浙江大学生物工程学复习提纲

1.名词解释(1)基因组(genome)ThesumofallthegenesandintergenicDNAonallthedifferentchromosomesofacellisreferredtoasthecellulargenome.(2)DNA测序法Sanger(dideoxy)method:以DNA单链作为模板，加入DNA聚合酶和四种dNTP，分别加入少量的ddNTP，在聚合酶的作用下，ddNTP随机掺入复制链中，由于ddNTP的3’端没有羟基，加入后终止聚合反应，形成不同长度的DNA片段。将这些寡核苷酸片段进行电泳分析(能区分长度仅差一个核苷酸)，并用35S放射自显影，读出DNA上的核苷酸序列。(3)RFLP（p123ofGeneVI）RFLP(restrictionfragmentlengthpolymorphism)限制性片段长度多态性（限制性片段指“限制性内切酶酶切片段”）即同种不同个体的基因组在用同一种限制性内切酶作用时，限制性酶切图不同的现象。〔限制性酶切图与基因功能无关，它的多态性也不一定导致表现型的改变，可以作为geneticmarker〕(4)SNP（Singlenucleotidepolymorphisms）SNP指基因组水平上由单核苷酸改变引起的DNA序列多态性。它是人类可遗传变异中最常见的一种，占所有已知多态性的90%，是遗传变异的关键指标。SNP在人类基因组中广泛存在，平均每500到1000个碱基对就有一个SNP发生，估计总数可达300万个，甚至更多。SNP既能在编码区又能在非编码区中发生。总的来说，位于编码区的SNP（codingSNP）较少，但它在遗传性疾病研究中却具有重要意义。由于特殊基因上的SNP很可能对疾病易感性、对于环境因子和药物的反应有所作用，所以引起了许多科学家和制药公司重视。在我国强伯勤主持的中华民族基因组SNP研究计划也于今年启动。另外，人类基因组计划旨在解读人类分布在24条染色体上的30亿对碱基。面对如此庞大信息量，人类基因组测序的策略是以作图为基础，将染色体分为易操作的结构区域。第三代分子标记就是SNP，这使得遗传图谱的制作日益精密。（第一代是限制性酶切片段长度多态性（RFLP），第二代是短串联重复序列（STR））(5)遗传图（p122ofGeneVI）染色体上可变部位的线性排列，由基因重组实验推断出来(6)物理图AmapofthelocationsofidentifiablelandmarksonDNA.(如限制性酶切位点)，以bp为单位。(7)叶盘法叶盘法是常用的植物转基因方法，它是新切的对部片与农杆菌在培养基上共培养2天，使└秩局参锵赴僮辽秆∨溲仙秆∽说南胞（先杀死农杆菌，再加入抗生素杀死未转入农杆菌质粒的植物细胞）。将存活的植物细胞培养形成愈伤组织后,转入合适的配养基中培养为含Ti质粒转化基因的植株。(8)Ti质粒（p443）即肿瘤诱导质粒，1971年由Schell在农杆菌中发现，能使植物产生冠瘿瘤。Ti质粒为双链环状DNA分子，约200－250kb。四个重要区域为：复制起始点OriV、致病区(Virregion)、T-DNA区和农杆碱分解代谢区。Vir区转录单位对于农杆菌转化细胞至关重要，但是此区只有受到植物细胞释放的信号分子（如乙酰丁香酮、羟基乙酰丁香酮）刺激才能表达。T-DNA（transferDNA）是Ti质粒上能被整合到植物核DNA上的片段，。含有Ocs、Roi、Shi等基因。T-DNA两端各有一个25bp长的高度保守的正向重复序列，其中右边界序列对于T-DNA的转移至关重要。只要两端序列存在且方向正确，那么，在两端序列中间插入任何一个DNA片段都可能被转移整合到植物基因组中去。这也是我们用Ti质粒进行遗传转化的理论基础。(9)功能基因组（functionalgenomics）结构基因组学是基因组分析的早期阶段，以建立生物体高分辨率遗传、物理和转录图谱为主。功能基因组学是利用结构基因组学提供的信息，系统的研究基因功能。他以高通量、大规模的实验方法及统计与计算机分析为特征。(10)重组植物利用植物基因工程的手段，在离体条件下按照人们的目的对植物的DNA进行操作，培育新的植株，达到改良植物性状的目的，这样获得的植物即转基因植物。(11)蛋白质组（proteome）此概念是澳大利亚学者Wasinger等于1994年提出的，指的是由基因组编码的全部蛋白质。从这个定义看蛋白质组内的蛋白质数目应该等于基因组内编码蛋白质的基因数（准确的说是ORF的数目），但在生物体内这样的蛋白质组是不存在的。从基因表达的角度说蛋白质组内的蛋白质数目总少于基因组中开放阅读框的数目；但是从蛋白质修饰的角度说蛋白质数目又远多于基因组中开放阅读框的数目。基因组基本上固定不变，而蛋白质组是动态的，具有时空性和可调节性，能反映基因的表达时间、表达量、蛋白质的翻译后加工和亚细胞分布。(12)YAC载体(yeastartificialchromosome)（p639fig20.13ofGeneVI）YAC含有在酵母中增殖一个染色体所必需的序列元素，一个复制起点，一个确保分离进入子细胞的着丝点和封闭染色体末端的端粒。YAC还带有三个选择标记(selectablemarker)：TRP1、URA3和SUP4(中间含有SmaI克隆位点)。在载入外源DNA前YAC保持环状状态。端粒序列后是BamH1酶切位点，用BamH1切割产生线性分子，末端是与完整的染色体相似的保证了线性分子稳定的端粒。用SmaI酶切产生平齐末端，DNA可以在此插入。因此两个酶切同时进行就得到了两个线性片段(two“arms”)，每一个在一端含有端粒，另一端有可以连接的平末端。每个臂有一个选择标记，可以用来选出两个臂都被连接的分子。SUP4标记的丧失使得再连接的YAC与未打开的YAC得以区分。一个YAC载体可以携带大量的DNA，插入300kb并不稀罕。与质粒相比，这几乎提高了一个数量级。(13)功能筛选（functionscreening）(14)染色体步行(chromosomewalking)（p637fig20.12ofGeneVI）我们从一个已经分离的基因克隆开始，这个克隆含有一个已知基因，或者从遗传图上知道它在某个我们感兴趣的区域附近。为了使大片段便于操作，我们用来自前一个克隆一端的亚片段，来分离下一个片段。具体方法：我们从原始克隆亚克隆出相应片段(subcloning:把DNA片段从某一载体上克隆到另一载体上)。然后从文库中辨认出与这个克隆重叠的其他嵌合载体。这些载体将在携带第一个克隆片段的一端延伸。我们可以通过制作每个片段的限制性图来确定延伸方向，这张用新的材料延伸的图应该含有与第一个克隆一端相同的片段。不断重复这一过程。原则上，可能步行上百kb，并且基因组中超过1000kb的区域也曾用这种方法作图。(15)定位克隆（positionalcloning）TheidentificationofagenebasedsolelyonitspositionintheGenome.经典定位克〈粹依赖连锁分析进行染色体定位。定位候?克隆(positionalcandidatecloning)是它的发展与改进。在克隆遗传病优点：不需要知道基因产物的功能；基因的生化、生理学、病理学、生物学特均非必需。不足：不能显示基因产物的功能；对于基因功能的认识依赖于与已知功能基因产物的序列同源性；基因组计划不断减少这一事件的可能性。(16)转座子：(transponson)存在于染色体DNA上可自主复制和位移的基本单位，最简单的转座子不含任何宿主基因而常被称为插入序列（insertionsequence,IS），它是细菌染色体或质粒DNA的正常组成部分。IS序列都是可以独立存在的单元，带有介导自身移动的蛋白。IS两末端为倒置重复序列，转座时往往复制宿主靶位点一段DNA，形成位于IS序列两端的正向重复区。(17)转座子示踪(transponsontagging)又称转座子标签，原理：利用转座子的插入造成基因突变，以转座子序列为基础，从突变株的基因文库中筛选出带有此转座子的克隆，它必含有与转座子序列相邻的突变基因的部分序列，再利用这部分序列从野生型基因文库中获得完整的基因。根据目的不同，可以采取定向标签(directedtagging)随机标签(randomtagging)两种标签策略。这一方法的优点是：可以在不了解基因产物大的生化性质和表达模式的情况下分离克隆植物基因。2.思考题1）简述植物对人类的重要贡献答：a.光合作用：利用光能CO2＋H2O制造O2和有机物，能量的“固定”b.食物来源c.环境保护：保持水土、防止风沙；d.重要的实验材料e.药物与保健品2）简述制作转基因植物的步骤答：A.目标基因的克隆。Strategies：a.如果有产物的：若为protein则测部分氨基酸序列，合成探针筛选cDNA文库；若为DNA，则切成片段，接入表达载体表达，进行抗体筛选和功能筛选；或者在cDNA大规模分析的基础上进行同源收缩，找出可能的目标基因。b.无产物的可以采用转座子示踪、Ti质粒插入法、定位克隆、cDNA差式显示等方法克隆其基因。B.植物表达载体的构建在基因的5’端加上启动子（如35S启动子），3’端加上终止子。C.植物的遗传转化主要方法有：a.Ti质粒及Ri质粒为载体的转化系统；b.以PEG介导的原生质体化学转化系统；c.电激法；d.用基因枪转入愈伤组织后培养；e.显微注射(micro-injection);f.病毒感染。D.转化植物细胞的筛选及转基因植物鉴定引起表现型变化的可以通过观察表现型改变而找出成功转入的植株；可以通过报告基因或筛选标记基因来判断；也可以在DNA、RNA、protein三个水平上鉴定转入基因及其表达情况(Southern/Northern/Westernblotting)来确认。3）简述用Ti质粒（农杆菌）转化外源基因的分子机制答：用Ti质粒进行遗传转化的理论基础是：在T-DNA两端正向重复序列中间插入任何一个DNA片段都可能被转移整合到植物基因组中去。另外，去掉T-DNA上的致瘤因子，造成T-DNA大段缺失，或在T-DNA上插入外源基因并不影响T-DNA的转移整合功能。并且由于Vir区对于T-DNA的转移是通过反式作用因子来实现，所以Vir区与T-DNA区可以分别位于两个复制子上。基于以上性质，发展出了两个主要的Ti质粒载体系统，即共整合载体系统和双元载体系统。共整合载体系统(cointergratevector)，Ti质粒上编码致癌基因及冠瘿瘤碱基序列常为一段pBR322DNA所代替，当外源基因的pBR322衍生中间载体由大肠杆菌进入农杆菌细胞后，两者相同的pBR322序列间发生同源同组，导致外源基因整合到Ti质粒上。双元载体包含两个质粒，它们都能在农杆菌中复制，其中一个Ti质粒(不含T-DNA，且左边区与右边区被修饰)提供Vir功能，另一个广宿主范围的质粒携带目的基因和植物选择性标记基因及移动和复制功能基因这两种系统的中间载体由大肠杆菌转移到壤农杆菌中都需要第三种菌参与，也称三亲交配(triparentalmating).Ti质粒的遗传转化：植物受伤后，伤口细胞分泌大量的酚类化合物(如乙酰丁香酮)，它们是农杆菌识别敏感植物的信号分子。农杆菌立即趋向这些细胞，最终导致T-DNA的转移。跟据这一性质建立了叶盘法转化系统。4)全基因组鸟枪法测序的主要步骤5）SNP解析的目的和意义答：a.SNP继RFLP、STR后称为第三代基因组作图的多态性标记，使得遗传图谱的制作更精细，并且适合自动化大规模扫描。b.由于SNP被认为是一种能够稳定遗传的早期突变，他们之间存在着连锁不平衡，与疾病存在着稳定的相关性，所以SNP是研究基因组多态性和识别、定位疾病相关基因的一种新工具。c.存在于编码区以及其紧邻上下游序列中的SNP，可以改变基因的表达水平和表达产物的功能。d.特殊基因上的SNP可能直接关系到人类对于疾病的易感性和对于环境因子和药物的反应性。因此SNP可能将为根据个体的多态性开展药物设计和对特殊群体制订服药剂量提供依据。6)如何提高蛋白质的热稳定性，提高热稳定性的必要性和可能性答：(1)可能性：噬热菌(如有些远古细菌可以耐受100度以上的环境)以及其它生活在高温环境下的生物体内的酶热稳定。(2)必要性：酶在各种变性剂下的稳定性是阻碍酶的广泛使用的最大问题之一，而当一个酶热稳定时，它通常很可能对于其它使其三级结构去折叠的因素也稳定。另外，在高温下工作，有许多优点：a.每升高10度，反应速度加倍；b.温度超过60度时抑制了微生物的生长；c.在许多条件下，温度升高使底物溶解度升高，溶液粘度下降；d.对于吸热反应提高温度使平衡向产物方向移动。科研、生产中十分需要能在较高温度下发挥作用的酶，如加酶洗衣粉。(3)方法：化学修饰、酶的固定化、蛋白质工程、添加剂①利用自然界热稳定的酶寻找自然界中同源的热稳定的酶，一般在生活在60度以上的嗜热微生物中。几乎所用的嗜热菌可以在菌种收藏中心DSM得到。如果在某种生物中酶的量适合，则用它发酵。否则克隆它的基因，插入载体转入微生物中。如：DNA聚合酶、糖代谢酶嗜热菌中与嗜温菌中酶的比较一些氨基酸发生了代换：Gly->Ala、Ser->Ala、Lys->Arg等产生了以下影响a.堆积紧密(表面积与体积比小稳定性高)b.静电相互作用增加(形成更多离子对如Lys->Arg)c.增加二硫桥、增加疏水相互作用d.增加氢键e.微环境(渗透压、钙离子)f.糖基化(多聚糖保持包围蛋白质的水化层、与表面的亲水氨基酸形成氢键、碳水化合物与临近肽的立体相互作用稳定了蛋白质的构象、使变性或部分变性的状态更易溶阻止聚集、遮掩酶切位点，减少蛋白酶水解所必须的构象变化)③蛋白质工程：只有一些氨基酸的替换对于热稳定性的提高是必要的。蛋白质工程方法：随机突变、sitedirectedmutagenesis。a.randommutagenesis：制备所有可能的单位点随机突变文库，筛选热稳定性提高的几个突变株，为定点突变提供信息；或者采用evolutionarymolecularengineering方法：编码目标蛋白的基因转入极端嗜热菌中，在必需酶才能存活的条件下培养，提高温度选择能生存的菌，测序分析突变点。后两步可以重复以逐渐升温接近要求温度。b.sitedirectedmutagenesis：oligonucleotidesdirectedmutagenesis;overlapextensionPCR④化学修饰：是使蛋白质稳定化的重要和有效的方法之一必需避开活性部位关键基团；交联的原理是通过在两部分间桥连，增加结构的刚性，但往往降低活性；⑤酶的固定化：减少亚基分离，解聚⑥添加剂：a.个别情况下底物或底物类似物能够稳定酶，如NAD依赖性脱氢酶：b.表面自由能改变了蛋白质溶液相互作用：有机分子、盐、氨基酸盐等c.低分子量溶质：sugar是好的蛋白质稳定剂，甘油有些特殊。d.聚合物溶质如PEG对invertase的稳定作用(4)如何作出选择：a.收集关于蛋白的尽可能多的信息，决定最佳的目标和我们可以采用的方法b.有时简单的添加剂比我们进行全面的定位突变更有效的达到要求c.方法是否合适依赖于方程：interest＝剩余活力×寿命，必需考虑稳定化过程的价格与酶的价格的比例。d.固定化酶在工业上的应用，优势是不需要了解太多的酶的结构信息，不足是酶要相对高纯；随机突变介于固定化和定位突变之间，我们只需知道cDNA信息，最终筛选出好的廉价的酶源，但并不总能成功；定位突变可以产生要求的氨基酸改变，可以对酶结构的稳定及相互作用有深入的了解；酶配方(添加剂)是一个重要参数；化学修饰提供了一个有效的方法，但是无法提前预知。7)如何得到一个菌种答：获得菌种的途径：(1)从ATCC、CGMCC等菌种收藏中心购买(2)从自然环境中筛选(3)遗传工程:将目标基因插入人工质粒中，筛选好的菌种(4)突变:通过化学、物理或者生物的方法(5)细胞生物学技术：原生质体融合在保持渗透压平衡的条件下除去细胞壁(提高了遗传重组率)，在融合剂(如PEG)的存在下，原生质体融合形成杂合体或双倍体，融合原生质体细胞的再生。主要不足是不稳定。8)为什么要进行摇瓶实验，可得到什么结果答：进行摇瓶实验的目的是优化细胞生长和产物生产的条件，为进一步放大，直至工业化提供依据。主要条件有：a.PH值；b.温度；c.溶氧；d.底物选择：最大和最优底物浓度e.其他条件：如限氮、限磷对于发酵结果的影响等等9)如果你是一个抗生素工程师，如何设计生产过程答：a.分离或者从菌种收藏中心获得待选菌种b.筛选有抗菌活性的菌种c.开发浸没培养生产方法d.开发分离纯化抗生素的方法e.确定抗生素的性质：物理性质，如吸附(adsorption)与吸收(absorption);化学性质，如反应性，溶剂中的溶解度，对于酸、碱、热的稳定性f.抗生素评估g.药理实验h.抗菌活性i.与已有抗生素性能的比较j.开发实验工厂规模(pilotplant)的生产方法k.申请临床实验的许可l.实验提纯的抗生素m.开发工厂车间规模(plantscale)的生产方法n.获得面向临床应用的生产许可o.其它各种各样的考虑p.开发抗生素生产控制方法q.新应用的开发r.Developmentofmarketinganddistributionsystems.Financingofbusiness10)什么是固定化酶，固定化的方法，举例通过吸附、包埋、交联、化学偶联等固定化技术将水溶性的酶固定在水不溶性的载体上得到水不溶性的酶，称为固定化酶。优点是：不溶于水，易于与产物分离；可反复使用；稳定性好；可连续生产。缺点是：固定化过程中往往会引起酶的失活。常用固定化技术有：微型胶囊、吸附、胶格包埋、双功能试剂共价交联、化学偶联。A.微型胶囊法：酶被包埋在1-100μm的胶囊中，底物与产物可以自由过膜。a.相分离法(酸纤维素：β-D-半乳糖苷酶、天０访福换棉胶：脲酶)。b.界面聚合法：尼龙66。c.液膜法：聚脲。d.液体干燥法.B.吸附法：物理吸附（静止法，电沉积法，反应器表面直接沉积法，荡浴或混合浴沉积法），离子吸附（DEAE－cellulose，DEAE－sephadexA－50）C.胶格包埋法：N，N‘－甲叉双丙稀酰胺，丙稀酰胺D.双功能试剂交联法：戊二醛E.不溶性载体共价耦联法11)蓝细菌generecombination常规步骤：答：a.PCR扩增目标基因片断b.基因的分子克隆：将目标基因克隆到pUC系列的含lacZ基因的质粒中，在X-gal平板上，通过检查因α互补消失产生的白色菌落就可以带有重组质粒的蓝细菌c.DNA体外重组构建新的质粒：genedeletion和geneinterruption质粒的构建d.用质粒转化对细胞，筛选突变体质粒：e.突变体DNA的PCR检测和Southernblot分析12)吴庆余构建的基因缺失突变体FRXC还能作什么工作afrxc-突变体在黑暗条件长期培养，蓝细菌PCC6803由自养向异养转变(利用Glucose)。这一过程必然涉及一系列基因的开启表达。为克隆相关的基因提供了可能。b叶绿素与叶绿素结合蛋白相互作用及与对内囊体膜形成的调控：研究表明叶绿素的消失可以导致类囊体膜的消失，而frxc-突变体在黑暗条件不合成叶绿素，在光照条件下可以合成叶绿素的性质为我们研究内囊体、光合系统组装的动态性质、以及叶绿素与叶绿素结合蛋白相互作用提供了很好的系统。cfrxc-突变体在黑暗条件长期培养，蓝藻的叶绿素含量很低，这可能给蓝藻的热模拟降解产物带来差异。由于其它大分子的合成未受影响，与正常蓝藻比较就可以发现蓝藻热模拟降解产物中那些组份来源于叶绿素。这可能给出对于重要的标志物分子的前体母质来源信息。d红藻与蓝藻藻胆体中含有一类捕光色素复合蛋白－藻胆蛋白。frxc-突变体在黑暗条件合成叶绿素受阻，可能对藻胆蛋白的代谢产生影响。并且类囊体膜的解体也使得藻胆体的定位与装配发生改变。efrxc-突变抑制了将原叶绿素酸酯转化为叶绿素的原叶绿素酸酯还原酶活性，必然造成上游的原叶绿素酸酯的积累，以及其它上游物质的积累，通过光控开关，研究叶绿素代谢途径。f.用cDNA差式显示或基因芯片技术对于有光条件下以及暗条件下，正常以及frxc-突变体基因表达谱进行分析，通过比较找出受frxc调控的基因（即位于frxc下游的基因），并且分析frxc是否参与了光途径下叶绿素的合成。13)利用已获得蛋白克隆其基因答：首先根据研究工作的目的和性状的生理生化特性，分离纯化所需蛋白质和多肽，并对它进行部分氨基酸序列分析或制备单克隆抗体。PCR扩增。根据所得的氨基酸序列推出可能的核苷酸序列，人工合成两个简并的核苷酸引物，以染色体DNA或第一链cDNA为模板进行扩增，从而得到目的基因片段。构建cDNA文库。对于组织中含量丰富的基因：根据基因表达部位或特异性选取一定的组织提取总RNA，制备poly（A）RNA，经过逆转录酶作用合成第一链cDNA，并以此为模板，在DNA聚合酶的作用下合成第二链cDNA。然后选择合适的载体构建cDNA文库。根据所推测的核苷酸序列合成探针，进行菌落或菌斑原位杂交，筛选重组克隆，并进行序列测定。构建基因组文库。用内切酶将高相对分子量的染色体DNA部分消化，并选择合适的载体(如噬菌体或cosmid载体建立基因组文库)，然后用人工合成的寡聚核苷酸或以其cDNA克隆等同源性片段为探针筛选目的基因克隆，也可以利用所制备的抗体通过放射性筛选分离目的基因克隆。14)什么叫生物芯片，其最大特点生物芯片指能对生物分子进行快速并行处理和分析的指甲盖大小的薄型固体器件。（实际上也可以作化学分子分析）与电子芯片比：在材料、制作工艺、输出信号、使复杂的系统变小方面相同；但是前者输入的是液体生物材料，一次性使用；后者可永久使用，输入为电信号。15)生化实验的常规步骤，将三个步骤集成起来有什么好处常规步骤：样品制备（collection、storage、classification）、生物化学反应、结果检测。优点：提高分析速度、降低样品和试剂的消耗量、使实验室微型化、提高了检测精度、实验结果的数字化便于应用网络(16)如何开展PHA大规模生产答：创业之路：(1)市场调查与预测、文献调研：分析开发产品的前景、评估从实验室工作转化为工业大生产的周期、以及市场竞争力，以决定工作方向。(2)成本评估，项目的规划：总投资纲要（固定资本、直接成本(土地、建筑物、保障等)、简介成本(工程、建筑、意外、酬金)、启动资金、营运资金）(3)寻找合作伙伴：技术、资金、人力、硬件支持。(4)组织攻关团队，设计研究技划：实验室工作－>工业化(5)实验室工作：①菌种筛选②摇瓶实验(优化细胞生长和产物生产的条件，主要条件有：aPH值；b.温度；c.溶氧；d.底物选择：最大和最优底物浓度e.其他条件：如限氮、限磷对于发酵结果的影响等等。为进一步放大，直至工业化提供依据。)③实验室规模的发酵(5-10L发酵罐)：发酵流程的选取Batch（一批）process；Fed-batchprocess；Continuouspr