生物学案：课堂互动基因工程的基本操作程序

学必求其心得，业必贵于专精学必求其心得，业必贵于专精学必求其心得，业必贵于专精课堂互动三点剖析一、目的基因的获取1.从基因文库中获取目的基因（1）基因文库：将含有某种生物不同基因的许多DNA片段,导入受体菌的群体中储存，各个受体菌分别含有这种生物的不同基因，称为基因文库。（2）生物基因组文库和cDNA文库的区别如下：文库类型cDNA文库基因组文库文库大小小大基因中启动子(具有启动作用的DNA片段）无有基因中内含子（位于编码蛋白质序列内的非编码DNA片段）无有基因多少某种生物的部分基因某种生物的全部基因物种间的基因交流可以部分基因可以(3）目的基因的获取根据基因的有关信息：基因的核苷酸序列、基因在染色体上的位置、基因的转录产物mRNA、基因的翻译产物蛋白质等获取目的基因。2。利用PCR技术扩增目的基因PCR技术是利用DNA双链复制的原理，将基因的核苷酸序列不断地加以复制，使其数量呈指数方式增加.利用PCR技术获取目的基因的前提,是要有一段已知目的基因的核苷酸序列，以便根据这一序列合成引物。扩增的过程是：目的基因DNA受热变性后解链为单链，引物与单链相应互补序列结合，然后在DNA聚合酶作用下进行延伸，如此重复循环多次。上述过程可以在PCR扩增仪中自动完成。3。人工合成目的基因人工合成目的基因的两种方法比较方法过程优点缺点反转录法mRNA→单链DNA→双链DNA专一性强，目的基因中不含不表达部分操作过程麻烦，mRNA生存时间短,技术要求高据已知氨基酸序列合成据推测出的核苷酸序列,通过化学方法合成专一性强，目的基因中不含不表达部分，可合成自然界不存在的基因目前复杂的尚不存在的基因不能合成二、基因表达载体基因表达载体的组成：1.目的基因外源DNA分子的有效片段。2。启动子一段有特殊结构的DNA片段,位于基因的首端，它是RNA聚合酶识别和结合部位，有了它才能驱动基因转录出mRNA,最终获得所需的蛋白质。3。终止子位于基因的尾端，也是一段有特殊结构的DNA短片段.终止子相当于一盏红色信号灯，使转录到此终止。4。标记基因鉴别受体细胞中是否含有目的基因，从而将含有目的基因的细胞筛选出来,如抗生素基因就可以作为这种基因.拓展延伸由于受体细胞有植物、动物、微生物之分,以及目的基因导入受体细胞的方法不同，因此，基因表达载体的构建上也会有所差别，不可能是千篇一律的。三、目的基因的检测与鉴定1.检测转基因生物的染色体DNA上是否插入目的基因,检测方法是DNA与DNA分子杂交法。基本做法：第一步，将受体生物DNA提取出来,经过适当的酶切后，用一定的方法，将不同大小的片段分开；第二步，将DNA片段转移到硝酸纤维素膜上;第三步,用标记了放射性同位素的目的DNA片段作为探针与硝酸纤维素膜上的DNA进行杂交；第四步，将X光底片压在硝酸纤维素膜上，在暗处使底片感光；第五步，将X光底片冲洗，如果在底片上出现黑色条带,则表明受体植物染色体DNA上有目的基因。2。检测目的基因是否转录出mRNA，检测方法是DNA与RNA分子杂交法，具体做法和DNA与DNA分子杂交法相同，只是从转基因生物中提取的是mRNA而不是DNA，同样需要用标记的目的基因作探针,与mRNA杂交，如果X光底片上出现杂交带（黑色条带）,则表明目的基因转录出了mRNA。3.检测目的基因是否翻译成蛋白质，方法与上述方法不相同，而是进行抗原—抗体杂交。具体做法：第一步，将目的基因在大肠杆菌中表达出蛋白质；第二步，将表达出的蛋白质注射给动物进行免疫，产生相应的抗体，并提取出抗体；第三步，从转基因生物中提取蛋白质,进行凝胶电泳；第四步，将凝胶中的蛋白质转移到硝酸纤维素膜上;第五步，将抗体与硝酸纤维素膜上的蛋白质杂交，这时抗体与目的基因表达的蛋白质（抗原）会特异性结合。由于这种抗原-抗体的结合显示不出杂交条带，所以需加入一种称为二抗的抗体，它可以和前面的抗体结合,二抗抗体上带有特殊的标记.如果目的基因表达出了蛋白质,则结果为阳性。学以致用【例1】（2007山东临沂模拟）有关目的基因的获取的理解,不正确的是（）A。目的基因可以从自然界中分离，也可以人工合成B。目的基因主要指编码蛋白质的结构基因C.基因文库就是基因组文库D。cDNA文库只含有某种生物的一部分基因解析：基因文库有基因组文库和部分基因文库。基因组文库很大,包括该种生物所有的基因。部分基因文库较小，只包含了一种生物的一部分基因。答案：C【例2】（2007山东东营模拟）从基因文库中获取目的基因的根据是()A。基因的核苷酸序列B.基因的功能C.基因的转录产物MrnaD.以上都是解析:从基因文库中获取目的基因是一件很复杂的事情，简单点说就是根据目的基因的有关信息，如基因的核苷酸序列、功能、转录产物mRNA等来获取目的基因。答案：D【例3】下列获取目的基因的方法中需要模板链的是(）①从基因文库中获取目的基因②利用PCR技术扩增目的基因③反转录法④通过DNA合成仪利用化学方法人工合成A.①②③④B.①②③C。②③④D.②③解析：PCR利用的是DNA双链复制原理。即将双链DNA之间的氢键打开，变成单链DNA,作为聚合反应的模板.反转录法则是以目的基因转录成的信使RNA为模板,在逆转录酶的作用下,先反转录形成互补的单链DNA，再合成双链的DNA.①④则均不需要模板。答案：D【例4】用反转录法合成目的基因的方法中需要的条件有（）①DNA的一条链为模板②RNA为模板③四种脱氧核苷酸④四种核糖核苷酸⑤转录酶⑥逆转录酶A.①②③④⑤B。①③⑥C。②③⑥D.①③⑤解析:用逆转录法合成目的基因时，要以mRNA为模板,以四种脱氧核苷酸为原料,在逆转录酶作用下才能合成DNA.答案：C【例5】在基因表达载体的构建中，下列说法不正确的是()①一个表达载体的组成包括目的基因、启动子、终止子②有了启动子才能驱动基因转录出mRNA③终止子的作用是使转录在相应地方停止④所有基因表达载体的构建是完全相同的A.②③B。①④C。①②D.③④解析：一个基因表达载体的组成包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等。标记基因用于鉴别受体细胞中是否含目的基因.由于受体细胞的种类不同，目的基因导入受体细胞的方法不同，基因表达载体的构建不可能完全相同。答案：B【例6】目的基因导入受体细胞后，是否可以稳定维持和表达其遗传特性，只有通过鉴定和检测才能知道。下列属于目的基因检测和鉴定的是（)①检测受体细胞是否有目的基因②检测受体细胞是否有致病基因③检测目的基因是否转录mRNA④检测目的基因是否翻译蛋白质A.①②③B。②③④C.①③④D。①②④解析：目的基因的检测包括：检测转基因生物的染色体DNA上是否插入了目的基因,方法是用DNA探针,使DNA探针与基因组DNA杂交。检测目的基因是否转录出了mRNA,方法是用基因探针与mRNA杂交.最后，检测目的基因是否翻译了蛋白质，方法是进行抗原-抗体杂交。答案:C【例7】苏云金芽孢杆菌的抗虫基因导入棉花植株