DB21T 2533-2015 赤羽病病毒荧光PCR检测方法　

DB21DB21/T2533—2015赤羽病病毒荧光PCR检测方法Methodofthereal-timeRT-PC2015-10-15发布辽宁省质量技术监督局发布I本标准按照GB/T1.1-2009给出的规则起草。1件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用GB/T6682分析实验室用水规格和试验DEPC：焦碳酸乙二酯（DiethylTaq酶：TaqDNA聚合酶（TaqDNApolymerase）RNA：核糖核酸（RibonucleicAci实时荧光PCR：荧光逆转录聚合酶链反应（RealTimeFluorescentQuantitativeReverseTranscriptionPolymeraseChainReacti采用TaqMan方法，比对赤羽病病毒基因组S基因的核苷酸序列，设计特异性引物和特异性的荧光双标记探针进行配对。探针5'端标记FAM荧光素为报告荧光基团（用R表示），3荧光信号；而反应进行到延伸阶段时，Taq酶的5'到3'的外切核酸酶功能将探针降解。这样探针上的R基团游离出来，所发出的荧光不再为Q所吸收而被检测仪所接收。随着PCR反应的循环进行，PCR产物与5试剂和材料除非另有说明，本方法所用试剂均为分析纯，水为GB/T6682规定的一级水；所有试剂均用无RNA5.1试剂25.1.20.01mol/LPBS（见附录A.5.1.4三氯甲烷。5.1.6异丙醇（-20℃预冷）。（见附录A.5）,2.5mmol/LMgCl2（见附录A.6）5.1.8dNTPMixture(各10mM)、EX-Taq酶(5U/μL)。5.1.9引物：合成一对特异性引物：上游引物5'-CCCCTGCTTCCTCATGAAGTTGACATCCAT-3'，TaqMan探针（FAM）5'-ACCCACTGGTTATCGACATGCACCG5.2仪器与耗材5.2.3微量移液器：0.5μL～10μL，5μL～20μL，20μL～5.2.4混匀器。5.2.7微量可调移液器。5.2.8离心管。5.2.10离心管5.2.11微量带芯吸嘴（10μL6生物安全要求将水相转移到新管中，加入500μl异丙醇(-20℃3颠倒洗涤。于4℃条件下，12000r/min离心15min。取出Eppendorf管，轻轻倒去上，吸干液体，不同样品应在吸水纸不同地方吸干。每管加入20μl灭菌DEPC水上的RNA，2000r/min离心5s，冰上保存备用。提取的RNA应在2h内进行RT-PCR扩增立即进行PCR扩增或-20℃保存备用。——第三阶段，95℃30s、60℃1min，8结果判定8.2.3如阴性对照和阳性对照条件不满足以上条件，此实验视Ct值≤30，且出现特定的扩增曲线，表示样品中存在赤羽4A.1DEPC水A液(0.2mol/LNaH2PO4溶液)：称取一水合磷酸二氢钠(NaH2PO4·H20)27.6g,或二水合磷酸二氢钠2PO420)31.2g，溶于蒸馏水中，定容至1L。称取17g氯化钠，用适量蒸馏水溶解，量取13mLA液和87mLB液，混合，用蒸馏水定容至2L。采用A.375％乙醇溶液量取75ml无水乙醇溶液，加入双蒸水中，充分混匀，定容至100A.450mmol/L氯化钾（50mmol/LK