动物检疫技术

动物检疫技术1第五章动物检验检疫技术第一节检验检疫样品第二节细菌分离及鉴定第三节病毒分离及鉴定第四节其他病毒微生物分离及鉴定第五节寄生虫检查第六节现代生物技术在动物检验检疫中的应用2第一节检验检疫样品一、病料采集和运送1、在采取病料前必须对被检动物可能患有何种疫病作出初步诊断；2、采取病料所用的容器、手术器械均应灭菌后才能使用，采样时应无菌操作；3、解剖前检查（只有在确定不是炭疽后，方可剖解）；4、取材时间要早（死后6h内）；5、应根据不同的疫病相应的采取脏器或内容物；若无法估计是某种疫病，可全面的采取。（脓汁、血液、皮肤、骨头、脑、脊髓等）3小白鼠：3周龄，体重6—8克。为达到细菌分离及鉴定的目的，运用细菌基本结构：细胞壁、细胞膜、细胞质和核质。红细胞凝集极凝集抑制试验常用于测定病毒的含量及病毒的鉴定等。（脓汁、血液、皮肤、骨头、脑、脊髓等）菌体形态呈高度多形性，有球状、杆状、环状、丝状等。通过机械解离或消化等方法将组织或细胞从机体取出，分散成单个细胞，给予必要的生长条件，模拟体内生长环境，使其在体外能继续生长繁殖，称为细胞培养。在明胶穿刺培养中的生长3、凡是能在细胞培养物中产生细胞死亡破裂现象（CPE）的病毒都可采用蚀斑技术来分离和测定。某些病毒（A型流感病毒、鸡新城域病毒等）由于具有血凝素，可以使鸡或其他一些动物的红细胞发生凝集。填写3份，一份存根，两份寄送检验室；1、将病毒各稀释度种入单层细胞瓶，吸附1小时后，在单层细胞上复以营养琼脂培养基，病毒在细胞中繁殖使细胞死亡。由于大多数病毒对热不稳定，应该立即接种，如果不能及时接种或需保存，一般置50％甘油盐水4℃或一20℃以下保存。三、病料的记录、包装和运送方法在pH3溶液中经30min能降低某些病毒的感染力如口蹄疫病毒，而对另一些病毒如猪水疱病毒等没有作用。二、病料的保存（一）细菌检验材料的保存脏器组织块→保存于饱和氯化钠溶液或30%甘油缓冲盐溶液中→容器加塞封固。液体→装地封闭的毛细玻管或试管运送。生前由直肠中采集的粪团→装入灭菌容器中寄送。（二）病毒检验材料的保存脏器组织块→保存于50%甘油缓冲盐溶液或鸡蛋生理盐水中→容器加塞封固。（三）病理组织学检验材料的保存脏器组织块→放入10%福尔马林溶液或95%酒精中固定，固定液用量应为病料的10倍。4三、病料的记录、包装和运送方法（一）送检单填写3份，一份存根，两份寄送检验室；待检查完毕后退回1份。（二）病料的包装和运送液体病料（如黏液、渗出液、尿及胆汁等）→装入细玻璃管中（管口用火焰封闭）→再用废纸或棉花包囊装入较大的试管中→再装入木盒中运送。组织块或脏器5第二节细菌分离及鉴定细菌分离及鉴定是用人工的方法使细菌在适当的环境和营养基质中生长繁殖，获取纯种、进行鉴定与研究等。为达到细菌分离及鉴定的目的，运用无菌技术提供适当的培养基适宜的培养方法和条件6六、细菌的分离接种平板划线接种法斜面接种法倾注培养法穿刺培养法半固体培养法液体培养法平板涂布培养法七、细菌的培养方法需氧培养法二氧化碳培养法（CO2孵箱法、烛缸法、化学法）厌氧培养法（厌氧罐培养法、培养箱法）7八、细菌的鉴定（一）细菌的生长现象观察8细菌的一些培养特征有小刺在琼脂穿刺培养中的生长绒毛状假根状树状念珠状有小刺念珠状假根状树状扩展状丝状丝状在琼脂划线培养上的生长量杯状漏斗状囊状层状萝卜状在明胶穿刺培养中的生长絮状环状膜状肉汤表面生长浮膜状9（二）、细菌基本形态及特殊结构的观察细菌基本形态的观察细菌基本形态：球状、杆状和螺旋状。细菌基本结构：细胞壁、细胞膜、细胞质和核质。细菌特殊结构：鞭毛、芽孢、荚膜等。均需染色方可在显微镜下观察，染色方法有：简单染色法：只用一种染料进行染色。复杂染色法：革兰氏染色法抗酸染色法（抗酸菌呈红色，非抗酸菌呈蓝色）瑞特氏染色法（细胞核呈蓝色，细胞浆呈红色）姬姆萨氏染色法（细胞核呈蓝色，细胞浆呈红色）10细菌特殊形态的观察11（三）生化试验细菌的生化试验是继形态学鉴定之后，又一重要鉴别依据。糖类分解试验吲哚（靛基质）试验淀粉水解试验V-P试验甲基红（M.R）试验柠檬酸盐利用试验凝固血清紫牛乳试验硫化氢试验硝酸盐还原试验尿素酶试验12（四）、细菌抗原检测及血清型鉴定◎细菌抗原结构比较复杂，有存在于细胞壁的菌体抗原（O抗原，有运动性的细菌在菌体抗原之外还有鞭毛抗原（H抗原），具有不同种、型特异性。◎血清型鉴定首先要求鉴定的细菌必须纯净、新鲜，在适宜条件下培养，尽量减少伟代，以防发生变异。其次有特异性强和效价高的已知标准血清（包括单克隆抗体）和标准菌株。（五）、细菌遗传物质检测目前比较成熟的遗传物质检测包括基因探针技术和PCR技术13（六）、细菌毒力测定表示细菌毒力大小的单位有：最小致死量（MLD）：能使特定的动物感染后，在一定时限内发生的最少活的细菌量或毒素量。半致死量（LD50）：在一定的时限内能使半数实验动物感染后发生死亡所需的活的细菌或毒素量。14第三节病毒分离及鉴定检材的采集与送检、病料的处理标本采取的原则：1.病毒标本的采取应尽早为好.2.由于大多数病毒对热不稳定，应该立即接种，如果不能及时接种或需保存，一般置50％甘油盐水4℃或一20℃以下保存。15三、病毒的分离培养一、动物接种培养二、病毒的鸡胚培养三、病毒的细胞培养16一、动物接种培养动物接种是最原始的病毒培养方法。主要用于目前无法用细胞、鸡胚培养的病毒。常用的动物有小白鼠、大白鼠、田鼠、豚鼠、家兔，有时也用猴、猿、猩猩等。接种时要根据病毒对动物，组织细胞等嗜性不同而选择特定的部位，如鼻腔、皮内、皮下、腹腔、脑内、静脉等。小白鼠脑内接种法【材料】1.脑炎病毒（小白鼠脑脊髓炎）悬液：脑组织先用无菌生理盐水洗去血液，再加100％脱脂奶水研磨成10毫升悬液，离心沉淀30分钟，吸取上清液。2.小白鼠：3周龄，体重6—8克。17【方法】

1．1毫升注射器抽取脑炎病毒悬液0.1毫升，去除注射器内的气泡。2．取出小白鼠，左手将小白鼠固定，固定时用大拇指和食指握住小白鼠的头部，左手掌轻轻按住小白鼠的体部。3．右手以棉签蘸以碘酒，消毒小白鼠的右颊部皮毛4．右手拿住注射器在小白鼠眼与耳根连线的中点略偏耳朵的方向注入，进入颅腔，进针2—3毫米，不要插得太深，注射量为0.02—0.03毫升。5．注射完毕，将用过的注射器煮沸消毒，动物一般在3—4天开始发病，食欲减退，活动迟纯、耸毛、振颤、慢慢发展为麻痹瘫痪而死亡。18二、病毒的鸡胚培养19三、病毒的细胞培养通过机械解离或消化等方法将组织或细胞从机体取出，分散成单个细胞，给予必要的生长条件，模拟体内生长环境，使其在体外能继续生长繁殖，称为细胞培养。病毒的细胞培养步骤：病料处理病毒分离、繁殖细胞病变（CPE）观察20四、分离病毒的鉴定（一）病毒形态与结构的观察（二）病毒核酸类型的测定（三）病毒对几种类脂的敏感试验（四）病毒对几种理化因素的抗性测定（五）血吸附和血吸附抑制试验（六）干扰素敏感试验（七）蚀斑形成单位测定（八）病毒毒力的测定（九）血凝试验和血凝抑制试验（十）中和试验（十一）血清学试验21（一）病毒形态与结构的观察禽流感病毒狂犬病病毒22（二）病毒核酸类型的测定胸苷酸是病毒DNA合成的重要物质，它的卤素替代物的存在能抑制DNA的合成。【方法】：1、给已长满细胞单层6孔板1-4孔每2孔加病毒液3滴；2、置37℃5%CO2培养箱中1h；3、取出细胞板，吸出培养液；4、给相应的孔加5ml含胸苷酸的类同物的维持液或不含胸苷酸的类同物维持液；5、将细胞培养板放回CO2培养箱中，每天观察细胞病变（CPE）。23（三）病毒对几种类脂的敏感试验病毒有无包膜，常用脂溶剂氯仿、乙醚或去氧胆酸钠来处理病毒，看脂溶剂对病毒有无灭活作用而证明病毒有无包膜。以氯仿敏感试验为例：1、将氯仿加于病毒悬液中，使最终浓度达5%，充分振荡后在4℃放置10min.2、悬液用2000r/min离心沉淀5min，使氯仿沉于管底。3、吸取上层液，做连续10倍稀释。每一稀释接种4管细胞培养，滴定组织细胞半数感染量（TCID50）。未经氯仿处理的病毒悬液做同样处理。4、氯仿处理的病毒悬液的感染力如比对照悬液低2.0log以上即可认为是敏感。24（四）病毒对几种理化因素的抗性测定1、热灭活试验

有些病毒对热敏感在50℃30min被灭活。2、阳离子稳定试验高浓度二价离子如MgCl2能稳定某些病毒如肠道病毒等，使其在50℃60min不被灭活。另一些病毒如腺病毒等则增加对热的敏感性。3、酸敏感试验在pH3溶液中经30min能降低某些病毒的感染力如口蹄疫病毒，而对另一些病毒如猪水疱病毒等没有作用。25（五）血吸附和血吸附抑制试验细胞培养被某些病毒感染后，不论有无细胞病变，能吸附一些动物的红细胞。能凝集红细胞的病毒，一般具有血吸附作用。也有些例外，如部分肠道病毒有血凝作用但无血吸附现象；相反非洲猪瘟病毒虽不显示血凝活性，但却有血吸附作用。26（六）干扰素敏感试验干扰素是具有高度生物活性的细胞产物，能促使细胞产生抗病毒蛋白，干扰病毒的增殖，减少细胞CPE产生。制备单层细胞培养干扰素处理细胞接种病毒结果判定对照组只加维持液4：无明显CPE3：CPE占25%2：CPE占有50%1：CPE占100%27抗酸染色法（抗酸菌呈红色，非抗酸菌呈蓝色）某些病毒（A型流感病毒、鸡新城域病毒等）由于具有血凝素，可以使鸡或其他一些动物的红细胞发生凝集。相反非洲猪瘟病毒虽不显示血凝活性，但却有血吸附作用。在琼脂划线培养上的生长病毒有无包膜，常用脂溶剂氯仿、乙醚或去氧胆酸钠来处理病毒，看脂溶剂对病毒有无灭活作用而证明病毒有无包膜。（三）病毒对几种类脂的敏感试验为达到细菌分离及鉴定的目的，运用有些立克次氏体如Q热立克次氏体，对人有很强的传染性。◎细菌抗原结构比较复杂，有存在于细胞壁的菌体抗原（O抗原，有运动性的细菌在菌体抗原之外还有鞭毛抗原（H抗原），具有不同种、型特异性。（五）血吸附和血吸附抑制试验第四节其他病原微生物分离及鉴定3、凡是能在细胞培养物中产生细胞死亡破裂现象（CPE）的病毒都可采用蚀斑技术来分离和测定。主要用于目前无法用细胞、鸡胚培养的病毒。小白鼠：3周龄，体重6—8克。（七）蚀斑形成单位测定（四）病毒对几种理化因素的抗性测定（五）血吸附和血吸附抑制试验（三）病理组织学检验材料的保存最常用的分离培养方法有（1）鸡胚卵黄囊接种法（2）小鼠接种法（3）细胞培养法。常用的动物有小白鼠、大白鼠、田鼠、豚鼠、家兔，有时也用猴、猿、猩猩等。第四节其他病毒微生物分离及鉴定菌体形态呈高度多形性，有球状、杆状、环状、丝状等。液体→装地封闭的毛细玻管或试管运送。1毫升，去除注射器内的气泡。小白鼠：3周龄，体重6—8克。胸苷酸是病毒DNA合成的重要物质，它的卤素替代物的存在能抑制DNA的合成。每一稀释接种4管细胞培养，滴定组织细胞半数感染量（TCID50）。姬母萨氏法染色良好，呈淡紫色。（五）血吸附和血吸附抑制试验液体病料（如黏液、渗出液、尿及胆汁等）→装入细玻璃管中（管口用火焰封闭）→再用废纸或棉花包囊装入较大的试管中→再装入木盒中运送。（七）蚀斑形成单位测定病毒蚀斑(又叫空斑)如同噬菌体的噬斑，一个蚀斑为一个病毒体的繁殖后代品系。在细胞培养中做蚀斑是一种较精确地测定病毒感染力的方法。【方法】：1、将病毒各稀释度种入单层细胞瓶，吸附1小时后，在单层细胞上复以营养琼脂培养基，病毒在细胞中繁殖使细胞死亡。但由于琼脂的限制只能感染邻近的细胞，形成“蚀斑”的退化细胞区。2、经中性红活细胞染料着色后，活细胞显红色，而蚀斑区细胞已退化不着色，形成不染色区域。3、凡是能在细胞培养物中产生细胞死亡破裂现象（CPE）的病毒都可采用蚀斑技术来分离和测定。

28（八）病毒毒力的测定衡量病毒毒力（毒价）的单位过去多用最小致死量（MLD）。现多改用半数致死量（LD50）。用鸡胚测定时，毒价单位为鸡胚半数致死量（ELD50）或鸡胚半数感染量（ELD50）。用细胞培养测定时，用组织细胞半数感染量（ELD50）。29（九）血凝试验和血凝抑制试验某些病毒（A型流感病毒、鸡新城域病毒等）由于具有血凝素，可以使鸡或其他一些动物的红细胞发生凝集。如果在这些病毒悬液中先加入特异性的免疫血清，则病毒凝集红细胞的作用被抑制。红细胞凝集极凝集抑制试验常用于测定病毒的含量及病毒的鉴定等。30第四节其他病原微生物分离及鉴定一、螺旋体螺旋体是一类菌体细长、柔软、弯曲呈螺旋状，能活泼运动的原核单细胞微生物。基本结构与细菌类似。从有疑似急性螺旋体病症状的动物的血液和乳液中分离到螺旋体是有诊断价值的。但从血液中分离有一定难度，因为菌血症和临床症状往往不是同时出现。（一）病料的采集与检查（暗视野）（二）分离培养（三）动物感染试验（四）血清学试验31二、立克次氏体立克次氏体是介于细菌和病毒之间的一类微生物，除少数成员外，大多为严格的细胞寄生性微生物。革兰氏染色阴性。微生物学诊断：病原的分离鉴定和动物血清中特异性抗体的检测。有些立克次氏体如Q热立克次氏体，对人有很强的传染性。在进行有关活立克次氏体的操作实验时应有完善的隔离防护设施和条件。32三、支原体支原体是能在无活细胞培养基中繁殖的最小微生物，它是一类无细胞壁，仅由三层薄膜组成的细胞膜，胞质内有颗粒状核糖体，双股DNA的原核细胞。菌体形态呈高度多形性，有球状、杆状、环状、丝状等。革兰氏染色阴性，但较难着色。姬母萨氏法染色良好，呈淡紫色。支原体菌落33四、衣原体衣原体是一类专性严格的细胞内寄生生活的微生物，不能在细菌培养基上生长繁殖；在光学显微镜下可以被观察到。衣原体属中与动物有病原关系的主要为鹦鹉衣原体，它可引起畜禽的多种疾病，要确诊其病原，需进行病原体的分离培养及对分离物作鉴定。最常用的分离培养方法有（1）鸡胚卵黄囊接种法（2）小鼠接种法（3）细胞培养法。34动物接种是最原始的病毒培养方法。1、将病毒各稀释度种入单层细胞瓶，吸附1小时后，在单层细胞上复以营养琼脂培养基，病毒在细胞中繁殖使细胞死亡。第六节现代生物技术在动物检疫中的应用小白鼠：3周龄，体重6—8克。主要用