第18章-补体检测及补体参与的试验

临床免疫学检验技术第十八章补体检测及补体参与的试验陈育民目录补体与补体系统的概念补体的理化特性与生物学功能血清总补体活性测定单个补体成分的测定补体参与的试验补体测定的临床意义补体与补体系统的概念补体（complement）是存在于正常人或脊椎动物新鲜血清中的一种不耐热的成分，可辅助和补充特异性抗体介导的溶菌、溶血作用。补体系统（complementsystem）因补体并非单一成分，是由30余种可溶性蛋白和膜结合蛋白组成，故称为补体系统。补体系统根据各成分的功能不同，可分为补体固有成分、补体调节蛋白和补体受体三类。正常人体内补体成分的含量相对稳定。第一节补体的理化特性与生物学功能重点提示补体成分的理化特性补体系统的激活补体系统的生物学功能一、补体成分的理化特性补体成分为糖蛋白和球蛋白（大多是β，少数为α或γ)，分子量在25kD（D因子）～550kD（C4bp）之间。血清补体蛋白总量约为4g/L，约占血清球蛋白的10%、血清总蛋白的5%～6%，其中C3含量最高，可达1.3g/L。补体成分的性质不稳定，易受理化因素影响，如56℃30分钟即被灭活；在室温下也会很快失活；在0℃～10℃条件下，补体活性只能保持3天～4天，故补体应保存在-20℃以下或冷冻干燥保存。紫外线照射、机械震荡、强酸、强碱、乙醇或蛋白酶等也可使补体灭活。二、补体系统的激活正常情况下，体内绝大多数补体成分通常以无活性形式存在，只有活化后才能发挥其生物学作用。补体系统可经三条途径激活。经典激活途径（经典途径）凝集素激活途径（MBL途径）旁路激活途径（替代途径）补体系统三条激活途径示意图三、补体系统的生物学功能溶解细胞、溶解细菌和病毒的作用。调理作用，促进吞噬细胞的吞噬。免疫黏附作用，清除循环免疫复合物。炎症介质作用，C5a、C3a和C4a等引起炎症反应。参与特异性免疫应答。第二节血清总补体活性测定重点提示CP-CH50脂质体均相免疫溶破试验AP-CH50一、CP-CH50CP-CH50是检测补体经典激活途径的溶血活性，与C1～C9各组分的量及活性均有关。原理是SRBC与溶血素结合成复合物后，可激活血清中的补体导致SRBC肿胀而发生溶解（即溶血）。常以50%溶血作为判定终点，它比100%溶血更敏感，故该实验方法称为50%补体溶血实验（50%complementhemolysis，CH50）。引起50%溶血所需要的最小补体量为一个CH50单位（U），通过计算可测定出待测血清中总的补体溶血活性，以CH50（kU/L）表示。CP-CH50当SRBC和溶血素量一定时，溶血程度与补体量及活性呈正相关，为特殊的S形曲线。在轻微溶血和接近完全溶血时，对补体含量的变化不敏感；在30%～70%之间几乎呈直线，补体含量稍有变动就会造成溶血程度的明显改变。CP-CH50测定方法稀释缓冲液：pH7.2～7.4的巴比妥缓冲液（BBS）或磷酸缓冲液。2%SRBC悬液溶血素：商品溶血素按说明的效价稀释使用。自制溶血素先加热灭活补体后，按表18-1滴定效价，测定补体活性时大多使用2个单位的溶血素。50%溶血标准管：取2%SRBC悬液0.5ml加蒸馏水2ml充分混匀，即为全溶血管；向全溶血管加BBS2.5ml。50%溶血总补体活性的测定：按表18-2操作。50%溶血总补体活性的计算：以最接近50%溶血标准管的测定管为终点管，按公式（1/终点管稀释血清的用量×稀释度）计算CH50值（kU/L）。CP-CH50CP-CH50CP-CH50的方法评价方法简便、快速，但敏感性较低。结果反映C1～C9等各成分的量和活性的综合水平。所用稀释缓冲液、SRBC的数量和状态、待测血清的新鲜程度、反应温度、pH、离子强度以及反应容器的洁净程度等多种因素均可影响血清总补体活性测定的结果。每次试验都需要使用新鲜的SRBC，为手工操作的半定量试验，结果难以令人满意。二、脂质体均相免疫溶破试验试剂1：脂质体，其内部水相中包入水溶性的葡萄糖-6-磷酸脱氢酶（G-6-PDH），双层内包裹抗原-二硝基苯酚（DNP）。试剂2：羊抗DNP抗体和酶底物，底物为6·磷酸萄萄糖（G6P）和辅酶1（NAD）。反应过程：羊抗DNP抗体与脂质体上DNP结合成抗原-抗体复合物，待测血清中的补体被激活，攻击破坏脂质体膜，释放出G-6-PDH与酶底物（G6P和NAD）发生反应，产生NADH。340nm处测吸光度（A），A值与待测血清中的补体活性成一定比例关系。该法不使用SRBC，血清用量少，影响因素少，操作简便、快速准确，适用于自动分析仪测定。三、AP-CH50为测定血清补体旁路激活途径溶血功能的试验。其原理是家兔红细胞未经致敏可直接激活人血清中的B因子，引起旁路途径活化，导致兔红细胞溶解。溶血程度与血清中参与旁路激活途径的补体量及活性呈正相关。与CP-CH50测定相似，可计算出待检血清中补体旁路激活途径的溶血活性，以AP-CH50kU/L表示。测定时缓冲液中加入乙二醇双氨基四乙酸（EGTA)可与待测血清中的Ca2+螯合，阻断补体经典激活途径。兔红细胞用枸橼酸盐抗凝，洗涤后配成0.5%兔红细胞悬液备用。其结果反映C3、B因子、P因子、D因子及C5～C9各组分量及活性。第三节单个补体成分的测定重点提示WHO和国际免疫学会报告：30多种补体成分主要检测C3、C4、C1q、B因子和C1INH等5种成分。免疫溶血法（测其活性）免疫化学法（测其含量）一、免疫溶血法SRBC与溶血素（指示系统）结合后可激活补体经典途径，导致SRBC溶解，发生溶血现象。参与反应的补体有两组，一组是缺乏某一补体成分的动物血清或人血清；另一组是待测血清中的补体。测定时将指示系统与缺乏某一补体成分的血清作用不发生溶血，此时加入待测血清，原来缺乏的补体成分得到补偿，补体激活的级联反应完成，即可发生溶血。溶血程度与待测血清中的某一单个补体成分的含量与活性相关该法无需特殊仪器与设备，试验快速简便，但敏感性较低，影响因素较多，仅能测定某一补体成分的活性，而不能测定其含量。二、免疫化学法可测定补体系统单个成分的含量。检测方法：单向免疫扩散、火箭免疫电泳、免疫比浊法包括透射比浊法和散射比浊法、酶联免疫吸附试验（ELISA）。前两种方法已趋于淘汰。免疫比浊法方法简单，重复性和特异性好，并能进行标准化流程管理，进行质量控制，是目前常用的检测方法。ELISA具有操作简单、敏感性高、特异性强、可以自动化等优点，不仅对补体系统单个成分可进行定性检测，也可定量检测。目前对补体C1～C9的11种蛋白成分、B因子、D因子、P因子、MBL、FCN、MASP、C1INH、H因子、I因子、C4结合蛋白（C4bp）以及补体的裂解产物C4a、C4b、C2a、C2b、C3a、C3b、iC3b、C3c、C3d、C5a、C5b等均已有商品化的ELISA检测试剂盒。第四节补体参与的试验重点提示补体结合试验补体依赖的细胞毒试验补体参与的其它试验一、补体结合试验反应系统：已知的抗原（或抗体）与待测的抗体（或抗原）。补体系统：常用豚鼠新鲜血清。指示系统：SRBC和溶血素，常将二者预先结合成致敏SRBC。二、补体结合试验试验分两步，先将反应系统与补体系统发生反应，反应一定时间后再加入指示系统进行反应。根据是否发生溶血来判断试验结果。结果不发生溶血反应为阳性，发生溶血反应为阴性。比凝集反应与沉淀反应的灵敏度高、特异性强、可检测的抗原或抗体范围广、无需特殊设备、结果容易观察。参与成分多，结果易受许多因素影响，各种参与成分需要繁琐的稀释和滴定，难于标准化。已基本被淘汰。其试验原理和设计思路对新型免疫学检测方法的建立具有启迪和指导作用。补体依赖的细胞毒（CDC）试验正常细胞、肿瘤细胞、病毒感染细胞等带有特异性抗原的靶细胞与相应抗体结合后，在补体的参与下，可导致靶细胞膜损伤、通透性增加、细胞死亡，而不带特异抗原的细胞仍存活。伊红-Y或台盼蓝等染料可通过损伤的细胞膜进入细胞，使损伤死亡或濒死细胞着色，而活细胞不着色。可用于检测细胞膜抗原（如HLA分型、T细胞表面抗原等），也可用于鉴定抗体的特异性。三、补体参与的其它试验免疫粘连血凝试验：可检测多种病毒及其抗体。溶血空斑试验：可检测抗体形成细胞（AFC）。胶固素结合试验：可检测循环免疫复合物。C1q抗体测定试验：常用ELISA法检测，多种自身免疫性疾病患者的血清中可检测到C1q抗体，其含量与疾病病情呈正相关。第五节补体测定的临床意义重点提示补体活性与含量增高补体活性与含量降低或缺陷补体裂解产物检测的临床应用一、补体活性与含量增高各种传染病组织损伤急性炎症某些肿瘤患者心肌梗死糖尿病妊娠病情危重时，总补体活性常呈下降趋势二、补体活性与含量降低或缺陷1.先天性某些补体成分缺陷C1INH缺陷：可致遗传性血管神经性水肿。C2、C3缺陷：可导致严重的感染。衰变加速因子（DAF）和膜反应性溶破抑制物（MIRL）缺陷：可导致阵发性夜间血红蛋白尿。补体受体1（CR1）缺陷：可导致循环IC的清除障碍。I因子、H因子缺陷：可引起肾小球肾炎。C1q缺陷：可引起严重顽固性皮肤损害。C1q、C1r、C4、C2缺陷：可致免疫复合物性血管炎（包括肾炎）。2.后天性获得性补体活性与含量降低补体消耗增多：系统性红斑狼疮（SLE）、Ⅱ与Ⅲ型超敏反应、自身免疫性溶血性贫血、冷球蛋白血症、类风湿关节炎、强直性脊柱炎、移植排斥反应等疾病时，补体消耗增加，导致血清补体活性与含量降低。其降低程度与疾病的活动、进程和疗效等有关。补体大量丢失：如大面积烧伤、大出血和肾病综合征等，可使大量体液和蛋白质丢失，导致补体活性与含量降低。补体合成不足：肝细胞受损或大量破坏、机体营养不良等可使补体的合成减少，导致血清补体活性与含量降低。肝病时血清补体活性与含量降低的顺序依次为慢性肝炎、肝细胞癌、肝硬化和重症肝炎。三、补体裂解产物检测的临床应用Ⅲ型超敏反应的发病机制与补体活化后产生的C3a、C5a等裂解产物（称为过敏毒素）有关。Ⅲ型超敏反应性疾病可测定补体裂解产物C3a、C5a等，来了解疾病的进展程度。本章小结补体有30余种成分，存在于正