T-BPMA 25-2024 人体粪便样本中溶藻弧菌检测

BPMADetectionofVibrioalginolyticusinhuI本文件按照GB/T1.1—2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定1人体粪便样本中溶藻弧菌检测仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文GB/T6682分析实验室用水规格和试4设备和材料4.3全自动微生物生化鉴定系统。4.6低温高速离心机：转速≥12000r/min。25.4弧菌显色培养基。从样本盒中挑取黄豆粒大小粪便样本(水样便大约取300μL～500μL),加入到10mL的3%氯化钠碱性蛋白胨水中，充分混匀，36℃±1℃增菌培养8h～1藻弧菌菌落在TCBS琼脂上呈圆形、表面光滑、大而扁平的黄色菌落，直径2mm～33菌落，接种3%氯化钠三糖铁琼脂，先穿刺接种柱状部分，再划线接种观察结果。溶藻弧菌在3%氯化钠三糖铁琼脂中的反应为柱状部分黄色，斜面部分粉色，不产气，不产h～24h后，取纯培养物分别接种含3%氯化钠的甘露醇试验培养基、赖氨酸脱羧酶试验培养基、V-P培培养18h～24h后进行ONPG试验。可选择生化鉴定试剂盒或全自动微生物生化鉴定系注：如选择生化鉴定试剂盒或全自动微生物生化鉴定系统,从3%氯化钠胰蛋白胨大豆琼脂平板上挑取菌落,用生理氧化酶赖氨酸精氨酸鸟氨酸明胶脲酶蔗糖乳糖阿拉伯糖0368V.alginolyticus++-++-+++---++--++++++-++V-+-V-+++--+++-++-++--+-++-+V+-++--++-++-V++---+++++---++-++--+----+++++---+-+-+--V++-++++-++V-+-+-+---+--++++-+++-4氧化酶赖氨酸精氨酸鸟氨酸明胶脲酶蔗糖乳糖阿拉伯糖0368-++-+-+V+---+++-++V-+---------++---++--注表示阳性表示阴性；nd表示未试验；V表示可变。模板)用于实时荧光PCR检测。若不能及时检测，将上HEX－CACAAATTGCTCGTTCCACTGCCCACC－菌株核酸或含有目的DNA片段的质粒DNA；阴性对照模板为不含溶藻弧菌的DNA，空白对照模板为无菌超纯水。若选用商品化溶藻弧菌荧光PCR检测试剂盒，则依据试剂5型的S型，则判定该菌落检测结果为溶藻弧菌阳性；35＜Ct值≤40，需重复试验，如重复试验后Ct判断为阴性。若选用商品化溶藻弧菌荧光PCR检测试剂6.5.3基质辅助激光解吸飞行时间质谱（matrix-assistedlaserdesorption/ionizationtime-of-flightmass选择线性操作模式，正离子模式，质谱扫描范围：2000Da-20000Da；激光点击数：每图谱40次(6次激光累积)；激光频率：60.0Hz；始质谱数据采集。数据采集完成后，将经过处理的质谱数据自动/手动导入本地微生物指纹图谱库并鉴MALDI-TOFMS鉴定结果给出指纹图谱数据库中与鉴定菌种最为匹配的10个菌株种属，并给出相根据6.5.1或6.5.2或6.5.3的鉴定结果，报告样本中检出或未检出溶藻弧菌。有一个可疑菌6A.1Cary-Blair运送培养基A.1.1成分A.1.2制法A.2.1成分A.2.2制法A.3硫代硫酸盐-柠檬酸盐-胆盐-蔗糖（TCA.3.1成分7A.3.2制法A.43%氯化钠胰蛋白胨大豆琼脂A.4.1A.4.2A.5革兰氏染色液A.5.1结晶紫染色液8A.5.1.1成分95％乙醇20.0mLA.5.1.2制法A.5.2革兰氏碘液A.5.2.1成分碘化钾2.0gA.5.2.2制法A.5.3沙黄复染液A.5.3.1成分A.5.3.2制法A.5.4染色法9A.6氧化酶试剂A.6.1成分A.6.2制法A.6.3试验方法A.73%氯化钠三糖铁琼脂A.7.1A.7.2制法A.8嗜盐性试验培养基A.8.1成分A.8.2制法A.93％氯化钠甘露醇试验培养基A.9.2制法A.10.1成分A.10.2制法A.10.3试验方法A.113％氯化钠V-P培养基A.11.1成分A.11.2制法A.13.1缓冲液A.13.1.1成分A.13.1.2制法A.13.2.1成分A.13.2.2制法A.13.3试验方法A.14.1.1成分A.14.1.2制法A.14.2