱法的类型

表面多孔型担体的基体是实心玻璃球，在玻璃球外面覆盖一层多孔活性材料，如硅胶、氧化硅、离子交换剂、分子筛、聚酰胺等。其多孔层厚度小、孔浅，相对死体积小，出峰迅速、柱效亦高；颗粒较大，渗透性好，装柱容易，梯度淋洗时能迅速达到平衡，较适合做常规分析。§3172高效液相色谱§3高效液相色谱法的类型全多孔型固定相由直径为10μm的硅胶微粒凝聚而成。由于颗粒很细（5～10

m），孔仍然较浅，传质速率快，易实现高效、高速。特别适合复杂混合物分离及痕量分析。§3172高效液相色谱§3高效液相色谱法的类型一、HPLC的固定相和流动相2.流动相要求是：1）不与固定相发生不可逆化学反应2）对待测样品有足够的溶解度3）与所用检测器匹配4）粘度尽可能的小5）纯度高§3172高效液相色谱§3高效液相色谱法的类型二、液固吸附色谱法1、原理2、固定相3、流动相

§3172高效液相色谱§3高效液相色谱法的类型二、液固吸附色谱法1、原理溶质分子和流动相分子在具有表面活性的吸附中心上进行竞争，这种作用还存在于不同溶质分子间，以及同一溶质分子中不同官能团之间。由于这些竞争作用，形成了不同溶质在吸附剂表面的吸附、解吸平衡，这就是液固色谱法的选择性吸附分离原理。§3172高效液相色谱§3高效液相色谱法的类型二、液固吸附色谱法1、原理吸附竞争的过程可表示为：吸附达到平衡时，平衡系数为：§3172高效液相色谱§3高效液相色谱法的类型二、液固吸附色谱法2、固定相液固色谱固定相可分为极性和非极性两大类型。极性吸附剂包括硅胶、氧化铝、氧化镁、硅酸镁、分子筛及聚酰胺等。非极性吸附剂最常见的是活性炭。至于今液固色谱法应用最广泛的是极性固定相硅胶。§3172高效液相色谱§3高效液相色谱法的类型二、液固吸附色谱法3、流动相选择原则是：极性大的试样选极性强的洗脱剂在液固色谱法中，常用水对硅胶固定相进行减活处理，此时流动相中水的饱和度应小于25%，若水含量过高，大量水附着在硅胶上会使液固色谱过程转变成液液色谱过程而影响分离效果。§3172高效液相色谱§3高效液相色谱法的类型三、液液分配色谱1、原理2、固定相3、流动相

§3172高效液相色谱§3高效液相色谱法的类型三、液液分配色谱1、原理用涂渍在基体上的固定液作固定相，以不同极性溶剂作流动相，组分分子依据它们在固定液与流动相中的溶解度,即溶质分子在固定相和流动相间的分配系数大小来进行分离的色谱方法。§3172高效液相色谱§3高效液相色谱法的类型三、液液分配色谱2、固定相用常用的固定液有下列几种:

，

—氧二丙腈（ODPN）聚乙二醇（PEG）十八烷（ODS）角鲨烷固定液§3172高效液相色谱§3高效液相色谱法的类型三、液液分配色谱3、流动相为防止固定液的流失，可采用以下措施：选择对固定相的溶解度尽可能小的溶剂作流动相。流动相进入色谱柱前，预先用固定液饱和，这种被固定液饱和的流动相再流经色谱柱时就不会溶解固定液了。§3172高效液相色谱§3高效液相色谱法的类型三、液液分配色谱3、流动相为防止固定液的流失，可采用以下措施：使流动相保持低流速经过固定相，并保持色谱柱温恒定。进样时若溶解样品的溶剂对固定液有较大的溶解度，应避免过大的进样量。§3172高效液相色谱§3§3高效液相色谱法的类型（一）正相液液分配色谱中，使用的流动相与液固色谱中使用极性吸附剂时所用的流动相类似。此时流动相主体为已烷、庚烷，可加入20%的极性改性剂，如一氯丁烷、氯仿、二氯甲烷、异丙醚、乙酸乙酯、四氢呋喃、乙醇、甲醇、乙腈、等，这样溶质的容量因子会随改性剂的加入而减小，表明混合溶剂的洗脱强度明显增强。172高效液相色谱§3高效液相色谱法的类型（二）反相液液分配色谱中，，使用的流动相与液固色谱中使用非极性吸附剂时所用的流动相类似。此时流动相主体为水，可加入<20%的极性改性剂，如二甲基亚砜、乙二醇、甲醇、丙酮、对二氧六环、乙醇、四氢呋喃、异丙醇等，溶质在混合溶剂中的容量因子会随改性剂的加入而减小，表明混合溶剂的洗脱强度明显增强。§3172高效液相色谱§3高效液相色谱法的类型四、化学键合相色谱法1、化学键合相化学键合固定相是通过化学反应将有机分子键合在载体表面所形成的柱填充剂，具有稳定、流失小、适于梯度淋洗等特点。§3172高效液相色谱§3高效液相色谱法的类型四、化学键合相色谱法1、化学键合相

ODS(C18)键合相硅胶十八烷基氯硅烷非极性使用pH范围：

2-8§3172高效液相色谱§3高效液相色谱法的类型1）正相键合相色谱法在正相色谱法中，共价结合到载体上的基团都是极性基团，如胺基、氰基、二醇基等。流动相溶剂是与吸附色谱中的流动相很相似的非极性溶剂，如庚烷、已烷及异辛烷等。由于固定相是极性，因此流动溶剂的极性越强，洗脱能力也越强，即极性大的溶剂是强溶剂。§3172高效液相色谱§3高效液相色谱法的类型1）反相键合相色谱法在反相色谱法中，一般采用非极性键合固定相，如硅胶-C18