农用基质中芸薹根肿病菌检测技术规程

1DB××××-××××农用基质中芸薹根肿病菌检测技术规程本文件规定了上海地区农用基质中芸薹根肿病菌检测技术方法及流程。本文件适用于上海地区农用基质中携带芸薹根肿病菌的检测。2规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法NY/T2118蔬菜育苗基质。NY525有机肥料3术语和定义下列术语和定义适用于本文本。3.1基质（substrate）基质的定义参照NY/T2118，能够代替土壤，为栽培作物提供适宜养分和pH，具备良好的保水、保肥、通气性能和根系固着力的混合轻质材料，组分包括草炭、蛭石、珍珠岩、木屑、作物秸秆、畜禽粪便、树皮和菌渣等。3.2根肿病(clubroot)由芸苔根肿菌引致的十字花科（Cruciferae）植物病害，植株受害后在根部形成大小不一、光滑或龟裂粗糙的肿瘤，而植株的地上部份生长迟缓、缺水蔫萎，严重时植株死亡。根肿病可以通过带菌基质、土壤、种苗、水流、农事操作等方式传播，病菌在土中可存活10年以上。芸薹根肿菌为专性寄生菌，不能人工培养，病菌的检测主要是采用PCR的分子检测。4原理4.1分类地位芸薹根肿菌（PlasmodiophorabrassicaeWoronin芸薹根肿菌属于原生动物界（Protozoa根肿菌门（Cercozoa植物寄生黏菌纲（Phytomyxea根肿菌属4.2巢式PCR巢式PCR是一种变异的聚合酶链反应（PCR），使用两对（而非一对）PCR引物扩增完整的片段。第一对PCR引物扩增片段和普通PCR相似。第二对引物称为巢式引物（因为他们在第一次PCR扩增片段的内部），结合在第一次PCR产物内部，使得第二次PCR扩增片段短2于第一次扩增。由于巢式PCR反应有两次PCR扩增，从而降低了扩增多个靶位点的可能性（因为与两套引物都互补的引物很少），增加了检测的敏感性；又有两对PCR引物与检测模板的配对，增加了检测的可靠性。由于第二套引物位于第一轮PCR产物内部，而非目的片断包含两套引物结合位点的可能性极小，因此第二套引物不可能扩增非目的片断。因遇到农用基质中携带根肿病菌含量比较低的情况，故本规程规定采用巢式PCR扩增的检测方法。5仪器和试剂5.1主要仪器5.1.1恒温鼓风干燥箱：满足168℃消毒2小时的功能。5.1.2高压湿热灭菌锅：满足121℃饱和压力蒸汽消毒15min~30min的功能。5.1.3研钵：陶瓷材质，口径60mm~100mm之间。5.1.4水浴锅或干浴锅：50℃-80℃恒温功能。5.1.5高速冷冻离心机：离心转速10000g以上。5.1.6PCR仪：常规PCR扩增功能。5.1.7旋涡振荡器：具有点振和连续振荡功能。适配1.5mL、2.0mL等规格离心管。5.1.8凝胶成像仪：常规的PCR扩增产物电泳拍照与记录功能。5.1.9微量移液器：规格0.1μL~2.5μL，2μL~20μL，20μL~200μL，100μL~1000μL。5.1.10电子天平：精度0.001g以上。5.2主要试剂5.2.1除另有规定外，所有试剂均为分析纯或生化试剂，实验用水应符合GB/T6682中二级水规格以上的双蒸水或超纯水。5.2.2DNA提取试剂盒：选择质量稳定的商用产品，试剂盒提取总DNA质量要达到或优于附录B1图示提取总DNA质量。5.2.3PCR扩增相关试剂，无水乙醇等常规试剂。6检测与鉴定6.1采样样品抽样和缩分方法按照NY525规定执行。抽取样品于-20℃或-80℃（更佳）保存备6.2样品制备每个样品取2份实施平行检测。样品研磨和总DNA提取见附录B.1。6.3巢式PCR检测采用巢式PCR方法进行病菌检测，具体操作见附录B.2。7结果判定7.1外圈引物对的PCR扩增结果待检测样品为阳性，判定样品检出芸薹根肿病菌。7.2外圈引物对的PCR扩增结果待检测样品为阴性，第一轮PCR检测结果无法判断，应实施巢式PCR内圈引物对的第二轮PCR扩增后再作判断。7.3巢式PCR内圈引物对PCR扩增结果待测样品为阳性，判定样品检出芸薹根肿病菌。3DB××××-××××7.4巢式PCR内圈引物对PCR扩增结果待测样品为阴性，判定样品未检出芸薹根肿病菌。7.5二个平行检测中只要有一个检测出芸薹根肿病菌，判定该批次基质检出芸薹根肿病菌。8样品留存与处理检出芸薹根肿病菌的基质样本应至少保存6个月，同时留样样品于-20℃或-80℃（更佳）保存，以备复验。保存期满，需经灭活后再处理。9结果记录与资料保存完整试验记录和检测报告包括样品的来源、种类、时间，实验的时间、地点、方法和结果，PCR凝胶电泳加检测应有电泳结果照片等，并要有试验人员和审核人员签字。妥善保管好实验的原始记录。4附录A（资料性）芸薹根肿病菌的基本信息A.1寄主范围油菜根肿病是由专性寄生菌芸苔根肿菌（PlasmodiophorabrassicaeWoronin.）引起的一种重要的土传病害。芸薹根肿病菌的寄主范围很广，可以侵染油菜、甘蓝、萝卜、芥菜、菜等100多种十字花科植物。A.2危害症状受害寄主植株感病初期地上部无明显差异或特殊的表现，而在感病后期，地上部叶片由下而上逐渐发黄，出现持续性失水萎蔫（图A.1）。相较于正常植株，感病株生长缓慢，株型矮小，地下部主根、侧根和须根上形成数目和大小不等、呈指状、短棒状或球形的肿瘤（图A.2），根肿发生初期表面光滑，后期则会出现龟裂、粗糙、变黄，最后整个受害根部组织出现腐烂，滋生各种真菌，形成白色的菌丝层或滋生多种害虫，地上部植株枯萎死亡。A.3分布地区世界上广为分布，在欧洲、北美、东亚等地区已成为十字花科植物上的主要病害。A.4传播途径芸薹根肿病菌休眠孢子在土壤中的存活能力强，存在于土壤中15~20年仍能萌发，并且具备致病能力，同时病根腐烂后，其内大量的休眠孢子又随病残体落在土壤或堆肥中，进行再侵染或休眠，根肿菌传染性强，具低浓度致病阈值、传播速度快。A.5病原菌形态根肿菌休眠孢子感知寄主刺激后释放出具双鞭毛的初级游动孢子并侵染根毛，在根毛中形成初生原质团，初生原质团随后分裂形成次级游动孢子囊，从中释放出的次级游动孢子；次级游动孢子直接侵染皮层细胞，在其中形成次生原质团；最后次生原质团分裂形成成熟的休眠孢子散落在土壤中，成为来年的初侵染源。休眠孢子游离分散在寄主细胞内，不联合形成休眠孢子堆。A.6基因组基因组从头测序，最终通过序列拼接和组装得到165个scaffold，组成的基因组序列大小为24M，其中scaffold序列的N50大小为473kb。基因组GC含量为50%。5DB××××-××××图A.1十字花科蔬菜根肿病田间植株萎蔫症状图A.2十字花科蔬菜根肿病田间植株根部肿大畸形症状6（规范性）巢式PCR检测方法B.1样品总DNA提取B.1.1样品研磨每份样品取3g到研钵中，加液氮后，用人工研磨方法充分研磨。B.1.2样品总DNA提取使用试剂盒PowerSoilDNAIsolationKit试剂盒（QIAGENGmbH，已更名为DNeasyPowerSoilKit按照说明书操作。a）称取0.25g研磨好的基质样品（剩余样品粉末可装管后放置-20℃或-80℃（更佳加入到PowerBeadTube中轻轻的涡旋混匀；b）再加入60µLSolutionC1，上下颠倒数次混匀（SolutionC1需预先在60℃水浴加热去除沉淀把PowerBeadTube固定在涡旋仪适配器上最大转速涡旋连续振荡10min；c）然后10000g离心30s，吸取上清液至一个新的2mLCollectionTube（收集管）中，d）避开沉淀，吸取最多不超过600µL上清液到一个新的2mLCollectionTube中，加入200µLSolutionC3到上清液中，短暂涡旋混匀，4℃孵育5min。然后室温10000g离心e）避开沉淀，吸取最多不超过750µL上清液到一个新的2mLCollectionTube中，加入1200µLSolutionC4（SolutionC4使用前要混匀）到上清液中（注意溶液不能满过试管口涡旋混匀5s。吸取675µL上清液加入到SpinFilter中，室温10000g离心1min。弃滤液，继续加入675µL上清液，室温10000g离心1min，重复此过程至过滤完所有上清液；f）再加入500µLSolutionC5到SpinFilter中，室温10000g离心30s，弃上清液。室温10000g离心1min；g）小心转移SpinFilter到一个新的2mLCollectionTube中，尽量避免SolutionC5污染，最后加入100µLSolutionC6到白色滤膜中心，室温10000g离心30s，弃SpinFilter，得到的DNA于-20℃保存，备用。B.1.3琼脂糖凝胶电泳检测B.1.3.1制备凝胶用1×TAE配制1.5%琼脂糖凝胶，加热溶化后冷却至55℃左右。B.1.3.2加核酸染料将核酸染料（GELVIEW）加入到配制好的凝胶中，GELVIEW终浓度为0.1µL/mL。将凝胶倒入凝胶槽中，插上样品梳子。冷却凝固后拔掉梳子，在电泳槽内加入1×TAE，缓冲液要没过凝胶表面约1mm。B.1.3.3加样将加样缓冲液与样品混合后加入样品孔，同时设置PCR的阴性对照、阳性对照和DNA7DB××××-××××分子量标记（Marker）。B.1.3.4电泳接通电源，以3-5伏/厘米（V/CM）电场强度进行电泳，0.5h后观察结果。B.1.4.5结果观察电泳结束后，将整个凝胶置于凝胶成像系统上观察，记录结果。B.1.4结果判定样品出现预期大小的条带（图B.1应判定提取到样品DNA。·图B.1基质样品总DNA提取电泳图·泳道1：Marker；泳道2：基质；泳道3：基质B.2巢式PCR扩增B.2.1引物序列a)外圈引物对：PbITS-1:5’ACTTGCATCGATTACGTCCC3’;PbITS-2:5’GGCATTCTCGAGGGTATCAA3’。b)内圈引物对：PbITS-6:5’CAACGAGTCAGCTTGAATGC3’;PbITS-7:5’TGTTTCGGCTAGGATGGTTC3’。B.2.2扩增体系及条件a)第一轮PCR扩增（外圈反应体系20μL，其中包括1μL待测样品DNA，10μL2×PCRMix，1μL引物PbITS-1（10μmol·L-11μL引物PbITS-2（10μmol·L-17μL双蒸水。PCR扩增反应条件为：95℃5min，1个循环；95℃60s，60℃60s，72℃90s，共35循环；72℃10min，1个循环。b)第二轮PCR扩增（内圈反应体系20μL，其中包括1μL第一轮扩增产物（如产物条带明显，需要进行稀释，一般在100-10000倍10μL2×PCRMix，1μL引物PbITS-6（10μmol·L-11μLPbITS-7（10μmol·L-17μL双蒸水。PCR扩增反应条件为：95℃5min，1个循环；95℃30s，54℃30s，72℃45s，共35个循环；72℃10min，1个循环。C)PCR扩增用含有芸薹根肿病菌的DNA作为模板阳性对照，用双蒸水作为空白阴性对照。B.2.3琼脂糖凝胶电泳检测参照附录B.1.3。8B.2.4扩增产物序列测定对扩增产物委托第三方公司进行DNA序列的测定。B.2.5结果判定B.2.5.1外圈引物对的PCR扩增结果中待检测样品和阳性对照在1087bp处出现扩增条带，阴性对照无扩增条带（图B.2且测序后得到的DNA序列经数据库比对为芸薹根肿病菌，判定结果为阳性。B.2.5.2外圈引物对的PCR扩增结果中阳性对照在1087bp处出现扩增条带，待检测样品和阴性对照无扩增条带，结果无法判断，应实施内圈引物对的第二轮PCR扩增后再作判断。B.2.5.3内圈引物对PCR扩增结果中待测样品和阳性对照在506bp处出现扩增条带，阴性对照无扩增条带（图B.3且测序后得到的DNA序列经数据库比对为芸薹根肿病菌，判定结果为阳性。B.2.5.4内圈引物对PCR扩增结果中阳性对照在506bp处出现扩增条带，待测样品和阴性对照无扩增条带，判定结果为阴性。图B.2农用基质样品中芸薹根肿病菌巢式