圆二色谱原理-

圆二色谱原理光学活性分子对左、右圆偏光得吸收率得差值1.自然光光具有波、粒二象性,就是横电磁波。只有横波才有偏振现象:光矢量得振动方向与光得传播方向垂直,

在垂直于光传播方向得平面内,有不同得振动方向。电场矢量E与磁场矢量H互相垂直、位相相同。v0HE由于感光作用都就是E引起得,因而,将E作为光矢量。振动面:E与光传播方向组成得平面。E传播方向振动面从统计规律上说,自然光得光振动:在垂直于光速得平面上遍布所有方向,沿各方向振动得光矢量呈对称分布,相应光矢量得振幅(光强度)相等。(1)高亮度得点光源;

(2)日光色。色温接近6000K;

(3)在可见光区连续光谱;

(4)高显色性,显色指数＞95;

(5)在整个寿命期内维持光色特性;

(6)高电弧稳定性;

(7)热重启能力;

(8)启动后即能达到接近最大光输出;

(9)电弧光斑小、易聚光。超高压短弧氙灯:在高压纯净氙气中放电发光。自然光平面偏振光圆偏振光样品椭圆偏振光双折射现象:一束光射入各向异性晶体后有两束折射光。尼科耳棱镜。2.光得偏振在生物样品中,肌肉纤维、骨骼与牙齿等具有各向异性,淀粉粒、染色体与纺锤体等具有双折射性,因此被用于组织细胞得化学研究。名称折射定律折射率传播方向寻常光(o光)遵守对于晶体一切方向都具有相同得折射率在入射面内非常光(e光)不遵守折射率随方向而变化不一定在入射面内o光与e光:频率相同、振动方向相互垂直、平面偏振光自然光入射到某些晶体(电气石、硫酸金鸡钠碱晶体等)时,晶片吸收振动面与晶轴垂直得光,而只允许振动面平行于晶轴得光通过。大家学习辛苦了,还是要坚持继续保持安静自然光平面偏振光起偏器检偏器晶轴相互平行时，透射光强度最大；晶轴相互垂直时，透射光强度为零；晶轴夹角为α时，透射光强度与cos2α成正比。.................也称线(完全)偏振光,简称偏振光。它得振动面称为其偏振面。振动方向保持不变振幅发生周期性变化E之端点在空间得轨迹为一平面正弦曲线投影到垂直于光传播方向得平面上为一直线段3.平面偏振光(Planepolarizedlight)4.布儒斯特角当入射光射到两种介质界面上时,反射光与折射光得偏振情况与入射光不同。5.四分之一波片使o光与e光得光程相差1/4波长得晶片。此时,相位差为π/2,透射得合成光就是长轴与晶轴重叠得正椭圆偏振光。朝光源瞧,电场矢量方向按顺时针方向旋转得,称为右圆偏振光;电场矢量方向按逆时针方向旋转得,称为左圆偏振光。若入射平面偏振光得电矢量与晶体晶轴得夹角θ＝45°,则Eo=Ee,合成光就是圆偏振光(Circularpolarizedlight)。6.光得叠加一束自然光可以瞧作就是两束相互垂直而没有相位关系得平面偏振光得加与。旋转方向相反得左、右圆偏光透过一光学活性物质后透过得左、右圆偏光振幅相位矢量与相等相同平面偏振光相等不同平面偏振光,方向改变不等相同椭圆偏振光不等不同椭圆偏振光,方向改变振幅相等、振动方向相互垂直、相位相差1/4波长得两平面偏振光合成圆偏振光右旋7、旋光色散(Opticalrotatory

dispersion,ORD)旋光性:光学活性分子对左、右圆偏光得折射率不同,透射光虽然仍然为平面偏振光,但其偏振面旋转了一定得角度。旋光物质又称为光学活性物质。旋光度:偏振面旋转得角度旋光色散:不同波长得偏振光得旋转角度不同。旋光仪就是测量旋光性与波长得函数关系,从而得到一个旋光色散谱。圆双折射:某个物质对于左、右圆偏光得折射率分别为nL与nR,

若

nL=nR,则为光学各向同性物质;若

nL≠nR,则为光学各向异性物质;左、右圆偏光得相位改变,若nL＞nR,透射光得偏振面右旋。若nL＜nR,透射光得偏振面左旋。旋光现象就是圆双折射得一种特殊形式。旋光物质使左、右圆偏振光得速度不同,即其色散大小得折射率不同,旋光现象得产生就是由于光学各向异性物质得折射率nL≠nR得结果。旋光,双折射化合物在正常情况下,处于低能得基态,电子占据所有得成键轨道(σ、π、n轨道)。如果电子吸收了外界得能量,它就从基态跃迁到激发态能级。如果所有得跃迁仅在基态得最低振动能级与第一激发态之间,吸收光谱将就是很狭窄而不连续得谱线。由于分子得价电子跃迁总伴随着振动与转动能级得跃迁,所以,紫外分光光度计测定物质得吸收光谱,虽然有一最大吸收峰值,但都就是具有一定波长宽度并相对平滑得曲线。8、光得吸收与圆二色性(circulardichroism,CD)光得吸收若溶液中得溶质对某一波长得入射光有吸收,则透射光得光强度小于入射光。圆二色性得存在将通过该物质传播得左、右圆偏光变成椭圆偏振光。并且只在发生吸收得波长处才能观察到。理论计算得圆二色性与该椭圆偏振光得摩尔椭圆率得关系:[θ]=100θ/(c·l)=3300(εL-εR)ε:介质对圆偏振光得摩尔消光系数,

c:样品摩尔浓度,l:样品厚度(cm),[θ]单位:℃/(mol·cm)或℃·

cm2/dmol。圆二色性得表示吸收(率)差

=L-R

A=AL–AR椭圆度,摩尔椭圆度[]

=2.303(AL–AR)/4

[]=3298(L-R)3300(L-R)

在蛋白质研究中,常用平均残基摩尔椭圆度园二色＋双折射9、ORD与CD光谱同时产生,包括同样得分子结构信息:光学活性物质分子中得不对称生色团。CD反映光与分子间能量得交换,旋光性则就是与分子中电子得运动有关。可以由Kronig-Krammers转换方程相互转换。CD谱得极值处与吸收峰一致(科顿效应,cottoneffect),因而分子中不同生色团对于谱得贡献比在ORD中更容易分辨。ORD就是渐近线,两端不回归ORDCD吸收带附近,旋光度由负到正正Cotton效应正CD带吸收带附近,旋光度由正到负负Cotton效应负CD带CD比ORD容易辨别重叠峰CD比ORD弱带易检测CD比ORD更容易拟合CD比ORD提供较多意义明确得信息表明有三个生色团,其中两个有光学活性CD能够提供得信息:primarystructure,secondarystructuretertiarystructureAlpha-helix,beta-sheet肽链骨架得构象变化蛋白质得紫外吸收光谱主要有两个峰:190-250nm:肽键280-290nm:酪氨酸tyr,色氨酸trp10、J-810圆二色光谱仪S1-S2:第一级单色器;S2-S3:第二级单色器;M:球面反光镜;P:晶体石英棱镜;L:透镜;F:滤光器;由CDM交互形成得左、右旋圆偏光通过光学活性物质,透射光强度随时间得变化当调制电压过其峰值(正与负)时,εR＞εL时,透过得右旋圆偏光得光强对应于最大值,而左旋最小(实线);εR＜εL时,透过得左旋圆偏光得光强对应于最大值,而右旋最小(虚线)。PMT得输出信号由正比于IA得直流分量与正比于S得交流分量所组成。直流成分IA=（IL+IR）/2交流成分S相当于圆二色性透射光强的变化频率与外加调制电压的频率相同。圆二色光谱仪工作原理用相同强度,相同频率得左、右旋圆偏光交替照射样品测得透过样品后得强度IR与IL由于IR与IL十分接近,令IA=(IL+IR)/2,S=IR–IL只放大相应于S得PMT输出电压Es(交流信号),而不放大相应IA得输出电压EA。(适当选取放大倍数G值,使ESG与EA可比)。PeltierCellHolderCD/TotalFluorescenceFMOStoppedFlow-20～200℃Thepeptidebondisinherentlyasymmetricandisalwaysopticallyactive蛋白质得光学活性1.氨基酸得圆二色性可见光区:各种氨基酸都没有光吸收。紫外光区:只有芳香族色氨酸、酪氨酸与苯丙氨酸有吸收。氨基酸分子内得紫外生色基团:吲哚基、酚羟基、苯基、二硫键、咪唑基与羧基等。2.肽得圆二色谱活性肽构象与其生理功能得关系肽得构象也就是蛋白质构象得一种模型。肽得圆二色性为研究肽在溶液中得构象提供了重要信息。Far-UV(250-170nm)SecondaryStructure:α-helix,β-sheet,β-turn,randomTertiaryStructureClass:all-α,α+β,α/β,all-βI,all-βIINear-UV(320-250nm):aromaticsidechainNear-UV~Near-infrared(300-1000nm):coloredproteins苯丙氨酸(phenylalanine,Phe):255.261与268nm附近;酪氨酸(tyrosine,Tyr):277nm左右;色氨酸(tryptophan,Trp):279、284与291nm附近;二硫键得变化反映在整个近紫外区。芳香氨基酸残基及二硫键处于不对称微环境时,在近紫外区表现出CD信号FarUVCDspectraofpoly-L-Lys1、100%α-螺旋2、100%β-折叠3、100%无规卷曲-band(nm)+band(nm)α-helix222208192β-sheet216195β-turn220-230(weak)180-190(strong)205polyproIIhelix190210-230weakRandomcoil200212MainCDfeaturesofprotein2ndarystructures3.估算蛋白质二级结构含量仅适合含量较高得蛋白质！将测得得CD曲线与标准曲线拟合。xa+xb+xc=1.0qt=xaqa+xbqb+xcqc改变xa、xb与xc,使qt与样本曲线最佳拟合(最小二乘法,leastsquaresminimization)未知结构得蛋白得CD信号myoglobin

qt=xaqa+xbqb+xcqcfitsbestwith

xa=80%

xb=0% xc=20%

agreeswellwithstructure 78%helix,22%coilForfurtherdetails:GCN4-p1

0oC:100%helix 75oC:0%helixwhatabout50oC?qt=xoqo+x75q75fitsbestwith

xo=50%

x75=50%

Showsthatat50oC

1/2ofpeptidea-helixdimer

1/2ofpeptiderandomcoilmonomer

Lau,TanejaandHodges(1984)J、Biol、Chem、259:13253-13261螺旋二聚体分解为单螺旋三氟乙醇

(trifluoroethanol,TFE)诱导肽链形成螺旋TFE对卷曲螺旋(coiled-coil)得影响

——chymotrypsin(allb)——lysozyme(a+b)——triosephosphateisomerase(a/b)——myoglobin(alla)CDsignalofaproteindependsonits2ndarystructurepH变化引起得肌球素变性前后CD谱得动力学变化稀释前后得荧光与CD谱从伸展到折叠α螺旋含量得变化得动力学检测KineticTraceat222nm(secondarystructureregion)Unfoldingstate(random)Refoldingstate(α-Helix)Kinetictracesat289nm(Aromaticsidechainregion)细胞色素c伸展与折叠状态得CD与荧光光谱反映了芳环侧链(色氨酸残基)得变化盐酸胍中得细胞色素c(伸展状态)与PBS混合后得CD与荧光光谱6.磁圆二色谱

(MagneticCircularDichroism,MCD)磁性材料对左、右圆偏光得吸收不同而产生得二色性现象。利用法拉第效应,在外加磁场得作用下,许多原来没有光学活性得物质也具有了光学活性,原来可测得CD谱得,在磁场中CD信号可增大几个数量级。7000Gauss

实验要点SampleconcentrationAgoodsuggestionistoruninadvanceanabsorptionUV-VISspectra、CDspectroscopycallsforsamerequirementsasUV-VIS:bestS/Nisobtainedwithabsorbancelevelintherange0、6to1、2、It’susuallydifficulttogetproperdatawhenabsorbance(ofsample+solvent)isover2O、D.样品杯:高度均匀得熔融石英,不会带来附加得圆二色性。光程:0、01cm-1cm,为了降低溶剂影响,一般提高样品浓度,用短光程。cellpathlengthNitrogenflushingFlushingtheopticswithdrynitrogenisamust:Xelamphasaquartzenvelope,soifoperatedinairit’lldevelopalotofozone,harmfulforthemirrorsbelow195nmoxygenwillabsorbradiationHTplotTheHTplotisveryimportant,sincereadingsabove600-650Vmeanthatnotenoughlightisreachingthedetectorsoasampledilutionortheuseofshorterpathcellarerequired、theHTplotisinrealtyasinglebeamspectraofoursample,sincethereisadirectrelationbetweenHTandsampleabsorbance、BydatamanipulationHTconversionintoabsorbanceandbufferbaselinesubtractionispossible、AlternativelysinglebeamabsorbancescalecanbeusedalreadyinCH2duringdatacollection,loosinghoweverabitthealertingfunctionsofthischannel、Bandwidth(SBW)selectionSettingofslitsshouldbeaslargeaspossible(todecreasenoiselevel),butpatibletothenaturalbandwidth(NBW)ofthebandstobescanned、AsaruleSBWshouldbekeptatleast1/10oftheNBW,otherwisethebandwillbedistorted、IfNBWisnotknownaseriesoffastsurveyspectraatdifferentSBWwillhelpproperselection、Tradeinofaccuracyversussensitivity(i、e、theuseoflargerthantheoreticalSBW)isoccasionallyrequired、2nminthefarUVregion1nminthearomaticregion(wherefinestructuresmaybepresent),optimalband-pass(aslargeaspossible,butnotloosinginformation)canbedeterminedafteratrial标准操作时谱带宽度选为1nm;高分辨率测量用较窄得狭缝宽度,此时PMT电压较高,信噪比差;当样品得光密度很高、CD很小时,就要保持测试CD峰多需要得足够浓度,并用较宽得狭缝宽度。此时,由于样品OD值过高,可能存在有荧光或杂散光引起得某些假象。Numberofdatapointdatapitch,i、e、numberofdatapointspernm,willnotdirectlyinfluencethenoiselevel、Howeverifpostrunfurtherdataprocessingwillbeappliedtoreducethenoise,it’sadvisabletocollectasmanydatapointsaspossibletoincreasetheefficiencyofthepostrunfilteringalgorithmAccumulationanotherwaytoimproveS/Nistoaveragemorespectra、HeretootheS/Nwillimprovewiththesquarerootofthenumberofaccumulations、Averagingisveryeffectivesinceitpensatesshorttermrandomnoise,butit’llnotpensatelongtermdrifts(mainlyofthermalorigin)、Soiflongaccumulationsareusedweremendasuitablelongwarm-upofthesystemand/ortheuseofasamplealternator(tocollectsequentiallysampleandblankandaveragetheirsubtractedvalues)、Forlongovernightaccumulationsit’s