DB21T 2734.1-2017 病菌PCR 分型诊断方法 第1部分：大肠杆菌PCR 检测方法　　

DB21DB21/T2734.1—2017病菌PCR分型诊断方法MethodofPCRtypingdiagnosisforbacterialPart1：MethodofPCRdetectionforEscherichiacoli2017-02-23发布2017-03-23实施辽宁省质量技术监督局发布IDB21/T2734.1—2017 1 1 1 1 1 1 2 2 2 2 2 2 2 2 3 3 3 3 3 3 4 4 4 5 5A.1.10.5mol/L乙二铵四乙酸二钠（EDTA）溶 5A.1.2TAE(三羟甲基氨基甲烷一乙酸) 5 5DB21/T2734.1—2017本标准起草单位：辽宁省动物疫病预防控制中心、本标准主要起草人：赵凤菊、赵晓彤、关淼、关乃鹏、李蓉、陈瑶、张雅为、魏澍、李冰、高慎1DB21/T2734.1—2017本标准中的试验操作应在生物安全Ⅱ级（BSL-2）件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用GB16548-2006病害动物和病害动物产品生物安SN/T2025-2007动物检疫实验室生物安GB/T555-2002动物产品中大肠菌群、粪大肠菌群和大肠杆菌的检测E.coli：大肠杆菌（Escherichiacoli）PCR：聚合酶链式反应（polymerasechainreactidNTP：脱氧核糖核苷三磷酸（Deoxy-riTaq酶：TaqDNA聚合酶（TaqDNApolymerasTAE：三羟甲基氨基甲烷-乙酸电泳缓冲液（Trisacetate-EDTAbuf点，通过变性、退火和延伸，体外复制出与母链5仪器和器材2DB21/T2734.1—2017微量移液器和吸头等。6.2无水乙醇：-20℃预冷。6.375%乙醇：用无水乙醇和灭菌双蒸水配制，-上游引物序列为5’-GCCTCGCCTGGAGAATGA-3’下游引物序列为5’-CCTGAGACTGCGGTGGAA-3’6.8阳性对照：E.coliATCC26.10TAE：三羟甲基氨基甲烷-乙酸电泳7.1样品的采集、前处理、存放与运输采样及样品前处理过程中应戴一次性手套，样采取病死或剖杀动物主要脏器（肝脏、脾脏、肺脏）装入灭菌15mL离心管中，编号，送实验称取1g病料进行研磨，然后加入1mL无菌生理盐水，混匀，3000rpm离心20min，取上清液转入1.5mL离心管中编号备用。7.1.4内容物的采集与前处理采取病死或剖杀动物的小肠内容物，装入15mL灭菌离心管中，按1﹕5倍体积加入无菌生理盐水，混匀，3000rpm离心20min，取上清液转入1.5mL离心管中编号备用。3DB21/T2734.1—20177.1.5粪便的采集与前处理用药匙无菌采取发病动物新鲜粪便，装入15mL灭菌离心管中，按1﹕5倍体积加入无菌生理盐水，混匀，3000rpm离心20min，取上清液转入1.5mL离心管中编号备用。7.1.6血液无菌采集心血，按1﹕1倍体积加入无菌生理盐水，混匀，转入1.5mL灭菌离心管中编号备7.1.7大肠杆菌纯培养物挑取37℃18～24h培养的典型菌落，用1mL无菌生理盐水制备成一定浓度的菌悬液。然后转入1.5mL灭菌离心管中编号备用，待检。采集或处理的样品在2～8℃条件下保存应不超过24h；若需长期保存，应放置-70℃冰箱，但应避免反复冻融(冻融不超过3次)。采集的样品密封后，采用保温壶或保温桶加冰密封，在6~8h之内运送到实验室。按照《兽医实验室生物安全技术管理规范》进行样品的生物安全标识。7.2PCR检测7.2.1.1取n个灭菌的1.5mL离心管，其中n为待检样品数+阳性对照7.2.1.3取与7.2.1.1中相同数量灭菌的1.5mL离心管，吸取900μL上清液转移至相应的管7.2.1.44℃12000g离心5min，弃上清，倒置于吸水纸上，沾干液体，加入1mL75%乙7.2.1.54℃12000g离心5min，弃上清，倒置于吸水纸上，沾干液体。如此洗2次。7.2.1.64000g离心10s，用微量加样器小心将残余液体吸干，室温干燥3～10min。7.2.1.7加入20μL经高压处理的水，轻柔混匀，溶解管壁上的DNA，冰上保存备用；若需长期保存应放置-70℃冰箱。建立25μL反应体系，按下列组分加入PCR专用离心管中：灭菌蒸馏水10×PCRBuffer2.5mmol/LdNTPExTaqDNA聚合酶上游特异性PCR引物下游特异性PCR引物4DB21/T2734.1—201794℃预变性5min；94℃变性45s，56℃退火45s，72℃延伸50s，35个循环；72℃终延伸10min将PCR扩增产物6μL与1μL上样缓冲液混合，点样于1%琼脂糖凝胶（含0.5μg/mL溴化乙锭）板点样孔中，琼脂糖凝胶板一侧点样孔加入DL2000DNAMarker（分子质量标准物），缓冲液为1×TAE，以5V/cm电压电泳25min。8试验成立的条件当阳性对照出现272bp扩增条带，阴性对照未出现目的条带时，试验成立，否则试验无效。9结果判定紫外凝胶成像仪下观察结果，试验条件成立时，实验结果可作为判定依据。如被检样品出现272bp扩增条带，则可初步判断为E.coli核酸阳性，初步判断为阳性结果的样品可结合流行病学特征、临床症状、剖检变化、生化特性或核酸序列测定进行确认。如被检样品未出现272bp扩增条带的样品判为E.coli核酸阴性。5DB21/T2734.1—2017 A.1.10.5mol/L乙二铵四乙酸二钠（EDTA）溶液（pH8.A.1.2TAE(三羟甲基氨基甲烷一乙酸)电泳缓冲液(5调pH至8.0