《日化产品除菌效果的评价方法》

1QB/TXXXX—XXXX日化产品除菌效果的评价方法本方法描述了具有除菌功能的织物洗涤剂和肌肤清洁产品的除菌效果的评价方法。本文件第一法适用于织物洗涤剂的除菌效果评价，第二法适用于肌肤清洁产品的除菌效果评价。本文件不适用于配方中添加微生物的产品。2规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB4789.2食品安全国家标准食品微生物学检验菌落总数测定GB19489实验室生物安全通用要求GB/T25812染料试验用标准漂白棉布QB/T2738—2023日化产品抗菌抑菌效果的评价方法3术语和定义下列术语和定义适用于本文件。3.1除菌eliminatingbacterial采用物理化学方法洗去载体表面上附着的细菌/真菌的过程。3.2载体carrier试验微生物的支持物。），3.3菌落形成单位colonyformingunit；CFU在活菌培养计数时，由单个菌落或聚集成团的多个菌体在固体培养基上生长繁殖所形成的集落。），3.4织物洗涤剂fabricdetergent用于织物的洗涤产品。3.5肌肤清洁产品skincleansingproducts用于人体肌肤清洁类的产品。2QB/TXXXX－XXXX4生物安全及无菌操作的基本要求实验环境应满足GB19489的相关规定，由经过专业培训的人员进行试验。无菌操作的基本要求参考QB/T2738—2023第4章。5第一法织物洗涤剂除菌效果评价方法5.1原理将试验微生物悬浮液涂覆到载体上，模拟实际洗涤过程用待测试样处理染菌载体，再通过无菌操作回收载体表面残留活菌。同时用无菌硬水处理染菌载体作为空白对照，用于试验有效性评价指标，并对染菌载体进行基线回收，用于评价待测试样的除菌效果。5.2仪器与设备5.2.1高压蒸汽灭菌锅。5.2.2恒温培养箱：控温精度±1℃。5.2.3恒温磁力搅拌器：配圆柱带节型搅拌转子，8mm×35mm。5.2.4分析天平：精度为0.01g、0.001g。5.2.5试管：Ø18mm×180mm。5.2.6移液器：20μL，1mL，5mL，10mL。5.2.7培养皿：Ø90mm。5.2.8锥形瓶：500mL。5.2.9广口玻璃瓶：400mL，瓶口宽60mm~70mm，带塞子。5.2.10涡旋震荡器。5.2.11镊子。5.2.12医用无菌采样杯：60mL。5.2.13浊度仪。5.2.14生物安全柜5.2.15恒温水浴锅：控温精度±1℃5.3试剂5.3.1培养基商品化的合格市售培养基：胰蛋白胨大豆琼脂培养基（TSA）、营养琼脂（NA）、营养肉汤（NB）。5.3.20.03mol/L磷酸盐缓冲液（PBS）称取2.83g磷酸氢二钠（Na2HPO4）、1.36g磷酸二氢钾（KH2PO4），加蒸馏水1000mL，待完全溶解后，调pH至7.2~7.4，经121℃压力蒸汽灭菌20min后备用。5.3.3硬水（硬度342mg/L）称取0.304g氯化钙（CaCl2）、0.139g氯化镁（MgCl2•6H2O加蒸馏水1000mL，即为342mg/L硬水。经121℃压力蒸汽灭菌20min后备用。5.3.4洗脱液称取3.0g大豆卵磷脂、10.0g吐温80，加入0.03mol/L磷酸盐缓冲液（PBS）1000mL，溶解后搅拌均匀，经121℃压力蒸汽灭菌20min后备用。5.4评价原则5.4.1织物洗涤剂作用浓度与测试菌种的选择一般情况按产品说明中标识的除菌作用浓度和试验菌种进行。如产品说明未标识可参考表1进行，也可根据产品的使用要求增加其他菌种作为检验菌种。3QB/TXXXX—XXXX表1织物洗涤剂作用浓度与试验菌种的选择肺炎克雷伯菌（ATCC4352）5.4.2菌落计数按GB4789.2中规定计数。5.5操作步骤5.5.1菌悬液的准备取菌种3代~5代的营养琼脂培养基斜面新鲜培养物，参照QB/T2738—2023中7.2.2.5制备菌悬液，用0.03mol/LPBS溶液将试验菌悬液稀释，通过浊度仪调节菌悬液浓度至1.0×108CFU/mL～9.0×108CFU/mL备用。5.5.2测试载体的前处理以符合GB/T25812规定的纯棉白布作为测试载体，参照QB/T2738—2023中7.4.4.1脱脂处理后裁剪成3cm×3cm的方布片，121℃灭菌20min45±1）℃烘干备用。5.5.3染菌载体的制备每片3cm×3cm布片平铺于培养皿内，各接种20μL菌悬液使其均匀扩散到布片上，盖上盖子于（36±1）℃的培养箱中干燥固定20min，取出放入生物安全柜备用（染菌载体应4h内使用）。5.5.4基线回收每3片5.5.3制备好的染菌载体为一组，将1组染菌载体逐片放入含30mL洗脱液的医用无菌采样杯中，在涡旋震荡器上混合60s进行基线回收。5.5.5试验组的处理5.5.5.1洗涤试验在400mL广口玻璃瓶内进行，试验时用250mL的硬水将待测洗涤产品稀释至产品标明的除菌作用浓度，或参考表1执行。注意洗涤溶液的水温控制在（30±1）℃,将配制好的洗涤溶液放于磁力搅拌器上混匀至少10min。5.5.5.2将一组5.5.3制备好的染菌载体逐片放入广口玻璃瓶内，盖上塞子启动磁力搅拌器，300r/min磁力搅拌20min。用无菌镊子夹出布片并等待至布片无滴水，倒掉广口玻璃瓶中的洗涤液，将布片放回广口玻璃瓶内，再加入250mL的硬水盖上塞子，300r/min磁力搅拌漂洗5min，漂洗过程中水温同样控制在（30±1）℃,以此方式漂洗2次。洗涤或漂洗过程中如果出现布片粘贴在玻璃瓶内壁、转子失控、布片和转子挂在一起等异常现象可人工干预使其恢复正常。5.5.5.3漂洗完毕后用无菌镊子取出3片染菌载体，等待至布片无滴水，逐片放入含30mL洗脱液的医用无菌采样杯中，旋紧瓶盖，在涡旋震荡器上混合60s，然后用PBS做10倍系列稀释，并选择适宜的稀释度样液1.0mL接种于无菌平皿，每个稀释度接种2个平板。用冷却至40℃~45℃的TSA培养基15mL～20mL作倾注，转动平皿，使其充分均匀，琼脂凝固后翻转平皿36±1）℃培养（48±2）h后，做活菌菌落计数（或根据所选菌种选用合适培养条件）。5.5.6空白对照组的处理以无菌硬水代替试验产品，同时按上述步骤操作，作为空白对照组。5.5.7试验次数试验重复3次，取其算术平均值用于结果计算。5.6结果计算和评价4QB/TXXXX－XXXX5.6.1试验结果有效性评价试验结果有效性评价标准如下，当条件a)、b)中有任一条不满足时试验结果无效；当仅有条件c)不满足时报告测试样品无除菌效果；当同时满足以下条件时，当次试验结果有效可进行除菌率的计算。a)要求基线回收菌落数在106CFU/组～107CFU/组范围内。b)活菌计数误差评价符合QB/T2738—2023中7.2.6要求。c)3次测试3组试验组的菌落回收对数值（lgTs）与3组空白对照组的菌落回收对数值（lgTo）进行比较。要求3次测试均满足lgTs＜lgTo。5.6.2除菌率计算除菌率C按式（1）计算，结果以百分数表示，保留两位小数C=×100%……（1）式中：C——测试样品除菌率；Ⅰ——基线细菌回收平均菌落数；Ⅱ——试验组洗涤后回收平均菌落数。5.6.3除菌效果评价当除菌率≥90%时，表明此条件下产品有除菌效果。6第二法肌肤清洁产品除菌效果评价方法6.1原理将试验微生物悬浮液涂覆到载体上，模拟实际洗手过程用待测试样处理染菌载体，再通过无菌操作回收载体表面残留活菌。同时用无菌硬水处理染菌载体作为空白对照，用于试验有效性评价指标。并对染菌载体进行基线回收，用于评价待测试样的除菌效果。6.2仪器与设备6.2.1高压蒸汽灭菌锅。6.2.2恒温培养箱：控温精度±1℃。6.2.3浊度仪。6.2.4分析天平：精度为0.01g。6.2.5试管：Ø18mm×180m6.2.6移液枪：0.10mL，1mL，5mL，10mL。6.2.7培养皿：Ø90mm。6.2.8锥形瓶：500mL。6.2.9涡旋震荡器。6.2.10无菌剪刀，镊子。6.2.11无菌密封袋。6.2.12涂布棒。6.2.13无尘纸。6.2.14生物安全柜。6.3试剂6.3.1培养基商品化的合格市售培养基：胰蛋白胨大豆琼脂培养基（TSA）、胰蛋白胨大豆培养基（TSB）、改良6.3.20.03mol/L磷酸盐缓冲液（PBS）5QB/TXXXX—XXXX6.3.3硬水（硬度342mg/L）6.4评价原则6.4.1测试菌种金黄色葡萄球菌（ATCC6538）。可根据产品的实际作用，增加测试菌株进行实验。6.4.2测试载体仿真皮1以蛋白为主要原材料制作，一面光滑另一面粗糙的半透明薄膜，具有一定硬度，搓洗不破。仿真皮可通过紫外照射的方式进行灭菌。6.4.3菌落计数按GB4789.2中规定计数。6.5操作步骤6.5.1菌悬液的准备将传代次数不超过5代的金黄色葡萄球菌（6.4.1）保藏菌株在合适的培养基如TSA上划线，经（36±1）℃培养18h~24h。从平板上挑取一个单菌落接种到含30mLTSB的50mL无菌容器中，经（36±1）℃静置培养18h~24h。要求浓度为5.0×108CFU/mL～1.0×109CFU/mL。6.5.2染菌载体的制备使用无菌剪刀将仿真皮（6.4.2）裁成6cm×6cm大小，平铺于培养皿内，粗糙面朝上。在每块仿真皮上接种0.10mL菌悬液，使用一次性涂布棒将菌液涂抹均匀，避免接触仿真皮边缘部位，于室温下静置30s，备用。6.5.3基线回收每3块6.5.2制备好的染菌载体为1组，将1组染菌载体分别放入3个含10mLMLBTL采样溶液的密封袋内均匀搓揉1min进行基线回收。6.5.4试验组的处理6.5.4.1调整水温为20℃~24℃,且水的流速为2.0L/min～4.0L/min，并保证整个清洗过程水温和流速符合上述要求。水的洁净度达到≤100CFU/mL的要求。6.5.4.2将染菌载体放置在硬质平板上。6.5.4.3对于香皂产品，用润湿的香皂均匀涂擦染菌载体15s。对于液体类产品，用注射器吸取0.45mL样品，均匀涂抹至染菌载体表面。6.5.4.4保持各个部位揉搓的一致性，揉搓染菌载体30s。6.5.4.5保持仿真皮和水流的夹角大约为120°,且出水处距离仿真皮顶端的垂直距离保持在5cm～7cm。依靠水的自然下流冲洗染菌载体30s，冲洗过程中通过左右移动平板确保所有部位均被冲洗到。6.5.4.6用无尘纸将冲洗完毕染菌载体上的水蘸干（不应搓擦，只需用纸巾轻轻拍打仿真皮即可）。6.5.4.7每个测试样品洗涤1组6.5.2制备好的染菌载体。6.5.4.8每块染菌载体在清洗后的1min内，放入含10mLMLBTL采样溶液的密封袋内，均匀搓揉仿真皮1min。然后用PBS做10倍系列稀释，并选择适宜的稀释度样液1.0mL接种于无菌平皿，每个稀释度接种2个平板。用冷却至40℃~45℃的TSA培养基15mL～20mL作倾注，转动平皿，使其充分均匀，琼脂凝固后翻转平皿36±1）℃培养（48±2）h后，做活菌菌落计数。6.5.5空白对照组的处理均以0.45mL无菌硬水代替试验产品，同时按上述步骤操作，作为空白对照组。6QB/TXXXX－XXXX6.5.6试验次数试验重复3次，取其算术平均值用于结果计算。6.6结果计算和评价6.6.1试验结果有效性评价试验结果有效性评价标准如下，当条件a)、b)中有任一条不满足时试验结果无效；当仅有条件c)不满足时报告测试样品无除菌效果；当同时满足以下条件时，当次试验结果有效可进行除菌率的计算。a)要求基线回收菌落数大于107CFU/组。b)活菌计数误差评价符合QB/T2738—