（生物科技行业）第二章发酵过程的生物学基础

的种类、形态及生理特征的目的在于认识微生物的特性，掌握其生命活动规律，使其在工业生产中充分发挥作用。的生成。工业上用的全部微生物都称为工业微生物。此外仍要和杂菌污染打交道，杂母菌和霉菌。由于发酵工程本身的发展以及基因工程正在进入发酵过程，病毒、的主要微生物类群。1，枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)枯草芽孢杆菌为生孢孢的需氧菌。营养细胞杆状，大小壹般为0.7~0.8×菌才行。它能在铵盐液体中发酵各种糖类生成酸。茵，如在酱油、酱类和白酒制曲时，如果水分草杆菌迅速繁殖。这不但消耗原料蛋白质和淀曲子发钻和异臭，使制曲失败。经科研获得的枯草芽泡杆菌用于生产中性蛋白酶却发酵生产酱油、食醋。及饴糖时就可采用2，大肠杆菌(Escherihiacoli)氏染色阴性。能运动或不运动，运动者周生鞭毛。大肠杆菌发酵葡萄糖和乳糖，产酸、产气。大肠杆菌的谷氨酸脱羧酶在工业氨酸等。在医药方面和基因工程方面，大肠杆菌是很好的研究材料。3，乳酸杆菌(Lactobacillus)培养基内略带浑浊。由于乳酸菌能产生乳酸，所以可用于食品的保存和调整食品的风味。在油酿造过程中，它也起到了良好的作用。在葡萄糖琼脂上形成圆形紧密隆起的菌落，多种糖类，包括淀粉、糊精等。生产上多用来生产丙酮丁醇。发酵适温30~32℃,生长适温37℃,最适链。革兰氏染色阳性，菌落小，灰白，隆起，不液化明胶。能同化多种糖产酸、工，故为糖厂之害菌。但它却是葡聚据的生产茵。壹种是周生鞭毛，另壹种是端生鞭毛。不形成芽抱。3l℃,有些阴性反应者。菌体内着色不均匀，好氧或厌氧。需的生长因素，硫胺素或某些氨基酸有促进生长的作用。能利用葡萄糖、果糖、培养基中，能大量积累L-谷氨酸。8，短杆菌(Brivibacterium)酸，不发酵乳糖。大多数液化明胶，仍原石蕊。此属菌有谷氨酸发酵能力，在利用糖质原料的谷氨酸发酵中，需要生物素作(Brivibacteriumflavum)和硫殖短秆菌(Brivibacteriumthiogenitalis)能用于谷氨酸发酵生产。色素。发酵生产黄原胶。放线茵有以下见种：占各种微生物(包括放线菌)所产抗生素的50％之上。(1)灰色链霉菌(Streptomycesgriseus)在葡萄糖—硝酸盐培养基上生长时，菌落称土霉索)。菌丝白色，呈树枝状；孢子为灰白色，呈拄形；菌落为灰白色，其表面后期有皱褶，呈龟裂状。(3)金霉素链霉菌(Streptomycesaureofaci则由棕灰色转变为灰黑色。因该菌所产生的抗(4)红霉素链霉菌(Streptomyceserythreus)此菌生长扩展，有不同规则的边缘，有分技。最适温度25℃,产生红霉素。菌落常为黄橙色、红色、深褐色、黑色和蓝色。3，游动放线菌属(Actinoplanes)卷或呈直行排列，成熟后分散为不规则排列。孢子呈球子。4，诺卡氏菌属(Norcardia)基丝较链霉菌纤细，0.2~0.6μm，有横隔，壹般无分布于土壤中。有些种能产生抗生素(如利福霉素、蚁蜡及污水净化中脱氰等。抱囊孢子无鞭毛，气丝的孢子丝盘卷成球形孢囊。其孢囊有俩层壁，外壁较细菌、病毒和肿瘤的多霉素等。我国生产的创新霉素由济南游动放线菌新菌(Actinoplanestsinanensisn.sp)产生。米苏里游动放线菌(Actinoplanesmissouriensis)能以木糖为诱导物，大量生产葡萄糖异构酶。近年来不仅从放线菌中发现壹些医药上使用的抗生素新品种，而且仍进壹步啤酒酵母是酵母属中应用较广泛的壹个种。根据啤酒酵母细胞长和宽的比例，可把它们分为三组：第壹组酵母的细胞多糖蜜生产酒精用。在麦芽汁琼脂培养基上，菌落为白色，有光泽、乎坦、边缘整齐。在液体培母称为上面酵母；把易于凝集沉淀，发酵度较低的酵母称为下面酵母。啤酒酵母的无性繁殖为芽殖，有性繁殖能形成子囊孢子。壹般每个子囊内含啤酒酵母能发酵葡萄糖、蔗糖、麦芽糖及半乳糖，不能发酵乳糖及蜜二糖。啤酒酵母的应用范围十分广泛，常用于传统的发酵行业，如啤酒、白酒、果(SCP)可作食用、药用和饲料用酵母。它的转化酶可用于转化蔗糖，制造酒心巧素、肌醇等的含量。脂培养基上菌落为乳白色，平滑、有光泽、边缘整齐。滑。此菌发酵能力甚强，在液体培养中常出现混浊现象。葡萄汁酵母和酿酒酵母相似。主要的区别在于它能发酵棉子糖和蜜二糖。葡或作饲料。此属酵母营养细胞的形态多样，为圆形、椭圆形、卵圆形、腊肠形不等。多边芽殖。有的种类能形成假菌丝。半圆形，表面光滑。落平坦，呈乳白色、无光泽，边缘丝状。在麦芽汁中培养后，波面有白色菌璞，或弱发酵或不发酸。能同化硝酸盐，氧化烃类能力亦强，能利用煤油作碳源。此属酵母多能产生乙酸乙酯，从而增加产品香味，可用于酿酒和食品工业。生产的有害菌。4，球拟酵母(Toruiopsis)球拟酵母的细胞为球形、卵形成略长。多边出芽繁殖。在麦芽汁斜面上菌落为乳白色，表面皱褶，无光泽，边缘整齐或不整齐。在液体培养基中有沉渣及酵母环出现，有时亦能产生菌璞。此属酵母有壹定的经济意义，有些种能产生不同比例的甘油、赤鲜醇、此属菌酒精发酵能力较弱，能产生乙酸乙酯(因菌种而异)，增加白酒和酱油细胞圆形、卵形或长形。多边出芽繁殖。能形成假菌丝。在麦芽汁琼脂培养能发酵葡萄糖、蔗糖、棉子糖。不能发酵麦芽糖、半乳糖、乳糖、蜜二糖。不分解脂肪。能同化硝酸盐。氮源，在培养基中不加其它因子即可生长。它能利用造纸工业中的亚硫酸废液，假丝酵母也是脂肪酶的生产菌种，在工业上可用于绢纺原料的脱脂。6，毕赤氏酵母(Pichia)芽汁中培养，培养液表面有白而皱的粗糙的菌璞，底内有菌体沉淀。此菌分解糖的能力弱，不产生酒精。能氧化酒精，能耐高或较高浓度酒精。母。细胞圆形、卵形或长形。多边芽殖，有明显的红色或黄色色素。很多种因由荚膜而形成粘质状菌落。本属中有较好产脂肪的菌种，可由菌体提取大量脂肪。α—丙氨酸和谷氨酸，产蛋氨酸的能力也狠强，可达干生物量的1％。能够代替所有碳源培养该菌。且生长良好；棉病囊霉能危害许多重要的经济作物，如棉花、柑桔、蕃茄等。最早是从染因此它是核黄素生产的重要菌种。白地霉是地霉属中常见的壹个种。裂殖。节孢子单个或连接成链，长筒形、富的蛋白质、脂肪、维生素和大量的核酸。它具有适应性强、生长快、产量大、培养方法简单等特点。在废料废水的综合利用上很有价值。在制曲接影响出酒率，所以它是白酒生产中的有害菌。的根霉、毛霉、犁头霉；子囊菌纲的红曲霉；半知茵类的曲霉、青霉等。速。幼龄菌落为白色，棉絮状。中期为灰黑色。老熟后菌丝丛中密布黑色小点，横隔，为单细胞真菌。在培养基上生长时，由营养菌丝体产生弧形生长的匍匐菌丝，向四周蔓延。囊壁破裂，释放出孢子。的温度较高，因而适于在高温季节使用。根霉。(1)米根霉(Rhizopusoryzae)米根霉的最适温度37℃,41℃时仍能生长。米根霉的淀粉酶活力极强，多作糖化菌使用。也具有酒精发酵能力及蛋白质分解能力。便条件，解决了豆腐乳旧法生产只能在冬季进行的困难。(2)华根霉(Rhizopuschinentis)华根霉的最适温度为30℃。当发酵温度达45℃和豆腐乳生产中的主要菌种。毛霉分布亦较广，在基质表面生成灰色、白色或黄褐色的棉絮状菌落。菌丝轴状分枝三种类型。毛霉多见于阴湿低温处，是制曲时常见的杂菌和可利用的菌，其中常见的有总状毛霉(Mucorracemosus)，我国著名的四川豆鼓即用此菌制成；高大毛霉可见到。它能产生脂肪酸、琥珀酸，对甾族化合物也有转化作用。犁头霉的菌丝和根霉很相似，但犁头霉产生弓形的匍匐菌丝，且在弓形的匍且常呈轮状或不规则的分枝。孢子囊顶生，多呈梨形。囊轴呈锥形、近球形等。孢子小而呈单孢。大多无色，无线状条纹。接合—孢子生于匍匐犁头霉分布在土壤、粪便和酒曲中，空气中也有它们的存在。常为生产的污染菌，其中有的是人畜的病原菌。转化多种甾体。4，曲霉(Aspergillus)曲霉菌丝有横隔，菌丝体由多细胞菌丝所组成。营养菌丝匍匐生长于培养基表层。匍匐菌丝能够分化出厚壁的足细胞。在足细胞上生出直立的分生孢子梗，生袍子。分生袍子具有各种形状、颜色和纹饰。几千年来我国民间就用曲霉酿酒、制酱、制醋等，应用十分广泛。（1）米曲霉(Aspergillusoryzae)米曲霉有较强的蛋白被作为糖化菌。此外，它仍是重要的蛋白酶和淀粉酶的生产菌。黄曲霉中有些菌能产生黄曲霉毒素，引起家畜家禽中毒，以至死亡。这种黄现红色，而黄曲霉则无此反应。(3)黑曲霉（Aspergillusniger）黑曲霉具有多种活性强大的酶系，如淀粉檬酸和葡萄糖酸的重要菌种。黑曲霉群中仍包括有乌沙米曲霉(又名字佐美曲霉)、厂所广泛采用。(4)栖土曲霉(Aspergillusterricola)培养温度为32~34℃,含有较丰富的蛋5，青霉(Penicillium)无顶囊。分生孢子梗经过多次分枝，产生几轮对称或不对称的小梗，形如扫小梗顶端产生成串的分生孢子。分生孢子壹般为蓝绿色或素和酶制剂等。(1)产黄青霉(Penicilliumchrysogenum)产黄青霉能产生多种酶类及有机酸。在工业生产上主要用其变种来生产青霉素，酸、柠檬酸和抗坏血酸等。(2)桔青霉(Penicilliumcitrinum)桔青霉可产脂肪酶、葡萄糖氧化酶和凝乳酶，有的菌系能产生5’—磷酸二酯酶，可用来分解核酸，生产5’—核苷酸。霉素。圆形、倒卵形等。壁光滑或粗糙，透明或亮绿色。壹定危害。呈紫红色。茵落背面也有同样的颜色。消食活血、健脾胃的功、能。近年来，紫红曲霉仍被用来生产糖化酶等酶制剂。胺抗生素，毒性极低，其衍生物称为先锋霉素。中(如菌丝体)，如果细胞数目增加的同时且不伴有个体只能称为生长。只有形成有性或无性抱子的过程才能称为繁殖。丝断裂而使群体数目和质量的增加过程称为群体生长。体的生长作为单细胞微生物生长的指标。果，因此细胞生长的中心问题，是组成细胞的各种大分子化合物是如何合成的?又是如何组建成多种细胞结构和细胞器的？近年来关于大分子化合物的生物合成已有了比较深入的了解。研究细菌群体生长的传统方法是分批培养法动态过程。般能够将细菌的生长曲线划分为以下几个时期。加速生长期：细菌开始增殖，倍增速率(世代时间的倒数即单位时间内的分裂次数)随时间不断增大(a—b)。数目以几何级数增长(b—c)。稳定期：生长速率和死亡速率相等，倍增速率为零，活菌数目保持恒定(d-e)。加速死亡期：死亡速率超过生长速率，且越来越大，活菌数目迅速减少(e-f)。对数死亡期：死亡速率达到最大值且保持恒定(f-g)。而构成真菌的菌蒋。所以分枝现象也是真菌生长过程中不可缺少的环节。在液体振荡培养(或深层通气培养)中，以菌丝干重作为衡量生长的指标，可获得如下图所示的生长曲线。在静止培养中也可获得类似的生长曲线。丝状真菌的生长过程大致可分为1）生长延滞期2）迅速另壹种是生长已开始但却无法测量。对真菌的生长延滞期孢子。稠密均匀外，大多数细胞都出现大的空泡。生长的停止由以下俩种因素之壹所决定。在高浓度培养基中，可能是因为有在含有机氮高的培养基中可积累氨。多数次成的。在较稀释的、营养物质平衡良好的培化合物的耗尽。当生长停止后，菌丝体的自条件而导。干重以指数(或对数)速度增长。对于细菌这类单细胞生物而言，生长包括细胞分上符合细胞浓度或干重变化规律。t。在对数生长期中，细胞以恒定的速度增长，N表示细胞数目；x表示细胞浓度(或质量)：μ为比例常数，称为比生长速率常数(1／h)。它表示单位菌体在单位时间产生询菌体量(个数或质量)。式（3）表示单位时间里细胞数目的变化(增量)等于比生长速率常数和细胞由于对数生长期中比生长速率μ是个常数，故上式解方程式可得：比生长速率常数μ是微生物生长研究中的—个极为重要的参数用它能够判断微生物的生长情况和估算生长过程某壹时刻的细胞数目或浓度。往往采取除壹种成分(如碳源)限量外其余营养成分均过量供成的办法，这种限量基质。率常数μ随基质浓度增高而增大。可是当基质达到壹定浓度后μ和基质浓度无关。这种生长情况和基质浓度关系的曲线类似于底物浓度μm值的意义在于表示在相同条件下，主要营养成分的各种物质对微生物生Ks的意义表示微生物对各种基质的亲和力。Ks愈小表示亲和力愈大。壹般比生长速率生长。不同程度上要使环境发生变化。环境对微生物的主要作用表现为：适宜的环境，样就能使不同类型的微生物更好地服务于人类。壹定的温度条件。因此，温度对微生物生长具有及其重要的作用。壹般下微生物的生长发育情况，通常把微生物分成高温性、中温性和低温性三类。减弱。在生长温度范围之外，高温和低温条件对微起微生物细胞原生质变性，酶结构破坏和酶越高，死亡率越大。微生物对高温也有壹定抵抗力，在沸水中煮壹小时也不易死亡。在为了彻底杀死包括芽孢在内的壹切微生物。低温条件保藏菌种，以及用冷藏法保藏食物。孢蘑菇在其菌丝生长阶段要求的适温为20—23℃,而在于实体发育阶段则要求使菌体大量失水而引起菌体内代谢活动停止甚至死亡。此在发酵生产中常以孢子或芽孢制备成砂土管菌种得以长期保藏。的渗透压，都将引起微生物细胞的不同反应有状态进行正常的代谢活动，微生物生长发应注意生长环境中的无机盐类以及溶液的浓度，使之具有壹定的渗透压——等甚至使微生物死亡。当微生物生长在低渗透膨涨使细胞发生破裂。因此，在进行微生物水，以防菌体吸水膨胀而破裂。环境中的氧化仍原电位(En)同微生物的生长的关系极为密切，且同氧的分压(通和另壹些有机质的消耗(如半胱氨酸等)，都会引起环境中氧化仍原电位的变化。境，而使兼性菌进行无氧呼吸。这主要是进行有氧呼吸活动中需氧化酶系参予，类为脱氢酶系，它们只需要较低的氧化仍原电位。应提高环境的温度和引起水份的散失而影响微毫微米波长的紫外光，能引起细胞内核酸中的生物诱变育种和表面杀菌。见光下得以修复从而部份地削弱了紫外线的作用。X-射线以及由放射性物质所产生的γ-射线，具有更短的波长。X-射线为杀菌力。内复杂的生化反应能高度有序地进行，且对在代谢繁殖过程中，能量的利用以及对细胞成是非常合理和经济的，需要多少合成多少胞经常处于平衡生长状态，不会有代谢产物过量产生，对细胞能量的利用和细胞组成物乳酸和醋酸的大量形成。通过改变培养条件和遗传特性，使微生物的代谢途径；改变或代谢调节失控而获得某壹发酵产物的二是改变控制代谢速率，即影响基因型的表达。营养物质的吸收。中，而革兰氏阳性菌则将这些水解酶类，分泌于胞外。位于细胞核里。是区域化的，其实质是控制酶和底物接触，使各个反应有序地进行。制的可逆反应和由俩种酶控制的逆单向反应。同壹个酶能够通过不同辅基(或辅酶)控制代谢物的流向。例如，谷氨酸脱氢氨酸的分解。因此微生物能够通过不同的辅基来控制代谢物的流向。繁殖。这样的壹种过程就叫做“诱导作用”或“脱阻遏作用”酶和表异构酶；乳糖可同时诱导产生渗透酶，β-半乳糖苷酶和转乙酰基酶。阻遏物)被认为是同胞内由调节基因编码的蛋白质(阻遏蛋白)结合，产生壹种阻遏酶合成的物质称为阻遏物。根据阻遏物的不同，可将阻遏分成俩类：(或酶系)所催化生成的终点产物。酶系)分解代谢的产物。影响酶活性的因素有：原来活性低的酶提高了活性的现象。产物所促进。抑制。反遗抑制：反馈抑制是指代谢的末端产物对酶(往往是代谢途径中的第壹个酶)活性的抑制。反馈抑制作用在生物体内普通存在，它在维持细胞正常代谢、代谢途径的调节和有分支代谢途径的调节。反应的酶活性有抑制作用。例如，在大肠杆菌中，由苏氨酸(Thr)合成异亮氨酸(IIeu)时，异亮氨酸对催化反应途径中的第壹步反应的苏氨酸脱氨酶(TD)有抑制作用。苏氨酸α-酮丁酸异亮氨酸代谢的反馈调节方式有多种:俩个末端产物都过量时，才能对途径中的第壹个酶有抑制作用。例如，枯草杆菌在芳香族氨基酸合成中，色氨酸(Try)抑制邻氨基苯甲酸合成酶(AS)，苯丙氨酸(Phe)抑制预苯酸脱水酶(PT脱氧庚糖酸合成酶；II：邻氨基苯甲酸合成酶；III：分支酸变位酶；IV：预苯末端产物抑制的壹类酶。其特点是：途径中第壹个反应被俩例如，大肠杆菌以天门冬氨酸为前体合成苏氨酸(Thr)、异亮氨酸(Ileu)、反馈抑制和阻遏；AKIII受赖氨酸的反馈抑制和阻遏。酶抑制作用，如果末端产物单独过量则对途径中的第壹个酶无抑制作用。激酶(AK)是受末端产物赖氨酸和苏氨酸的协同反馈抑制。制。到最大的抑制。超相加反馈抑制超相加反馈抑制是壹种既不同于协同反馈抑制又不同于累种末端产物单独过量时抑制的总和。％，可能分别结合在该酶的不同部位上。（2）酶分子的化学修饰理论(其核心是酶分子结构的改变)。五、次级代谢的调节次级代谢的调节方式有：有以下几种：物就会增加胞外酶的产量。如加入槐糖(1，2—β—D—葡二糖)诱导木霉菌的纤诱导水解酶类生成的方法。应予注意的。在发酵工业中，要选择到壹种廉价、高效的的。迄今尚未见由于结构基因发生改变而得到组成型的报其自发突变，用连续培养方法，也能得到组成型突变株。在平板上识别组成型突变株的方法，主要是末端而能被刚果红所染色。可由此方便地检出纤维素酶产生菌。高分子的多糖类、蛋白质等的分解代谢产物(如能被迅速利用的单糖、氨基酸以及脂肪酸、磷酸盐等)都会阻遏分解其聚合物的水解酶类的生成。因此用限量流合成速率，因此结果往往不稳定。更有效的方法是筛选抗降解物阻遏的突变栋。的过量产生。筛选纤维系酶抗阻遏突变株。但更多地是利用选育结构类似物抗性菌株的方法。物阻遏作用的抗性，而能导致相应酶类的过量生产。正常的分解代谢末端产物更为有效的原因。的愈加清楚，就能定向选育多重突变株，而得到过铵盐所阻遏，筛选抗甲基铵盐的抗性突变株，其蛋白酶合成即不为铵盐所阻遏。如上所述，在生物合成途径中广泛存在着反馈抑制调节——末端产物抑制合成途径(包括分枝途径)中第壹个酶的活力，因此，降低末端产物的浓度就能积累代合成途径中的调节酶，由黄色短杆菌分离到对赖氨酸的类似物(2—氨基半胱氨酸)有抗性的突变株，它对天冬氨酸激酶的反馈抑制不敏感，赖氨酸的产量可达的直线式合成途径中已获得不少成功的实例。得到的瓜氨酸营养缺陷型失去了合成催化鸟氨酸合成瓜氨酸的鸟氨酸转氨甲酰氨酸或瓜氨酸使菌体生长，但又不致引起反馈抑制时(精氨酸抑制N壹乙酰谷氨酸激酶活力)，就能使鸟氨酸大量产生。如选育丧失精氨酸琥珀酸合成酶的精氨酸缺陷型，就能得到瓜氨酸的过量生产。末端产物积累。在分枝途径中则能得到使末端产物过量产生的营养缺陷型突变。联系的(图4-8)，筛选高丝氨酸营养缺陷型后，限量供给苏氨酸时，就能解除由抑制。在限量供给苏氨酸的情况下，即使赖氨酸过剩，抑制作用也很难发生。经诱变产生的高产菌株。在生产过程中易于发生回复突变，使生产不稳定。抗生素防止回复株增殖，也是壹类方法。在无阻遏物或末端代谢产物存在条件下选育果，抗反馈突变株是调节酶的变构中心发生了改变而催化中心未改变。微生物细胞吸收作为代谢所需要的底物和离子是依靠定位在细胞膜上的主动物谢过程时，都有可能造成代谢产物的过量生产。类繁多，性质各异，尚未有规律可循。如加入吐温80可增加里氏木霉纤维素酶产量，但对其它菌株就末得到同样效果。量生产的结果。衣霉素可抑制细胞膜糖蛋白的生成。枯草杆菌的衣霉素抗性突变株的α—淀粉的能力。谷氨酸捧杆菌的抗青霉素突变株的谷氨酸产量亦会增加。得到代谢产物的高产。产量。由于某壹酶蛋白结构改变后，在高温条件下活力丧失的缘故。如此酶为蛋白质、难。筛选在低温下能形成芽孢的温度敏感突变株，就能解决此困难。改变培养条件如温度、供氧量等以控制生长速率，也能获得壹定效果。零，则能在壹较长时间内持续合成纤维素酶且获得高产。生物化学上把底物和抑制剂和酶相结合时呈现的互相排即酶和抑制剂结合后就不能和底物相结合，反之乙酸敏感的突变袜，都达到了提高柠檬酸产量这些突变株的乌头酸酶的活力都比较低。次级代谢产物是指细胞生长不必需的、无明显生理功能的微生物代谢产物。即可生成。而次级代谢产物则需要复杂的营养条件的天然物质时才能形成。在各种条件下，初级代谢往往仅在壹特定培养条件下才能形成，尤其过量生代谢产物壹般都是在菌体生长的峰值出现后才大级代谢产物进入分化期，即次级代谢产物形成的次级代谢产物形成有关的酶类逐渐出现。可是，菌划分及相应的这些生理特性的变化仍取决于谢产物产量的方法有以下几种：在合成途径已基本清楚的条件下，向发酵培加入硝酸盐可提高利福霉索的产量，其原因在于它抑制了脂肪酸的合成，使次级