生物学案：课堂探究专题课题多聚酶链式反应扩增DNA片段

学必求其心得，业必贵于专精学必求其心得，业必贵于专精学必求其心得，业必贵于专精课堂探究探究点一DNA复制与体外扩增的比较·问题导引·河南安阳“曹操墓”自发掘以来备受争议,为此，复旦大学进行DNA检测。儿子能完整地继承父亲的Y染色体，男性有着与父系祖先相同的基因密码.只要检测足够多的曹姓男子DNA，课题组便可以找到曹姓家族应有的独特“密码”，然后和“曹操墓”出土人骨DNA中的Y染色体对比验证。在这个过程中对采集的DNA样本如何扩增？提示：应用PCR技术.·名师精讲·DNA复制PCR不同点场所细胞内细胞外能量ATP提供能量不需ATP提供能量酶解旋酶、DNA聚合酶耐高温的TaqDNA聚合酶是否有转录伴有转录，产生引物无转录，需加入两种引物特点边解旋边复制，半保留复制体外迅速扩增循环次数受生物体自身控制30多次缓冲液不需要需要人为控制设备无严格控制温度变化的温控设备相同点原料四种脱氧核苷酸复制原理严格遵循碱基互补配对原则模板DNA为模板引物都需要与模板相结合的引物【例题1】PCR过程与细胞内的DNA复制过程相比,主要有两点不同，它们是(）①PCR过程需要的引物是人工合成的DNA单链②PCR过程不需要DNA聚合酶③PCR过程中DNA的解旋不依靠解旋酶，而是通过对反应温度的控制来实现的④PCR过程中，DNA不需要解旋，直接以双链DNA为模板进行复制A．①④ B．①③ C．②③ D．②④解析：PCR过程与细胞内的DNA复制过程相比，主要有两点不同：第一,PCR过程需要的引物不是RNA，而是人工合成的DNA单链，其长度通常为20～30个脱氧核苷酸;第二，PCR过程中DNA的解旋不依靠解旋酶，而是通过对反应温度的控制来实现的。答案：B方法点拨PCR利用了DNA的热变性原理,通过控制温度来控制双链的解聚与结合.PCR反应需要在一定的缓冲溶液中才能进行，需提供DNA模板、分别与两条模板链相结合的两种引物、四种脱氧核苷酸、耐热的DNA聚合酶，同时通过控制温度使DNA复制在体外反复进行.探究点二PCR反应过程·问题导引·PCR反应一般经历多少次循环？每次循环有几个环节？提示：一般经历30多次循环，每次循环经历变性、复性、延伸三步.·名师精讲·1．过程（1）变性:当温度上升到90℃以上时，双链DNA模板在热作用下，氢键断裂，形成单链DNA。(2)复性：当温度下降到50℃左右时,系统温度降低，两种引物通过碱基互补配对原则与两条单链DNA结合,形成局部双链。DNA双链单链（3)延伸:温度上升到72℃左右，在TaqDNA聚合酶的作用下，以溶液中的四种脱氧核苷酸为原料，从引物的3′端开始延伸，根据碱基互补配对原则合成与模板链互补的DNA链。2．PCR反应过程图解【例题2】PCR一般要经过三十多次循环，从第二轮循环开始，上一次循环的产物也作为模板参与反应，由引物Ⅰ延伸而成的DNA单链作模板时（)A．仍与引物Ⅰ结合进行DNA子链的延伸B．与引物Ⅱ结合进行DNA子链的延伸C．同时与引物Ⅰ和引物Ⅱ结合进行子链的延伸D．无需与引物结合,在酶的作用下从头合成子链解析:考查对PCR反应中的变性、复性、延伸的实质是否理解.当由引物Ⅰ延伸而成的DNA单链作模板时，此单链引物固定端为5′端，因此与它互补的子链应从另一端开始合成，即与引物Ⅱ结合延伸DNA子链。答案：B探究点三PCR反应过程·问题导引·若只有一个DNA分子,扩增n次后得到多少个DNA片段？N0个DNA分子呢？提示:理论上DNA扩增呈指数扩增。若只有一个DNA提供模板，则复制n次后有2n个DNA；若开始有N0个DNA，则复制n次后获得的子代DNA数目为N0·2n个.·名师精讲·1．操作步骤（1)准备：按PCR反应体系的配方将所需试剂摆放在实验台上。（2）移液：用微量移液器按配方向微量离心管中加入各组分.（3）混合：盖严离心管的盖子，防止实验中脱落或液体外溢，用手指轻弹管壁，使反应液混合均匀。（4）离心：将微量离心管放在微量离心机上，离心约10s，使反应液集中在试管底部，提高反应效果。(5）反应：将离心管放入PCR仪中，设置程序进行反应。2．结果分析与评价(1）理论上DNA扩增数目的计算。DNA扩增与DNA复制类似，呈指数扩增。若只有一条DNA模板链，则复制n次后有2n条脱氧核苷酸链；若一开始有a条模板链，则复制n次后有a×2n条脱氧核苷酸链。(2）实验中DNA含量的测定.DNA在260nm的紫外线波段有一强烈的吸收峰，峰值的大小与DNA的含量有关。可以利用DNA这一特点进行DNA含量的测定，具体方法如下：①稀释：2μLPCR反应液,加入98μL蒸馏水，即将样品进行50倍稀释↓②对照调零：以蒸馏水作为空白对照,在波长260nm处，将紫外分光光度计的读数调节至零↓③测定：取DNA稀释液100μL至比色杯中,测定260nm处的光吸收值↓④计算：DNA含量(μg/mL）＝50×（260nm的读数)×稀释倍数【例题3】下列操作过程的叙述中错误的是()A．PCR实验中使用的微量离心管、枪头、缓冲液以及蒸馏水等在使用前必须进行高压灭菌B．PCR所用的缓冲液和酶应分装成小份，并在－20℃储存C．PCR所用的缓冲液和酶从冰箱拿出之后，迅速融化D．在微量离心管中添加反应成分时，每吸取一种试剂后，移液器上的枪头都必须更换解析：为了防止外源DNA等因素的污染，PCR实验中使用的微量离心管、枪头、缓冲液以及蒸馏水等在使用前必须进行高压灭菌;所用的缓冲液及酶应分装成小份保存,并使用一次性枪头。即A、B、D三项均正确.在冰箱中放置的缓冲液和酶从冰箱中取出后应放在冰块上缓慢融化，而不能迅速融化，C项错误。答案：C方法点拨（1)避免外源DNA污染：所用仪器、缓冲液、蒸馏水等使用前高压灭菌。（2）缓冲液和酶分装成小份,－20℃低温保存。（3）每添加一种反应成分，都要更换一个移液器的枪头。（4）混匀后离心处理，使反应液集中在离心管底部。变式训练PCR实验中使用的微量