中药生物活性测定的指导原则解读

前言基本原则方法学验证基本内容中药生物活性测定的指导原则解读前言成分复杂多变活性成分多药效成分不明确毒性成分不明确给质量控制带来了很大的挑战！现代分析手段的大量应用中药质量控制水平有了巨大的飞跃中药特点尽管中药质量控制水平发展很快,但仍存在一些共性问题:含量高、容易控制的成分未必是药效成分含量过低的药效成分又不能保证与临床有效剂量之间的关联性用以控制和评价中药质量不够理想中药生物活性测定的指导原则解读前言2010版《中国药典》修订时增加了《中药生物活性测定指导原则》2010版药典一部附录XⅧC中药生物活性测定指导原则2015版药典修订时将上版药典附录整合为通则，并与药用辅料单独成卷作为四部9000指导原则9105中药生物活性测定指导原则中药生物活性测定的指导原则解读前言生物活性测定法：是以药物的生物效应为基础，以生物统计为工具，运用特定的实验设计，测定药物有效性的一种方法，从而达到控制药品质量的作用。规范中药生物活性测定研究，为该类实验设计、方法学建立等过程和测定方法的适用范围提供指导性的原则要求。本指导原则目的药材来源广泛、多变，制备工艺复杂，使得中药制剂的质量控制相对困难。多种活性成分和具有多种药理作用，仅仅控制少数成分不能完全控制其质量和反映临床疗效。中药中药生物活性测定的指导原则解读基本原则1.符合药理学研究的基本原则随机Randomization对照Control重复Replication具备简单、精确的特点，应有明确的判断标准分组或抽样时指按照机遇的原则进行，使各受试对象被分配到各组的机会均等，而不受主观因素的影响。随机化的方法有抽签法、抛硬币法、随机数字表等。设置对照，排除非实验因素的影响，消除实验误差，保证实验结果的可比性和实验结论的正确性。正常对照、模型对照、阳性对照、溶剂对照。重复是指在相同实验条件下进行多次研究或多次观察。重复原则包括两个含义：①是实验必须有足够的样本数或例数，在一次实验中有充分的重复；②是要使实验结果可靠，必须多次重复实验。也就是说，实验要有一定的次数。中药生物活性测定的指导原则解读基本原则2.体现中医的特点鼓励应用生物活性测定方法探索中药质量控制，拟建立的方法的测定指标应与该中药的“功能与主治”相一致。可参考的药效学实验模型：(1)治疗心肌缺血实验：垂体后叶致大鼠心肌缺血实验、小鼠耐缺氧实验；(2)解热、镇痛实验：角叉菜胶或细菌内毒素解热实验、小鼠扭体实验；(3)止咳平喘实验：氨水刺激实验、离体豚鼠气管实验；(4)抗炎解毒实验：小鼠耳肿胀实验、毛细血管通透性实验、抑菌实验；(5)活血化瘀实验：血小板聚集实验、耳廓微循环实验。中药生物活性测定的指导原则解读基本原则3.品种选择合理4.方法科学可靠优先选用生物效价测定法，不能建立生物效价测定的品种可考虑采用生物活性限值测定法，待条件成熟后可进一步研究采用生物效价测定法。详见四部1431生物检定统计法拟开展生物活性测定研究的中药材或中成药应功能主治明确，其中，优先考虑治疗适应症明确单一的中药注射剂品种，对急重症用药、保护品种应重点进行研究。中药生物活性测定的指导原则解读基本内容1.实验条件实验系括整体动物、离体器官、血清、微生物和组织、细胞、亚细胞器、受体、离子通道和酶等。灯盏花素注射液采用整体动物进行生物活性测定缩宫素采用大鼠离体子宫平滑肌进行生物活性测定水蛭用凝血酶进行生物活性测定应选择背景资料清楚、影响因素少、检测指标灵敏和成本低廉的试验系统。应尽可能研究各种因素对试验系的影响，采取必要的措施对影响因素进行控制。试验系的选择中药生物活性测定的指导原则解读基本内容实验动物如采用实验动物，尽可能使用小鼠和大鼠等来源多，成本低的实验动物，并说明其种属、品系、性别和年龄。应遵循3R原则：“优化、减少、替代”Refinement&Reduction&ReplacementRefinement（优化）通过改进条件，善待动物，提高动物福利，或完善实验程序和改进实验技术，避免或减轻给动物造成的与实验目的无关的疼痛和紧张不安的科学方法。Reduction（减少）指在科学研究中，使用较少量的动物获取同样多的试验数据或使用一定数量的地动物能获得更多实验数据的科学方法。Replacement（替代）指使用其他方法而不用动物所进行的试验，以达到某一试验目的。或是使用没有知觉的试验材料代替以往使用神志清醒的活的脊椎动物进行试验中药生物活性测定的指导原则解读基本内容适用于需大量动物的实验，如某些药物的筛选，半数致死量的测定。也较适用于避孕、抗炎镇痛、中枢神经系统、抗肿瘤及抗衰老等药物的实验。小鼠比较适用于抗炎、血压测定、利胆、利尿等药物实验，也可用于进行亚急性和慢性毒性实验。大鼠因其对组胺敏感，并易于致敏，故常用于抗过敏、平喘和抗组胺等药物实验。又因它对结核敏感，也用于抗结核病药的实验。豚鼠近交系：BALB/c、C57BL;远交系：KM、ICR小鼠；突变系：裸鼠SD、Wistar大鼠中药生物活性测定的指导原则解读基本内容供试品选择应选择工艺稳定，质量合格的供试品。若为饮片，应基源清楚。应至少使用三批供试品生物效价测定法：首选中药标准品，也可以考虑化学药作为标准品生物活性限值测定法：可采用中药成分或化学药品作为方法可靠性验证用对照品。标准品或对照品采用标准品或对照品均应有理论依据和/或实验依据。国家标准中采用的标准品或对照品的使用应符合国家有关规定要求。中药生物活性测定的指导原则解读基本内容2.实验设计设计原理所选实验方法的原理应明确，所选择的检测指标应客观、专属性强，能够体现供试品的功能与主治或药理作用。生物效价测定法：按生物检定统计法（通则1431）的要求进行实验设计研究；生物活性限值测定法：试验设计可考虑设供试品组、阴性对照组或阳性对照组，测定方法需建立动物模型时，应考虑设置模型对照组。重现性好的试验，也可以不设或仅在复试时设阳性对照组。设计类型中药生物活性测定的指导原则解读基本内容生物效价测定法：供试品和标准品均采用多剂量组试验，并按生物检定的要求进行合理的剂量设计，使不同剂量之间的生物效应有显著性差异；生物活性限值测定法：建议只设一个限值剂量，限值剂量应以产生生物效应为宜；剂量设计给药途径：一般应与临床用药途径一致。如采用不同的给药途径，应说明理由。给药次数：根据药效学研究合理设计给药次数，可采用多次或单次给药。指标选择：应客观、明确，与“功能主治”基本一致。其他中药生物活性测定的指导原则解读基本内容3.结果与统计生物效价测定法：应符合生物检定统计法（通则1431）的要求，根据样品测定结果的变异性决定效价范围和可信限率（FL％）限值；生物活性限值测定法：应对误差控制进行说明，明确试验成立的判定依据，对结果进行定量和/或定性统计学分析，并说明具体的统计方法和选择依据。4.判断标准生物效价测定法：应按品种的效价范围和可信限率（FL％）限值进行结果判断。生物活性限值测定法：应在规定的限值剂量下判定结果，初试结果有统计学意义者，可判定为符合规定；初试结果没有统计学意义者，可增加样本数进行一次复试，复试时应增设阳性对照组，复试结果有统计学意义，判定为符合规定，否则为不符合规定。中药生物活性测定的指导原则解读方法学验证1.测定方法影响因素考察应考察测定方法的各种影响因素，通过考察确定最佳的试验条件，以保证试验方法的专属性和准确性。根据对影响因素考察结果，规定方法的误差控制限值或对统计有效性进行说明。2.精密度考察重复性按确定的测定方法，用3批供试品、每批3次或同批供试品进行6次测定试验后对结果进行评价。生物活性测定试验结果判断应基本一致。中间精密度考察实验室内部条件改变（如不同人员、不同仪器、不同工作日和实验时间）对测定结果的影响，至少应对同实验室改变人员进行考察。重现性生物活性测定试验结果必须在3家以上实验室能够重现。3.方法适用性考察按拟采用的生物活性测定方法和剂量对10批以上该产品进行测定，以积累数据，考察质量标准中该测定项目的适用性。中药生物活性测定的指导原则解读例：舒血宁注射液体外抑制血小板聚集的生物活性测定法药材选择：舒血宁注射液功能主治：扩张血管，改善微循环。方法：生物效价测定法模型选择：血小板聚集抑制模型动物：家兔供试品：

舒血宁注射液(5mL/支)对照品：金纳多注射液(5mL/支)试验方法：家兔颈总动脉放血75mL，加3.8％枸橼酸纳(1:9)抗凝，1000r/min离心10min制备富血小板血浆(PRP)，剩余血样继续3500r/min离心10min制备贫血小板血浆(PPP)。用血液分析仪测定PPP和PRP中的血小板数，利用PPP调节PRP中的血小板数在4.0～4.5×1012个/L之间。取PPP210μL加入测试杯，进行仪器调零。再取PRP80μL，分别加入不同质量分数的样品液20μL，37℃孵育180s，分别加入聚集诱导剂（ADP、PAF）10μL，测定5min内的最大聚集率。※中药注射液※※功能主治明确※两者原料均为银杏叶提取物中药生物活性测定的指导原则解读量效关系考察：取金纳多注射液，用0.9％的生理盐水分别配制成梯度为85％、72％、61％、52％、44％的样品液各1mL，作为对照品。取舒血宁注射液1支，用0.9％的生理盐水分别配制成梯度为85％、72％、61％、52％、44％的样品液各1mL，为供试品。按实验方法分别测定含药血浆的血小板最大聚集率。效价测定及可靠性考察：取金纳多注射液，同法配置成含注射液100％(原液)、85%、72%的稀释液，作为对照品组(S)；取舒血宁注射液，同法配置成含注射液100％(原液)、85%、72%的稀释液，作为供试品组(T)。按照S1、Tl、T2、S2、S3、T3的顺序(排除因S组和T组测定的先后次序引起的误差)，平行测定3次。按《中国药典》生物检定统计法中量反应平行线三三法进行统计学处理，考察结果的可靠性，计算T组的效价(PT)和可信限率(FL％)。中药生物活性测定的指导原则解读效价测定结果：由于金纳多注射液在药典中尚无效价的规定，因此假设对照品(s)金纳多注射液的效价为100u/mL，由于舒血宁注射液与金纳多注射液成分相同，且基本成分的含有量也相同，如果舒血宁注射液抑制血小板聚集的效果与金纳多相同，则其测得效价也应为100u/mL，结果见表1。表1舒血宁注射液由ADP、PAF诱导的测得效价与可信限率中药生物活性测定的指导原则解读可靠性考察结果：表2，表3为两种测定方法的可靠性检验结果，结果显示两种诱导剂诱导的血小板聚集可靠性检验均合格，