cart细胞培养标准操作流程

cart细胞培养标准操作流程CAR-T细胞培养标准操作流程一、制定目的及范围CAR-T细胞治疗是一种新兴的细胞免疫疗法，通过对患者自身T细胞进行基因工程改造，以识别并消灭癌细胞。为了提高CAR-T细胞的培养效率和质量，确保实验的reproducibility，特制定本操作流程。本流程适用于研究机构、医院及制药企业的CAR-T细胞培养。二、培养准备工作在进行CAR-T细胞培养之前，需进行充分的准备工作，以确保培养过程的顺利进行。首先，需确认所有的实验材料和设备均已准备齐全，包括但不限于：培养基、细胞培养器、离心机、无菌操作台、冻存管、培养瓶等。其次，准备细胞因子，如IL-2、IL-7、IL-15等，这些因子在细胞扩增和活化过程中起到重要作用。三、细胞采集与处理细胞的采集和处理是CAR-T细胞培养的关键步骤。通常，T细胞通过外周血单核细胞（PBMC）分离获得。具体步骤如下：1.采血：从患者或供体处采集外周血，通常采集500毫升至1升的全血。2.离心分离：将采集的全血置于离心机中，进行密度梯度离心，分离出单核细胞层。3.细胞洗涤：将分离获得的单核细胞用PBS缓冲液洗涤，去除血浆和密度梯度介质。4.细胞计数与活性检测：使用细胞计数板和台盼蓝染色法测定细胞的浓度和活性，确保细胞质量符合实验要求。四、细胞激活与转染细胞激活和转染是CAR-T细胞培养的重要环节，通常使用抗CD3/CD28抗体和病毒载体进行细胞的激活和基因转染。1.细胞激活：将洗涤后的T细胞以适当的细胞浓度（约1×10^6cells/mL）接种到培养瓶中。加入抗CD3/CD28抗体，通常推荐使用的浓度为每毫升细胞悬液中添加1-2微克的抗体。培养基中加入细胞因子（如IL-2），以促进细胞的增殖和活化。2.转染：在细胞激活后48小时，使用病毒载体进行基因转染。可以选择慢病毒或腺病毒载体，根据实验目的和细胞特性选择合适的转染方法。转染后继续培养细胞，通常需要在相同的培养条件下培养72小时，以便基因表达。五、细胞扩增在完成激活和转染后，细胞需要进行扩增，以达到所需的细胞数量。1.培养条件：将转染后的细胞转移至大型培养瓶或摇床中，在37°C、5%CO₂的条件下进行培养。2.培养基更换：每2-3天更换培养基，保持细胞的最佳生长环境。更换时注意轻柔操作，避免细胞脱落。3.细胞监测：定期观察细胞的生长状态，记录细胞的形态和增殖情况。六、细胞冻存培养至所需细胞数量后，需将细胞进行冻存，以便后续使用。1.细胞收集：将培养瓶中的细胞收集，进行离心，去除培养基。2.细胞重悬：将细胞重悬于冻存液中，冻存液通常由DMSO和FBS制成，比例为10%DMSO和90%FBS。3.冻存：将重悬后的细胞分装到冻存管中，逐管放入-80°C冰箱中，待细胞充分冷却后，再转移至液氮罐中保存。七、细胞复苏与验证冻存细胞在使用前需进行复苏和验证，确保细胞质量。1.细胞复苏：将冻存管从液氮罐中取出，在37°C水浴中迅速解冻。2.细胞洗涤：将复苏后的细胞用预先准备好的培养基洗涤，去除DMSO等有害物质。3.细胞计数与活性检测：复苏后的细胞需再次检测细胞计数和活性，确保细胞恢复良好。4.功能验证：可以进行细胞增殖、细胞毒性及细胞因子分泌等功能实验，以验证CAR-T细胞的功能。八、文档记录与反馈在整个CAR-T细胞培养过程中，需保持详细的记录，以便于后续分析和改进。1.记录内容：包括细胞来源、培养条件、细胞状态、实验数据等，确保记录的完整性和准确性。2.反馈机制：定期对培养过程进行评估，总结经验教训，提出改进意见，以优化未来的培养流程。九、注意事项与安全规范在进行CAR-T细胞培养过程中，需遵循相应的实验室安全规范，确保操作的安全性。1.无菌操作：在整个培养过程中，需保持无菌环境，使用无菌器材和试剂，避免污染。2.生物安全：对来源于患者的细胞样本，应遵循生物安全相关法规，妥善处理实验废弃物。3.实验