段旭昌免疫磁珠分离技术IMB及在食品生产中的应用

免疫磁珠分离技术（IMB）

及在食品生产中应用

段旭昌副教授西北农林科技大学食品科学与工程学院910段旭昌免疫磁珠分离技术IMB及在食品生产中的应用第1页提纲磁性微球磁性微球结构、分类及特点磁性微球制备磁性微球分离技术免疫磁株免疫磁珠结构与性质免疫磁株特点免疫磁珠分类免疫磁珠制备免疫磁珠分离技术免疫磁珠技术应用免疫磁珠在食品安全检测中应用免疫磁珠与其它检测伎俩联用免疫磁珠技术在其它领域应用免疫磁珠技术优缺点及发展望段旭昌免疫磁珠分离技术IMB及在食品生产中的应用第2页一磁性微球是经过一定方法将磁性无机粒子与有机高分子结合形成含有一定磁性及特殊结构体积在几纳米到几十微米之间复合微球。高分子磁性微球表面含有众多表面功效基团,同时含有磁响应性,在外加磁场作用下含有磁导向功效。当前已广泛用于生物医学、细胞学和分离工程等领域。段旭昌免疫磁珠分离技术IMB及在食品生产中的应用第3页二磁性微球结构、分类及特点磁性核材料多为Fe、Co、Pt、Ni等金属及其氧化物。如Fe3O4.γ-Fe2O3、MeFe2O3（Me=Co、Mn、Ni）、BaFe12O19、铁钴合金（Fe-Co和Ni-Fe）。最惯用是Fe、Fe2O3、Fe3O4。其中Fe3O4应用最多。组成磁性微球高分子材料有天然高分子和合成高分子物质。天然高分子有明胶、球蛋白、牛血清白蛋白、聚赖氨酸、淀粉和各种聚糖如纤维素、葡聚糖、琼脂糖、壳聚糖、果胶等。合成高分子材料有聚苯乙烯、聚乙烯亚胺、聚乙烯醇、聚丙烯酸（酯）及其共聚物、聚酰胺类、聚苯胺及硅烷等。这些材料可单独用，也可复合使用。磁性微球表面可依据需要赋予不一样功效基团(如－OH、－COOH、－CHO、－NH2,—SH、—CONO2、—CONH2、—SO3H、—SiH3、—环氧基、—CHCl等)，使其表现含有疏水-亲水、非极性-极性、带正电荷-带负电荷等不一样物理性质。同时含有磁响应性，在外磁场作用下含有磁导向性。段旭昌免疫磁珠分离技术IMB及在食品生产中的应用第4页导电聚合磁微球聚合磁微球段旭昌免疫磁珠分离技术IMB及在食品生产中的应用第5页对磁性微球要求:粒径均匀、大小适当、比表面积大、吸附力强、含有强超顺磁性、悬浮均匀稳定性好、不易聚集沉淀、表面含有各种活性基团、理化性质稳定、含有很好生物相容性、对细胞、机体、活性物质损伤小。因为环氧基、氯甲基功效基团非常活跃，不需连接其它活性基团即可与生物配基（如抗体、抗原等）偶联，及其它基团微型磁珠在生物学、医学方面应用较为广泛。段旭昌免疫磁珠分离技术IMB及在食品生产中的应用第6页三磁性微球制备磁性微球制备方法:共沉淀法、悬浮聚正当、乳液聚正当、分散聚正当、包埋法及原子转移自由基聚正当等。段旭昌免疫磁珠分离技术IMB及在食品生产中的应用第7页1.共沉淀法金属离子在碱性条件下与高分子共沉淀，一步反应生成磁性高分子微球方法。2Fe3++Fe2++8OH→Fe3O4+4H2OPich[等先经过单体聚合反应得到PS-AAEM颗粒分散剂，再把配制好Fe3+、Fe2+溶液加入聚苯乙烯（PS）-乙酰乙酸基甲基丙烯酸乙酯（AAEM）颗粒分散剂中，然后滴加NH3·H2O。Fe3O4粒子在PS-AAEM表面沉积，制得PS-AAEM为关键、Fe3O4粒子为壳层磁性微球。微球磁性能经过改变FeCl2和FeCl3浓度或改变PS-AAEM关键尺寸来控制。Xia等把一定配比FeCl2.FeCl3与葡聚糖（dextranT-10）共混，然后滴加NH3·H2O，在超声连续作用下水浴加热，制得以Fe3O4为核、dextran为壳磁性微球。杨玉东等把一定配比FeCl3·6H2O、FeCl2·6H2O与配体（如二亚乙基三胺五乙酸（DTPA）或乙二氨四乙酸（EDTA）等）组成混合液体加入到75℃葡聚糖T-10溶液中，并快速滴加NH3·H2O，制备了葡聚糖为壳、氧化铁为核磁性微球。段旭昌免疫磁珠分离技术IMB及在食品生产中的应用第8页2聚正当制备磁性微球过程异相聚正当包含分散聚合、乳液聚合、悬浮液聚合三种。该法是将磁性粒子用表面改性剂、偶联剂、引发剂等处理后分散到含有聚合物单体溶剂中进行聚合反应。通常以磁性粒子为活性中心进行单体聚合。段旭昌免疫磁珠分离技术IMB及在食品生产中的应用第9页四磁性微球分离技术MACS(MagneticActivatedCellSorting)是将免疫学+细胞生物学+磁力学结合为一体,利用磁性微球表面功效基团专一亲和特征或多孔吸附特征吸附特定组分,然后用外力磁场作用将吸附了特定物质磁珠加以分离,再经过洗脱磁珠上吸附目标物质一个新型分离技术,含有广泛用途。

几个DNA

分离方法比较ComparationofseveralDNAextractionmethods方法

传统法鳌合树脂法玻璃粉法磁珠法免疫亲和法DNA提取酚/氯仿等溶剂抽提Chelex100树脂吸附玻璃粉吸附离心分离磁珠吸附磁场分离抗原抗体反应磁场分离适用范围大多数标本DNA提取纯化培养及各种临床标本土壤标本冰冻、陈旧组织冰冻、陈旧组织，样本含量极少标本方法评价DNA纯度高、含量多，但较费时，步骤繁琐，用有机溶剂，有损操作者健康。可用于培养标本和各种临床标本细菌及部分病毒核酸提取。方法简便，可用于土壤中细菌芽孢DNA提取，不能彻底除去PCR抑制剂。简单、快速，整个过程不到2h，可取得较纯DNA。适于少许样本。DNA纯度高，含量多，适于样本含量少标本，单克隆抗体制备是关键。段旭昌免疫磁珠分离技术IMB及在食品生产中的应用第10页五免疫磁珠免疫磁珠（IMB）也称免疫磁性微球,是在磁性微球表面偶联上免疫配基一个磁性微球,是将磁性微球技术和免疫学相结合特殊磁性微球。段旭昌免疫磁珠分离技术IMB及在食品生产中的应用第11页六免疫磁珠结构与性质免疫磁珠关键为顺磁性粒子,关键外层包裹一层高分子材料,最外层是免疫配基。段旭昌免疫磁珠分离技术IMB及在食品生产中的应用第12页免疫配基

免疫配基经过生物高分子功效基团结合到磁性载体微球上形成免疫磁珠。因为载体微球制备材料和方法不一样,其表现出物理性质也不一样,从而可结合不一样免疫配基,如抗原、抗体、凝集素、DNA和RNA等。配基必须含有生物专一性特点,而且载体微球与配基结合要不影响或改变配基原有生物学特征,确保磁珠特殊识别功效。段旭昌免疫磁珠分离技术IMB及在食品生产中的应用第13页免疫磁珠性质含有均匀性、超顺磁性及保护性外壳,由磁性载体微球和免疫配基结合而成,表面含有专一亲和性和吸附作用。免疫磁珠大小和形状含有均一性,可使靶物质快速有效地结合到磁珠上,可使新生成复合物在磁场中含有相同磁响应性,且行为一致。磁珠球形结构可消除与不规则形状粒子间非特异性结合,顺磁性可使磁珠置于磁场时显示其磁性,并做定向移动,从磁场移出时磁性消除,磁珠分散,可方便地进行分离和磁性导向。保护性壳可预防磁性内核漏出或被载液腐蚀；免疫配基可专一性结合反应体系中对应抗原、抗体、核酸等生物活性物质。段旭昌免疫磁珠分离技术IMB及在食品生产中的应用第14页七免疫磁株特点磁性微球与免疫配基结合牢靠。不影响或改变免疫配基原有生物特征和特异性。免疫微球识别专一性。在磁场中含有顺磁性,离开磁场磁性消失,易于分散。

因为聚苯乙烯磁性微球强度高、表面易进行化学维修饰,是比较理性制造免疫磁珠材料。段旭昌免疫磁珠分离技术IMB及在食品生产中的应用第15页八免疫磁珠分类依据磁珠在磁场中受力大小及磁珠体积，分为小磁珠和大磁珠。大磁珠:1-5um，粒径较大、悬浮稳定性差、易沉淀、比表面积小、吸附能力低、吸附活性配基少、对细胞影响大，尤其是阳性分选时需将磁珠与细胞解离后方可进行下一步试验。但磁力强，无需特殊分离柱即可实现样品分离，分离速度快、过程简单、成本低。小磁珠:50nm以下，粒径较小、悬浮稳定、比表面积大、表面吸附活性配基多，只有细胞体积万分之一，对细胞表型和功效影响小，不影响细胞后续培养。但磁力弱，需特殊分离柱才能实现样品分离，分离速度慢，成本高段旭昌免疫磁珠分离技术IMB及在食品生产中的应用第16页九免疫磁珠制备免疫磁珠制备是将磁性微球和抗体等配基结合而成。磁性微球与抗体连接方式有共价结合和吸附结合两种方式。共价结合:依靠磁珠表面活性基团如-CHO、-COOH等与抗体Fab段上-NH2共价反应和结合吸附结合:依靠磁珠巨大比表面与抗体见得非特异性吸附而结合。共价结合牢靠度远远大于吸附结合牢靠度。制备方法:先制备磁性微球，然后将磁性微球分散于抗体配机溶液中使磁珠与抗体充分吸附结合，然后分离免疫磁珠分散于缓冲溶液中能够使用。段旭昌免疫磁珠分离技术IMB及在食品生产中的应用第17页十免疫磁珠分离技术免疫磁珠(immunomagneticbead,IMB)分离技术:是一个以特异抗原抗体反应为基础免疫学磁性微球检测和分离技术。它是以抗体包被微球磁珠为载体，经过抗体与反应介质中特异性抗原结合，形成抗原—抗体复合物，此复合物在外加磁场作用下发生定向移动，从而到达分离抗原目标。段旭昌免疫磁珠分离技术IMB及在食品生产中的应用第18页基本原理:磁性微球经过一定处理后,将抗体结合到磁珠上,形成免疫磁性微球（标识磁珠）,标识磁珠抗体与特异性抗原结合形成抗原—微球复合物,该复合物在磁场中含有与其它组分不一样磁响应性,在磁力作用下,该复合物发生力学移动,从而到达分离抗原目标。段旭昌免疫磁珠分离技术IMB及在食品生产中的应用第19页以细胞分离为例图解免疫磁珠技术原理段旭昌免疫磁珠分离技术IMB及在食品生产中的应用第20页段旭昌免疫磁珠分离技术IMB及在食品生产中的应用第21页免疫磁珠标识方法1直接磁珠和直接标识法经过物理吸附和共价键结合直接将特意性抗体与磁珠耦合,然后再与对应细胞结合,形成细胞-抗原-抗体-磁珠复合物,在外磁场下直接分离目标细胞。快速、简单、特异性和细胞得率高,灵敏度低,需制备对应偶联抗体磁珠。2介绍磁珠和间接标识法使用anti-lg等与磁珠偶联,经过Anti-lg再使磁珠与二抗体偶联,分离细胞时,先使细胞与一抗特异性结合,然后在与一抗标识磁珠结合,形成细胞-1抗-2抗-anti-lg-磁珠复合体,在外磁场下分离目标细胞方法。该法增加了细胞洗涤步骤,特异性也会降低。该法普通用于①没有直标磁珠抗体②需用几个抗体去除各种细胞③目标细胞上特异性抗原分子表示水平低。段旭昌免疫磁珠分离技术IMB及在食品生产中的应用第22页MACS微珠直标微珠多项选择微珠间标微珠段旭昌免疫磁珠分离技术IMB及在食品生产中的应用第23页免疫磁珠分选方法阳性分选:利用特异性抗体偶联磁珠直接从细胞混合物中分离目标细胞分选方法称为positiveselection.阳性分选中磁珠标识细胞即为目标细胞。该法简单、快速、细胞得率和纯度较高。如采取anti-CD14磁珠分选CD14+巨噬细胞。阴性分选:用抗体偶联磁珠去除无关细胞，使目标细胞得以纯化和分离分选方法称为negativeselection.阴性分选中磁珠标识细胞为非目标细胞。如分离CD4+T细胞时，因为没有专用CD4+T细胞分选磁珠，可经过anti-CD8、anti-B220、anti-CD49b、anti-CD11b、anti-Ter119标识磁珠去除CD8+T细胞、B细胞、NK细胞、DC细胞、巨噬细胞、粒细胞等，最终而取得较纯CD4+T细胞。所以阴性分选法适合用于:①从细胞混合物中去除某种类型细胞。如肿瘤细胞。②缺乏针对目标细胞筛选特异性抗体磁珠时。③抗体和目标细胞结合可能诱导细胞活化，影响后续细胞功效分析时。复合分选:将阴性分选和阳性分选相结合分选方法。当目标细胞含量尤其低，无法直接进行阳性分选时，可采取阴性分选发先出去其它杂细胞，当目标细胞富集到一定程度时在采取阳性分选发筛选目标细胞。段旭昌免疫磁珠分离技术IMB及在食品生产中的应用第24页免疫磁珠与细胞解离1过夜培养法:惯用方法。将结合磁珠细胞置于10%胎牛血清培养基中37℃5%CO2细胞培养箱中培养16-24h，磁珠可从细胞上脱落，再经过磁场除去游离磁珠，即可取得裸细胞。2anti-Fab抗体法:用anti-Fab抗体与磁珠偶联抗体竞争目标细胞，是磁珠与目标细胞解离，用磁场除去游离磁珠，即可取得非标识细胞。3酶解法:经过木瓜蛋白酶和唾液蛋白酶使磁珠与细胞解离，再经过磁场除去游离磁珠，取得裸细胞。段旭昌免疫磁珠分离技术IMB及在食品生产中的应用第25页免疫磁珠分离装置免疫磁珠分离装置由超强磁铁分离器和分离柱组成。磁铁和分离柱型号多样,配合0.5ml、1.5ml微量离心管,15ml及50ml离心管或试管,和96孔或384孔培养板中样品分离,以满足不一样试验要求。段旭昌免疫磁珠分离技术IMB及在食品生产中的应用第26页段旭昌免疫磁珠分离技术IMB及在食品生产中的应用第27页十一免疫磁珠分离技术应用分离抗原抗体分离蛋白和多肽分离多糖物质分离DNA和RNA分离细胞和病毒靶向释药系统载运食品有害微生物分析与检测段旭昌免疫磁珠分离技术IMB及在食品生产中的应用第28页磁珠法分离抗体、抗原、蛋白、多肽、多糖、DNA.RNA操作过程示意图段旭昌免疫磁珠分离技术IMB及在食品生产中的应用第29页μMACSVitalvirusHiv分离试剂盒分离标识造血细胞表面Hiv-1病毒CD44H异型细胞免疫磁珠标识细胞示意图段旭昌免疫磁珠分离技术IMB及在食品生产中的应用第30页免疫磁珠分离细胞及病毒示意图段旭昌免疫磁珠分离技术IMB及在食品生产中的应用第31页十二免疫磁珠在食品安全检测中应用免疫磁珠对病毒细胞含有特异选择性,所以能用于食品有害微生物检测。免疫磁珠技术与常规检验方法相比含有检测快速、有选择性分离目标微生物,有效降低背景干扰,提升了精准性。同时还能捕捉受损伤靶细菌。当前,免疫磁珠技术已广泛用于食品样品中致病微生物检测。段旭昌免疫磁珠分离技术IMB及在食品生产中的应用第32页大肠杆菌O157检测传统分离E.coliO157∶H7所采取直接分离法存在着判别力差、抑制杂菌能力弱、耗时长、工作量大等缺点。采取免疫磁珠技术,能够快速地从各种食品样品中分离富集E.coliO157∶H7,满足流行病学研究要求和提升控制力度。现在这种免疫磁珠方法已经被英国公共健康服务试验室认定为标准分离方法,我国也已将免疫磁珠法对大肠杆菌O157检测纳入国家标准（GB/T4789.36-）和出入境检验检疫行业标准(SN/T1059.5-)。已经有市售专用免疫磁珠销售。段旭昌免疫磁珠分离技术IMB及在食品生产中的应用第33页检样25g(mL)+225mL改良EC肉汤（mEC+n）,均质225mL免疫磁珠捕捉涂布CT-SMAC平板和改良CHROMagarO157弧菌显色琼脂平板挑取可疑菌落5个~10个,氧化酶阴性,革兰氏阴性杆菌接种TSIMUG-LST阳性GB/T4789.36-免疫磁珠捕捉法检测O157∶H7程序阴性血清学试验非O157细菌生化试验汇报↓↓↓↓↓↓↓↓36±1oC18h~24h36±1oC36±1oC18h~24h18h~24h段旭昌免疫磁珠分离技术IMB及在食品生产中的应用第34页1增菌

2免疫磁珠捕捉与分离1.将Eppendorff管按样品和质控菌株进行编号,每个样品使用1支Eppendorff管,然后插人到磁板架上。在漩涡混合器上轻轻振荡E.coliO157免疫磁珠溶液后,用开盖器打开每支Eppendo-rff管盖子,每管加人20μLE.coli0157免疫磁珠悬液。2.取mEC+n肉汤增菌培养物1mL,加人到Eppendorff管中,盖上盖子,然后轻微振荡10s。每个样品更换1支加样吸头,质控菌株必须与样品分开进行,防止交叉污染。

详细操作段旭昌免疫磁珠分离技术IMB及在食品生产中的应用第35页3.结合:在18℃~30℃环境中,将上述Eppendorff管连同磁板架放在DynalMXl样品混合器上转动或用手轻微转10min,使E.coliO157与免疫磁珠充分接触。4.捕捉:将磁板插人到磁板架中浓缩磁珠。在3min内不停地倾斜磁板架,确保悬液中与盖子上免疫磁珠全部被搜集起来,此时,在Eppendorff管壁中间显著可见圆形或椭圆形棕色聚集物。5.吸收上清液:取1支无菌加长吸管,从免疫磁珠聚集物对侧深人液面,轻轻吸走上清液。当吸到液面经过免疫磁珠聚集物时,应放慢速度,以确保免疫磁珠不被吸走。如吸收上清液内含有磁珠,则应将其放回到Eppendorff管中,并重复4步骤。每个样品换用1支无菌加长吸管。段旭昌免疫磁珠分离技术IMB及在食品生产中的应用第36页6.洗涤:洗涤免疫磁珠混合物,重复上述步骤4~6和4~5。7.免疫磁珠悬浮:将免疫磁珠重新悬浮在100μLPBS-Tween20洗液中。8.涂布平板:用漩涡混合器将免疫磁珠混匀,用加样器各取50μL免疫磁珠悬液分别转移至CT-SMAC平板和改良CHROMagarO157弧菌显色琼脂平板一侧,再用无菌涂布棒将免疫磁珠涂布平板二分之一,用接种环划线接种平板另二分之一。待琼脂表面水分完全吸收后,翻转平板,于36℃士10℃培养18---24h。段旭昌免疫磁珠分离技术IMB及在食品生产中的应用第37页菌落识别在CT-SMAC平板上,经典菌落为不发酵山梨醇圆形、光滑、较小无色菌落,中心展现较暗灰褐色;发酵山梨醇菌落为红色;在改CHROMagar

O157弧菌显色琼脂平板上为圆形、较小菌落,中心呈淡紫色一紫红色,边缘无色或浅灰色。

初步生化试验:在CT-SMAC和改良CHROMagar

O157弧菌显色琼脂平板上挑取5个~10个经典或可疑菌落,分别接种TSI琼脂,同时接种MUG-LST肉汤,于36℃士1℃培养18

h~24

h。必要时进行氧化酶试验和革兰氏染色。在TSI琼脂中,经典菌株为斜面与底层均呈阳性反应呈黄色,产气或不产气,不产生硫化氢(H2S)。置MUG-LST肉汤管于长波紫外灯下观察,无荧光产生者为阳性结果,有荧光产生者为阴性结果;对分解乳糖且无荧光菌株,在营养琼脂平板上分纯,于36℃士1℃培养18

h~24

h,并进行判定。段旭昌免疫磁珠分离技术IMB及在食品生产中的应用第38页Fratamico等将兔抗E.coliO157∶H7多克隆抗体连接到羊抗兔IgG包被磁珠上,从食物增菌培养液中分离O157∶H7菌株,再将带菌磁珠接种到培养基上,加入荧光素标识O157∶H7抗血清,在荧光显微镜下观察,此法敏感性为10cfu/mL增菌培养液。Decory等建立了免疫磁珠-免疫脂质体（IMB/IL）荧光试验方法,可在8h内快速检测出各种液态样品（水样、苹果汁、苹果酒）中低至1cfu/mLE.coliO157∶H7,而传统微生物学方法不能从阴性样本中区分出E.coliO157∶H7感染样本。段旭昌免疫磁珠分离技术IMB及在食品生产中的应用第39页单核细胞增生李斯特菌检测

传统单增李斯特菌检测方法检测周期长,约5～14d,步骤繁琐且灵敏度低,而IMB技术优点在于在较低菌液浓度时也能够经过免疫磁珠富集作用进行检测,缩短了检测时间并深入降低了单增李斯特菌检测限。年,我国将免疫磁珠检测单核细胞增生李斯特菌方法纳入了出入境检验检疫行业标准中(SN/T0184.3-)。段旭昌免疫磁珠分离技术IMB及在食品生产中的应用第40页检样25g(mL)对225mLFB1増菌液（30℃士1℃,24h士1h）1mL转种10mLFB2増菌液（35℃,24h士1h）经过免疫磁珠捕捉李斯特菌,然后再用灭菌缓冲液洗涤用0.1mL灭菌缓冲液重新制成悬液吸收50uL免疫磁珠悬液划线于CHROMagar显色培养基,OXA/PALCAM琼脂平板（35℃+1℃,24h~28h)各挑选5个经典菌落接种于TSA-YE琼脂平板,纯培养判定和确认试验单增李斯特菌检测程序与方法段旭昌免疫磁珠分离技术IMB及在食品生产中的应用第41页1样品制备2增菌3免疫磁珠分离((IMS）1)免疫捕捉

混增菌培养液.沉淀全部粗糙食物残渣.从增菌培养液中移取1mL上层液体(要尽可能防止移取到食物颗粒和脂肪颗粒)加人Eppendorf管中.加20μL准备好免疫磁珠。在旋涡混合器上混合该悬液。2）分离

将Eppendorf管固定在磁架管孔中。1800轻缓摆动磁架5次--6次,使免疫磁珠聚集到磁极。小心地打开磁架上Eppendorf管管盖,从磁极对面一侧慢慢吸出液体,注意不要接触管壁上磁珠。每一个样品换一次枪头;加1

mI灭菌PBS

,并重新盖好盖子.将磁极从支架上移走,1800轻缓摆动磁架5次一6次,使管内各成份混合,后重新将磁极放回到支架上。重复该清洗步骤几次。将离心管从磁性分离器上移开.并加100μL灭菌PBS到管中,重悬磁珠。如试验室没有磁性分离器,能够用手摇代替.段旭昌免疫磁珠分离技术IMB及在食品生产中的应用第42页4.分离培养1）分离培养吸收50μL免疫磁珠悬液.加到显色培养基及任一选择性培养基OXA.PALCAM琼脂平板上.用无菌接种环划线.35℃士1℃培养22h-48h。

2）筛选

李斯特氏菌在CHROMagar显色培养基上菌落为蓝色.且在其周围形成一个晕环。李斯特氏菌在OXA琼脂平板上生长22

h后菌落展现黑色.直径为1mm.在其周围形成一个黑色环。培养48h，菌落仍呈黑色.直径2mm

--3mm.除在菌落周围有一环外.在菌落中心部位深层也形成黑点。李斯特氏菌在PALCAM琼脂平板上与在()XA琼脂平板上菌落相同。在CHROMagar显色培养基及OXA或PALCAM琼脂平板上挑取5个或更多可疑菌落.接种于TSA-YE琼脂平板上.纯培养后进判定。

5.判定和确认段旭昌免疫磁珠分离技术IMB及在食品生产中的应用第43页Skjerve等经过包被单克隆抗体磁珠从不一样食物样品中分离李斯特菌,采取将磁珠接种到琼脂平板培养方法进行菌株判定,此法敏感性为102～104cfu/mL样品。Hudson等研究表明,将免疫磁珠技术与PCR结合,24h内即可检出火腿中单增李斯特菌。段旭昌免疫磁珠分离技术IMB及在食品生产中的应用第44页沙门氏菌检测Notzon等用IMB-荧光PCR检测肉类中沙门氏菌,试验包含非选择性增菌、免疫磁珠分离、DNA提取及PCR扩增,12～13h即可完成检测过程,IMB-荧光PCR在检测自然感染肉类和人工感染肉类都含有较高敏感性和特异性。Blackburn等将用生物素标识抗沙门菌多价多克隆抗体连接到链霉亲和素包被磁珠上,以此试剂检测从不一样食物中提取活沙门菌。此法敏感性可达105cfu/g食物,总检测时间从5d降低至1~2d。段旭昌免疫磁珠分离技术IMB及在食品生产中的应用第45页IMB技术检测沙门氏菌优点适合用于各类食品基质中沙门氏菌快速检测,能快速有效富集食品基质中目标病原菌,且有良好灵敏度和特异性,检测限可到达1—10cfu/25g;在检测时间方面可将常规检测方法中72小时检测周期缩短至40小时,而且能有效减轻过程交叉污染;筛选结果既能够与常规细菌生化和血清学联用,也能够和显色培养基、荧光PCR以及微生物全自动判定仪器等方法联用,为食源性致病菌检测和判定提供有效快速筛选技术。段旭昌免疫磁珠分离技术IMB及在食品生产中的应用第46页金黄色葡萄球菌检测陈伶俐等将人IgG结合到磁珠上,用该磁珠对样品中金黄色葡萄球菌进行快速分离检验。取适量免疫磁珠,加入金黄葡萄球菌菌液中,磁场下分离磁珠,将分离前后菌液及磁珠涂平板,并用大肠杆菌、白葡萄球菌等作对照。结果用此磁珠分离后,只有金黄葡萄球菌浓度有显著降低。对磁珠所涂平板菌落进行判定,证实为金黄葡萄球菌。应用此法分离检验此菌,富集速度快,灵敏度高,效果好。刘琳琳利用自制金属螯合免疫磁珠来检测食品中金黄色葡萄球菌,该法能够在30min内富集检测金黄色葡萄球菌且检测低限可达100CFU,同时磁珠可保持活性达3周以上。段旭昌免疫磁珠分离技术IMB及在食品生产中的应用第47页副溶血性弧菌检测Hara-Kudo等利用IMS和显色培养基分离贝类中产TDH副溶血性弧菌O3:K6。Datta等利用副溶血性弧菌ATCC17802制备针对极鞭毛单克隆抗体,这将有益于快速检测从环境起源副溶血性弧菌。张凡非等利用IMS分离环境及食品中产生TDH副溶血性弧菌,分别从1份海水、1份海泥和3份蛤肉中检出了神奈川现象阳性,并产生耐热溶血毒素副溶血性弧菌,血清型为03:K6。段旭昌免疫磁珠分离技术IMB及在食品生产中的应用第48页IMB技术检测副溶血性弧菌优点该方法与普通细菌培养分离法相比,极大地提升了环境样品及食品中病原性副溶血性弧菌检出率。利用IMB可有效地吸附、浓缩大量样品中少许病原微生物,IMB为难于从环境及食品中分离病原性副溶血性弧菌问题提供一个有效伎俩。段旭昌免疫磁珠分离技术IMB及在食品生产中的应用第49页其它致病菌检测志贺氏菌例:Islam等应用O抗原特异性单克隆抗体包被免疫磁珠，快速检测粪便中疾痢志贺菌和福氏志贺菌。分离出志贺菌株用PCR扩增方法进行判定。此种免疫磁珠分离与PCR联正当检测志贺菌，较传统培养法敏感、快速(7h)。小肠结肠炎耶尔森氏菌例:Kapperud等用抗小肠结肠炎耶尔森氏菌血清抗体包被磁性微球，从食物和水样中分离，并能将小肠结肠炎耶尔森氏菌与假结核耶尔森氏菌和非致病性耶尔森氏菌区分开来。段旭昌免疫磁珠分离技术IMB及在食品生产中的应用第50页十三免疫磁珠与其它检测伎俩联用免疫磁珠与PCR联用因为PCR技术灵敏度较低，将免疫磁珠技术和PCR技术相结合，建立了新检测系统——磁免疫PCR技术。比如:它以李斯特氏菌单抗包被磁珠，对样品进行前处理，将菌进行富集裂解，再以iap基因保守区域设计引物进行PCR，结果显示该方法含有良好特异性，而且十分灵敏。段旭昌免疫磁珠分离技术IMB及在食品生产中的应用第51页免疫磁珠与ELISA联用利用磁性微球,并以兔