第八章 体内中药制剂分析课件

08体内制剂第八章体内中药制剂分析08体内制剂大纲要求了解体内中药制剂分析的性质、意义和任务熟悉中药制剂在生物体内的存在状态与生物转化、生物样品内药物分析方法掌握体内中药制剂的制备方法及注意事项08体内制剂第一节概述一、体内中药制剂分析的性质二、体内中药制剂分析的目的意义三、体内中药制剂分析的任务四、体内中药制剂分析的对象五、体内中药中药制剂分析的特点08体内制剂第一节概述一、体内中药制剂分析的性质体内中药制剂分析又称体液药物分析、生物药物分析，是随着临床药学、临床药理学的发展和需要而建立起来的一门新兴学科。08体内制剂概述二、体内中药制剂分析的目的意义

研究及了解中药制剂在生物样品内的数量和质量变化，获得药物代谢动力学的各种参数、药物在生物样品内的生物转化、代谢的方式和途径等信息，从而为药品生产、临床医疗、实验研究等方面对所研究药物作出估计与评价。08体内制剂第一节概述三、体内中药制剂分析的主要任务1.分析方法学的研究2.生物体内药物浓度检测中的应用3.药代动力学研究中的应用4.生物利用度的评价08体内制剂第一节概述四、体内中药制剂分析的对象受试者：大鼠、兔、狗、猴、人分析对象：体液、器官、组织、排泄物等分析的目标：母体药物代谢产物08体内制剂第一节概述五、体内中药制剂分析的特点（掌握）1.干扰杂质多：内源性物质，如蛋白质、多肽、脂肪酸、色素、酶等；代谢物、共存药物等2.样品量少：生物体采样量受限3.药物浓度低08体内制剂第二节药物在生物体内的存在状态与生物转化一、药物在生物体内的存在状态二、药物代谢研究的意义08体内制剂第二节药物在生物体内的存在状态与生物转化一、存在状态游离药物结合药物

蛋白质结合不能透过细胞膜可逆08体内制剂第二节药物在生物体内的存在状态与生物转化二、药物代谢研究的意义了解药物进入生物体后的状态、与生物系统的相互作用，保证临床用药安全、有效研究药物的代谢途径、酶催化机制、结构与药理作用的关系，对避免药物的毒性及寻找新药具一定意义研究药物相互作用、毒性作用机制，使临床用药更加安全、合理08体内制剂第二节药物在生物体内的存在状态与生物转化1、药物代谢的器官肝脏肝微粒体中存在的药物代谢酶另外：肾、脾、肺、肠粘膜、胎盘等组织08体内制剂第二节药物在生物体内的存在状态与生物转化2、药物代谢的过程第一阶段：药物在以细胞色素P450为核心的混合功能氧化酶等催化下发生氧化、还原、水解等反应，增加极性基团、水溶性增强，活性改变第二阶段：药物与代谢物在尿苷二磷酸葡萄糖醛酸基转移酶等催化下，与葡萄糖醛酸、硫酸盐等结合，极性进一步增大，便于从尿中排泄08体内制剂第二节药物在生物体内的存在状态与生物转化举例川芎嗪：主要是氧化代谢08体内制剂第三节生物样品的制备一、选择体液或组织供体内药物分析的一般原则二、常用生物样品的种类、特点与采集三、样本的代表性四、样品的储存五、样品的预处理08体内制剂第三节生物样品的制备一、选择体液或组织供体内药物分析的一般原则：1、能够反映出浓度与药效之间的关系2、易于获得3、便于处理、适合分析4、根据不同检测目的与要求进行选取08体内制剂第三节生物样品的制备二、常用生物样品的种类、特点与采集按照生物样品的性质，生物样品可分为：均匀样品：血液、尿液、唾液、胆汁、脑脊液、淋巴液等非均匀样品：心、肝、脾、肺、脑等器官组织08体内制剂第三节生物样品的制备二、常用生物样品的种类、特点与采集（一）血样（二）尿液（三）唾液（四）胆汁（五）脏器组织08体内制剂第三节生物样品的制备（一）血样1、采血方式及评价多用静脉采血注意：将注射器内取好的血液转入试管或其他容器时，应注意勿用力压出，而应取下针头后轻推，以免血球破裂使血浆（或血清）带红色。08体内制剂第三节生物样品的制备2、全血、血浆和血清样品的制备血液自然凝结离心上层：血清（40％）下层：血细胞加抗凝剂离心上层：血浆（50％）下层：血细胞全血08体内制剂第三节生物样品的制备2.1抗凝剂的选择：肝素最常用，一般不会干扰药物分析及导致药物发生化学变化枸橼酸盐、乙二胺四乙酸（EDTA）：能与血中Ca2+结合，可能引起被测组分发生化学变化或干扰药物的测定肝素是一种含硫酸的粘多糖，常用其钠盐、钾盐，能阻止凝血酶原转化为凝血酶，抑制纤维蛋白原形成纤维蛋白，一般1ml血液需要用肝素0.1~0.2mg，血液放入有抗凝剂的试管后轻轻旋摇容器，但勿太猛烈。08体内制剂第三节生物样品的制备3.全血、血浆和血清样品的应用3.1血清和血浆可任意选用，测定方法可通用，但血浆量多应用方便，若血浆内抗凝剂对药物分析有影响，则应使用血清样品血药浓度均指血浆或血清中的药物总浓度（游离的和与血浆蛋白结合的总浓度）（微透析技术除外）08体内制剂第三节生物样品的制备3.2全血：不能很好反映药物的药理作用强度，不能作为作用部位药浓的可靠指标（血细胞中的药物暂时仅作为“储库”，失去药理作用）08体内制剂第三节生物样品的制备血样的特点：缺点：损伤性采样方式、样品量受限、抽血比较麻烦优点：可用于药物动力学、生物利用度、临床治疗药物监测08体内制剂第三节生物样品的制备（二）唾液

可用作药物浓度检测及药代动力学研究唾液中药物浓度通常与血浆浓度相关，比血浆药物浓度低收集方法：漱口后15min收集不同唾液腺分泌不同的唾液，成分不尽相同个体差异大08体内制剂第三节生物样品的制备（三）尿液用于药物剂量回收、药物肾清除率及代谢类型等研究体内中药清除主要是通过尿液排出，药物以原型、代谢物、缀合物形式排出收集方法：规定的时间内采集尿液08体内制剂第三节生物样品的制备1.特点1.1尿中药物浓度改变不直接反映血药浓度1.2尿液药物浓度较高，收集量大，但浓度变化较大，要测定一定时间内尿中药物总量，需要记录排出的尿液体积及尿药浓度1.3短时间内不能多次取样，排尿时间较难掌握及不易采集完全等缺点08体内制剂第三节生物样品的制备（四）胆汁阐明药物的胆汁排泄率及药物的体内动态特性方法：胆汁引流规定时间内收集胆汁计算累积排泄量08体内制剂第三节生物样品的制备（五）脏器组织用于研究成分在各器官、组织的分布、积蓄或代谢研究脏器组织可与成分形成强烈结合分离分析前，需预先制成1：5或1：10匀浆，提高溶剂抽提率，降低组织空白值，避免乳化08体内制剂第三节生物样品的制备三、样本的代表性1、取样条件标准化（摄取标准膳食、控制饮水量等）2、取样时间及其间隔一般在吸收相至少需要2~3个采样点，对于吸收快的血管外给药的药物，应尽量避免第一个点是峰浓度（Cmax）；在Cmax附近至少需要3个采样点；消除相需要4~6个采样点。整个采样时间至少应持续到3~5个半衰期，或持续到血药浓度为Cmax的1/10~1/2008体内制剂冷藏或冷冻1、血浆和血清：采血后及时分离（2h），短期4℃，长期-20℃2、尿样：应立即测定，否则需加防腐剂置冰箱保存3、唾液：在4℃下保存，往往需要在取样时测定pH值4、生物样品总的原则：临时解冻，解冻的样品一次测完，不能反复冷冻→解冻→冷冻(FTC)；样品应以小体积分装存放。第三节生物样品的制备08体内制剂第三节生物样品的制备

五、样品的预处理（掌握）目的1.药物从缀合物中释放，测定总浓度2.纯化、富集药物3.适应和满足测定方法要求的灵敏度4.防止对分析仪器的污染和劣化08体内制剂第三节生物样品的制备

五、样品的预处理（掌握）（一）提取方法的选择依据（二）药物的提取（三）药物的分离与净化（四）待测组分的富集（五）衍生物处理08体内制剂第三节生物样品的制备（一）提取方法的选择依据药物的理化性质药物的浓度范围药物测定的目的生物样品的类型样品处理与分析技术的关系08体内制剂第三节生物样品的制备（二）药物的提取

1、蛋白质处理：干扰分析、污染测定条件

2、缀合物水解：测定母体药物

3、水溶性强的药物：冷冻干燥，冻干后进行液－固萃取08体内制剂第三节生物样品的制备1、蛋白质处理加入与水相混溶的有机溶剂有机溶剂使蛋白质的分子内及分子间的氢键发生变化沉淀剂：乙腈（1.5倍）、甲醇（2倍）乙醇、丙酮：很难挥干浓集超速离心（10000r/min）去除90％蛋白加保护柱08体内制剂08体内制剂第三节生物样品的制备1、蛋白质处理加入中性盐蛋白质脱水沉淀沉淀剂：硫酸铵、硫酸钠、镁盐、枸橼酸盐1：290％去除超速离心（10000r/min）08体内制剂第三节生物样品的制备1、蛋白质处理加入强酸常用溶剂（与蛋白质阳离子形成不溶性盐沉淀）：10％三氯醋酸、6％高氯酸、硫酸－钨酸混合液体积比：1：0.690％去除方法：超速离心（10000r/min）08体内制剂08体内制剂第三节生物样品的制备1、蛋白质处理沸水浴超滤、透析法（游离药物浓度）08体内制剂第三节生物样品的制备2、缀合物水解含义：中药制剂待测成分或其代谢物与体内的内源性物质结合生成的产物特点：缀合物极性较母体药物大，亲水性强，不易被有机溶剂提取，需水解处理08体内制剂第三节生物样品的制备2、缀合物水解水解方法：酸水解，酶水解（葡萄糖醛酸苷酶，芳基硫酸酯酶），溶解剂趋势：直接测定缀合物的量，了解药物代谢情况08体内制剂第三节生物样品的制备3、冷冻干燥特点：适合于一次不能完成分析的大批量生物样品、水溶性样品、挥发性样品和对热不稳定的样品方法：干冰－丙酮浴、用液氮、冷冻干燥仪08体内制剂第三节生物样品的制备（三）药物的分离和净化1、液－液萃取（liquid-liquidextraction,LLE)2、液－固萃取(liquid-solidextraction,LSE)08体内制剂第三节生物样品的制备1、液－液萃取（liquid-liquidextraction,LLE)

大多数药物都是脂溶性的，内源性物质基本上都是水溶性的，当用有机溶剂萃取时，药物被萃取出来而内源性物质被除去，因此采用有机溶剂萃取法能够达到纯化的目的08体内制剂第三节生物样品的制备1、液－液萃取（liquid-liquidextraction,LLE)关键要考虑三个方面的因素：（1）有机溶剂的特性（2）有机溶剂相和水相的体积（3）水相的pH值08体内制剂第三节生物样品的制备1、液－液萃取（liquid-liquidextraction,LLE)萃取率应不低于50％影响提取率的因素：水相的PH值提取溶剂：低沸点、低毒性（乙酸乙酯）、无水Na2SO4脱水离子强度：加入氯化钠，有利于提取，减少乳化08体内制剂1、液－液萃取（liquid-liquidextraction,LLE血浆或其他生物样品加入萃取溶剂分取有机层必要时调pH值减压氮气吹干流动相溶解后进样分析08体内制剂1、液－液萃取（liquid-liquidextraction,LLE消除LLE中产生的乳化现象：1、提取前在水相中加入适量的固体食盐2、经适当转速离心消除已产生的轻微乳化3、置于冰箱中快速冻凝破坏乳化层，再融化后离心来消除已产生的严重乳化现象08体内制剂第三节生物样品的制备1、液－液萃取（liquid-liquidextraction,LLE)

离子对提取法原理：一些酸性或碱性较强的有机药物在体液中呈离解状态，成为亲水性极强的带电荷离子，控制PH值也不能抑制其解离，不能用有机溶剂将其自体液中提取出来。加入离子对试剂，使其成为具有一定脂溶性的离子对化合物，用有机溶剂将其自水相中萃取分离。08体内制剂1、液－液萃取（liquid-liquidextraction,LLE)

常用的离子对试剂及提取溶剂碱性药物：庚烷磺酸、辛烷磺酸、己烷磺酸等酸性药物：四丁基铵、四乙基铵、四辛基铵提取溶剂：氯仿、二氯甲烷08体内制剂第三节生物样品的制备2、液－固萃取（liquid-solidextraction,LSE)原理：利用固体材料作为固定相，当含多组分的生物样品溶液通过时，固定相对各组份具有不同的亲和性，一些组分受到“分配”或“吸附”作用而滞留在固定相上，当使用流动相冲洗时，由于流动相对组分的亲和性更强，随按组分洗脱的难易，将其依次携带出柱，使之达到分离。08体内制剂第三节生物样品的制备LSE与LLE相比其优点固相与体液样品接触时很少引入外源性杂质不会形成乳化现象萃取效率高，可减少生物样品的用量萃取操作可在室温进行，适于处理挥发性及对热不稳定的药物08体内制剂第三节生物样品的制备

LSE与LLE相比其缺点不同的药物应选择合适的固定相，并且应试验洗脱时间和筛选合适的洗脱系统。血浆样品反复冻凝和解冻后，会产生絮状蛋白沉淀，阻塞固相提取柱，需先离心除去后再上柱不同批号的固相之间对药物的萃取回收率有差异08体内制剂第三节生物样品的制备（四）待测组分的富集方法：挥去萃取溶剂法1.直接通入气流吹干气体：压缩空气，氮气（易氧化的被测组分）注意：1.热稳定性成分，可置于一定温度的水浴中加快挥发，溶剂吹干后立即停止通气2.避免某些组分随溶剂一起挥发损失，可加入沸点稍高的溶剂（如己醇）08体内制剂第三节生物样品的制备2.减压挥去溶剂方法：置玻璃真空干燥器内缓缓抽气适用：易随气流挥发或遇热不稳定的药物注意：注意控制减压程度和速度08体内制剂第三节生物样品的制备（五）衍生物处理注意：注意优化衍生化条件08体内制剂第四节生物样品内药物分析方法一、分析方法的设定依据二、方法建立的一般步骤三、方法的评价四、常用的定量分析方法08体内制剂第四节生物样品内药物分析方法一、分析方法的设定依据1.文献总结2.了解待测药物的特性与生物样品内状况3.明确测定目的与要求药动学参数测定：不强调简便、快速临床药物浓度检测：要求方法简便、快速08体内制剂第四节生物样品内药物分析方法二、方法建立的一般步骤1.以纯品进行测定：Rt2.空白样品测定:内源性干扰3.空白样品中添加对照品后测定4.空白样品中添加内标物后测定5.生物样品添加内标物后测定08体内制剂第四节生物样品内药物分析方法三、方法的评价（一）专属性（二）标准曲线与定量范围（三）准确度（四）精密度（五）定量下限（六）样品稳定性08体内制剂第四节生物样品内药物分析方法（一）专属性1、目的：证明所测定的物质是预期的分析物，内源性物质和其他代谢物不得干扰样品的测定。2、方法：色谱法至少要考察6个不同个体空白生物样品色谱图、空白生物样品外加对照物质色谱图（注明浓度）及用药后的生物样品色谱图。08体内制剂第四节生物样品内药物分析方法（二）标准曲线与定量范围方法：将药物对照品（实为对照品溶液）加入与供测样品相同的空白生物基质中混匀，配成已知药浓的标准品样品，然后按照样品预处理的方法进行处理后测定，将响应值与药浓建立标准曲线使标准样品与供测样品均处于相同的生物基质环境中，按相同方法平行处理和测定，将所有样品中的药物及标准曲线各浓度标准样品中的药物均按相同比例表现为响应值08体内制剂第四节生物样品内药物分析方法（二）标准曲线与定量范围注意：1.标准曲线高低浓度范围为定量范围，在定量范围内浓度测定结果应达到试验要求的精密度和准确度。2.用至少5个浓度建立标准曲线，定量范围要能覆盖全部待测浓度，不允许将定量范围外推求算未知样品的浓度。3.建立标准曲线时应随行空白生物样品，但计算时不包括该点。08体内制剂第四节生物样品内药物分析方法（三）准确度方法：将已知量的药物纯品加到空白样品中经过一系列的处理、测定，所得药物量与加入量之比值得百分率即为回收率注意：每次测定所得回收率要保持恒定、重现性好分类：绝对回收率和方法回收率08体内制剂第四节生物样品内药物分析方法1.绝对回收率：又称萃取回收率、提取回收率,反映一个方法的萃取效率高、中、低三种浓度吹干吹干甲乙+空白体液+混匀+有机溶剂萃取取萃取液，吹干+有机溶剂溶解+有机溶剂溶解分析分析结果比较08体内制剂第四节生物样品内药物分析方法1.绝对回收率：高、中、低浓度的选择：低浓度选择在定量下限附近，其浓度在定量下限的3倍以内；高浓度接近于标准曲线的上限；中间选一个浓度。每一浓度每批至少测定5个样品。相对标准差一般应小于15%，在定量下限附近相对标准差应小于20%。绝对回收率数据要求：≥50％08体内制剂第四节生物样品内药物分析方法2.方法回收率：又称为相对回收率加样回收实验法

R＝(M-P)/A×100％

85％~115%(样品药浓≥200µg/L)80％~120％（样品药浓＜200µg/L）考察加入药物量在真实样品中的回收率，因此加入药物量应有高、中、低三种，而含药物的真实样品则可仅使用一种浓度，应将该浓度样品事先测定3~5次后取均值，作为原药量p，然后加入高、中、低不同量的药物标准品溶液。08体内制剂第四节生物样品内药物分析方法（三）准确度绝对回收率和方法回收率的区别：方法回收率：表示分析方法的准确度，加样回收实验萃取回收率：指经预处理后能将生物样品中的药物用于分析的比例08体内制剂第四节生物样品内药物分析方法（四）精密度1、方法：要求选择3个浓度的质控样品（含药物的真实样品）同时进行方法的精密度和准确度考察。低浓度选择在定量下限附近，其浓度在定量下限的3倍以内；高浓度接近于标准曲线的上限；中间选一个浓度。每一浓度每批至少测定5个样品。2、内容：日内精密度和日间精密度08体内制剂第四节生物样品内药物分析方法2.1日内精密度：考察分析方法在短期内的变异情况2.2日间精密度：考察样品测定时使用的标准曲线、仪器性能、试剂来源，以及环境条件等都可能有微小变化，从而导致分析结果的变异程度。08体内制剂第四节生物样品内药物分析方法2.3进行日间精密度的方法：可使用日内精密度测定时使用的三种药浓样品，在一周内不同日分别测定3~5次，计算RSD。3.精密度数据要求：一般可控制在RSD≤15％08体内制剂第四节生物样品内药物分析方法（五）定量限定量下限是标准曲线上的最低浓度点，要求至少能满足测定3~5个半衰期时样品中的药物浓度，或Cmax的1/10~1/20时的药物浓度，其准确度应在真实浓度的80%~120%范围内，RSD应小于20%。应由至少