第五章-环境毒理学常用研究方法

第八章环境毒理学

常用研究方法

11/24/20241哈尔滨工业大学王立主要内容5.25.35.4研究方法概述5.1实验材料研究内容染毒技术毒理学的3R原则5.5研究方法概述5.1通用研究方法包括：体外试验

体内试验

流行病学调查体外试验体外试验法（invitrotest）：以器官、组织、细胞和生物大分子为试验对象，在离体状态下进行染毒试验。可以从器官水平、细胞水平、分子水平上研究.(1)器官水平包括器官灌流和组织培养两种方法。器官灌流技术是将受试化学物质经过血管流经特定的脏器，观察环境污染物在脏器内的代谢转化和毒性作用。(2)细胞水平细胞培养在毒理学研究中应用极广泛，所应用的细胞包括已建株的细胞系(株)和原代细胞。细胞培养可用于外来化学物质的毒性和致癌性的各种筛选试验。(3)分子水平近代环境毒理学将生物化学和分子生物学的最近、新技术引用到实验研究中：有关酶、核酸、蛋白质的理论渗透到环境毒理学的多个领域；PCR基因扩增、DNA序列分析、以及单克隆技术等分子生物学的概念和方法已成为环境毒理学研究的重要工具，形成生化和分子毒理学分支。

体内试验体内试验（invivotest）多用整体动物进行，也称整体动物实验。按人体可能接触的剂量和途径使实验动物在一定时间内接触环境污染物，然后观察动物出现的形态和功能的变化。一般采用的试验动物有大鼠、小鼠、家兔、狗、猴等哺乳动物，也可采用水蚤等水生生物及鱼类。按染毒的持续时间不同分为急性、亚急性(或亚慢性)和慢性试验。

①急性毒性试验：其目的是探明环境污染物与机体作短时间接触后所引起的损害作用，找出污染物的作用途径、剂量与效应的关系，并为进行各种动物实验提供设计依据。一般用半数致死量(LD50)、半数致死浓度(LC50)或半数有效量(ED50)来表示急性毒作用的程度。(24h以内)

②亚急性毒性试验：研究环境污染物反复多次作用于机体引起的损害。通过这种试验，可以初步估计环境污染物的最大无作用剂量和中毒阈剂量，了解有无蓄积作用，确定作用的靶器官，并为设计慢性毒性试验提供依据。(1－3个月)

③慢性毒性试验：探查低剂量环境污染物长期作用于机体所引起的损害，确定一种环境污染物对机体的最大无作用剂量和中毒阈剂量，为制订环境卫生标准提供依据。(大于6个月)

流行病学调查——人群调查流行病调查方法是世界环境毒理学广泛采用的研究方法.根据动物试验的结果及对环境污染物毒理作用的预测或假设，选用适当的观察指标对接触该环境污染物的人群进行调查，分析环境污染与人群健康损害的关系。人群调查可以获得污染物对人体毒性作用的直接观察资料，但由于人群往往同时接触多种环境污染物，加之吸烟、饮酒、用药、营养等生活习惯和社会生态条件的不同和变化，对调查结果评定时必须去伪存真.三种方法的比较体内试验：反映环境污染物的综合生物学效应；反映在动物整体状态下环境污染物的各种生物学效应。多用于检测外源化学物的一般毒性。体外试验:多用于对机体急性毒作用的初步筛选，作用机制和代谢转化的深入研究。体外试验的特点是简单、快速、经济、条件易于控制。缺点是体外试验于整体试验相比较缺乏神经—体液调节因素的控制，不能全面反映整体状况下的生物学效应。调查研究：以已有试验结果、已有知识为基础，采用医学流行病学的调查方法。人群调查结果的评定与试验研究进行综合分析，才能得出正确结论。

实验材料植物非哺乳类动物哺乳动物微生物实验材料5.2生态毒理学环境毒理学一、实验动物的准备选择原则——种属选择：1）在机体反应上尽量近似于人体，满足试验要求。2）易获得、易饲养、易管理的动物作为实验材料。3）根据受检物质的化学结构、理化性质选用最敏感、最合适的动物。选择原则——个体选择：1）年龄。幼龄-敏感；成年-急性中毒试验。2）性别。各半。3）生理状态。生殖功能的影响-大鼠、小鼠。4）健康状况。排除对实验结果的影响。动物准备——其他事项：1）实验动物标记编号。染色、耳缘减口、烙印、号牌。2）实验动物捕捉、固定。兔、鼠。3）实验动物麻醉。开放法、封闭法。二、毒物的准备1.毒物物理常数：在评价毒理实验结果和采用估算方法去推算最高容许浓度时，常需要知道毒物的某些物理常数。2.剂型及溶剂：为使毒物能够通过一定途径染毒，需要制成不同的剂型，水溶液、混悬液、油剂、乳化剂、软膏、糊剂等。作为溶剂或助剂的物质应满足条件：1.其本身毒性要小，LD50一般应大于15000ppm2.不与受检毒物产生增毒或减毒作用3.不影响毒物的吸收4.无特殊的应激性或气味三、生物材料的采集和制备（一）血液的采集采血方法主要根据实验目的和所需血量以及动物种类进行选择。注意：采血场所有充足的光线，室温适宜；采血用具和采血部位一般需进行消毒；采血用的注射器和试管必须保持清洁干燥；若需抗凝全血，在注射器或试管内需预加抗凝剂。（二）尿液的收集尿液的连续收集：一次性尿液的收集：收集尿液的注意事项：（三）粪便的收集目的是分析粪便中的毒物及其代谢产物的含量，或者是测定蛋白质和脂肪经肠道的吸收率，以了解毒物对消化功能的作用。可利用代谢笼和粪尿分离器，必要时可采用灌肠法。（四）呼出气的收集收集动物呼出气进行毒物浓度、氧和二氧化碳的分析，以研究毒物的吸收和代谢以及毒物对肺功能的影响。用玻璃面罩将动物的鼻和嘴扣住，再把面罩与呼吸活瓣相连，呼吸活瓣可使进气和呼出气分开，并从不同的管口排出。（五）其他体液的收集精液的收集：唾液的收集：胃液的采集：胆汁、胰液、肠液的收集：（六）实验动物组织匀浆的收集应用于酶活力分析的组织匀浆制备应用于组织毒物萃取的组织匀浆制备四、预备实验预备实验一般主要解决的问题：选择合适的实验动物设计染毒剂量及其分组操作技术的检验和训练发现新线索、新指标一、染毒途径的选择二、吸入染毒三、经口染毒四、注射染毒染毒技术5.3一、染毒途径的选择1、人群接触环境毒物的实际情况2、毒物的理化性质3、受检毒物的来源4、实际情况需要二、吸入染毒法1、动式吸入染毒（补充图）2、静式吸入染毒3、面罩染毒法三、经口染毒法1、喂饲法：将毒物和食物混在一起做成毒饵喂给动物2、滴入：将有毒物质直接滴入动物口腔3、吞咽：毒物按一定剂量装入胶囊，直接送至动物口腔4、灌胃:用于确定某种化学物质的绝对毒性灌胃法在急性试验中，经口给药多用灌胃法，此法剂量准确，适用于小白鼠、大白鼠、家兔等动物。1．小鼠、大鼠（或豚鼠）用输血针头，将其尖端斜面磨平，用焊锡在针尖周围焊一圆头，注意勿堵塞针孔，即成灌胃针；亦可用烧成圆头的硬质玻璃毛细管或特制的塑料毛细管，作为导管。灌胃时将针按在注射器上，吸入药液。左手抓住鼠背部及颈部皮肤将动物固定，右手持注射器，将灌胃针插入动物口中，沿咽后壁徐徐插入食道。动物应固定成垂直体位，针插入时应无阻力。若感到阻力或动物挣扎时，应立即停止进针或将针拔出，以兔损伤或穿破食道以及误入气管。2．狗、兔、猫、猴

灌胃时，先将动物固定，再将特制的扩口器放入动物口中，扩口器之宽度可视动物口腔大小而定，如狗的扩口器可用木料制成长方形，长约10-15cm，粗细应适合狗嘴，约2-3cm，中间粘一小孔，孔的直途为5-10cm。灌胃时将扩口器放于上述动物上下门牙之后，并用绳将它固定于嘴部，将带有弹性的橡皮导管（如导尿管），经扩口器上的小圆孔插入，沿咽后壁而进入食道，此时应检查导管是否正确插入食道，可将导管外口置于一盛水的烧杯中，如不发生气泡，即认为此导管是在食道中，未误入气管，即可将药液灌入。图8-1狗灌胃方法经验方法：给狗、兔等动物灌胃时，可不用扩口器也能顺利将药液灌入胃内。狗灌胃时，用12号灌胃管，左手抓住狗嘴，右手中指由右嘴角插入，摸到最后一对臼齿后的天然空隙，胃管由此空隙顺食管方向不断插入约20cm，可达胃内，将胃管另一端插入水中，如不出气泡，表示确已进入胃，而没误入气管内，即可灌入。兔灌胃时，将兔固定在木制固定盒内左手虎口卡住并固定好兔嘴，右手取14号细导尿管，由右侧唇裂避开门齿，将导管慢慢插入，如插管顺利，动物不挣扎，插入约15cm时，即表示插入胃内，将药液注入。各种动物一次灌胃能耐受的最大容积小鼠为0.5-1.0ml，大鼠4-7ml，豚鼠为4-7ml，家兔为80-150ml，狗为200-500ml。四、注射染毒法1、皮下注射2、皮内注射3、肌肉注射4、腹腔注射5、静脉注射6、淋巴囊注射7、脊髓腔内8、小脑延髓池9、脑内给药10、关节腔内注意：要求毒物对局部损害不能太大（一）皮下注射注射时以左手拇指和食指提起皮肤，将连有5（1/2）号针头的注射器刺入皮下。皮下注射部位一般狗、猫多在大腿外侧，豚鼠在后大腿的内侧或小腹部；大白鼠可在侧下腹部。兔在背部或耳根部注射。蛙可在脊背部淋巴腔注射。（二）皮内注射皮内注射时需将注射的局部脱去被毛，消毒后，用左手拇指和食指按住皮肤并使之绷紧，在两指之间，用结核菌素注射器连4(1/2)细针头，紧贴皮肤表层刺入皮内，然后再向上挑起并再稍刺入，即可注射药液，此时可见皮肤表面鼓起一白色小皮丘。（三）肌肉注射肌肉注射应选肌肉发达，无大血管通过的部位，一般多选臀部。注射时垂直迅速刺入肌肉，回抽针栓如无回血，即可进行注射。给小白鼠、大白鼠等小动物作肌肉注射时，用左手抓住鼠两耳和头部皮肤，右手取连有5（1/2）针头的注射器，将针头刺入大腿外侧肌肉，将药液注入。（四）腹腔注射用大、小白鼠做实验时，以左手抓住动物，使腹部向上，右手将注射针头于左（或右）下腹部刺入皮下，使针头向前推

0.5～1.0cm，再以45度角穿过腹肌，固定针头，缓缓注入药液（图8-2），为避免伤及内脏，可使动物处于头低位，使内脏移向上腹。若实验动物为家兔，进针部位为下腹部的腹白线离开1cm处。图8-2小鼠腹腔注射方法

（五）静脉注射

1．兔：兔耳部血管分布清晰。兔耳中央为动物，耳外缘为静脉。内缘静脉深不易固定，故不用。外缘静脉表浅易固定，常用。先拔去注射部位的被毛，用手指弹动或轻揉兔耳，使静脉充盈，左手食指和中指夹住静脉的近端，拇指绷紧静脉的远端，无名指及小指垫在下面，右手持注射器连6号针头尽量从静脉的远端刺入，移动拇指于针头上以固定针头，放开食指和中指，将药液注入（图8-3），然后拔出针头，用手压迫针眼片刻。图8-3家兔耳缘静脉注射方法

2．小白鼠和大白鼠：一般采用尾静脉注射，鼠尾静脉有三根，左右两侧及背侧各一根，左右两侧尾静脉比较容易固定，多采用，背侧一根也可采用，但位置容易固定。操作时先将动物固定在鼠筒内或扣在烧杯中，使尾巴露出。图8-4小鼠尾部固定

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8-5小鼠尾静脉注射方法

尾部用45～50℃的温水浸润半分钟或用酒精擦拭使血管扩张，并可使表皮角质软化，以左手拇指和食指捏住鼠尾两侧，使静脉充盈，用中指从下面托起尾巴，以无名指和小指夹住尾巴的末梢，右手持注射器连4(1/2)号细针头，使针头与静脉平行（小于30℃），从尾下四分之一处（约距尾尖2-3厘米）处进针，此处皮薄易于刺入，先缓注少量药液，如无阻力，表示针头已进入静脉，可继续注入。注射完毕后把尾部向注射侧弯曲以止血。如需反复注射，应尽可能从末端开始，以后向尾根部方向移动注射（图8-5）。3．狗：狗静脉注射多选前肢内侧皮下头静脉（图8-6）或后肢小隐静脉（图8-7）注射。注射前由助手将动物侧卧，剪去注射部位的被毛，用胶皮带扎紧（或用手抓紧）静脉近端，使血管充盈，从静脉的远端将注射针头平行刺入血管，待有回血后，松开绑带（或两手），缓缓注入药液。图8-6狗前肢头静脉注射

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8-7狗后肢小隐静脉注射4．蛙（或蟾蜍）：将蛙或蟾蜍脑脊髓破坏后，仰卧固定于蛙板上，沿腹中线稍左剪开腹肌，可见到腹静脉贴着腹壁肌肉下行，将注射针头沿血管平行方向刺入即可（8-8）。图

8-8蛙腹壁静脉注射

（六）淋巴囊注射蛙类常采用此法，因其皮下有数个淋巴囊，注入药物甚易吸收。腹部淋巴囊和头背淋巴囊常作为蛙类给药途径。一般多选用腹部淋巴囊给药。注射时将针头从蛙大腿上端刺入，经大腿肌层入腹壁肌层，再进入腹壁皮下，即进入淋巴囊，然后注入药液。有时也可采用胸淋巴囊给药。方法是将针头刺入口腔，使穿过下颌肌层入胸淋巴囊内注入药液，一次最大注射量为1毫升。蛙全身分布为咽、胸、背、腹侧、腹、大腿和脚等七个淋巴囊（图8-9）。图8-9蛙全身淋巴囊分布（七）脊髓腔内给药此法主要用于椎管麻醉或抽取脑脊液。家兔椎管内注射方法：将家兔作自然俯卧式，尽量使其尾向腹侧屈曲，用粗剪将第七腰椎周围背毛剪去，用3%碘酊消毒，干后再用79%酒精将碘酒擦去。在兔背部髌骨脊连线之中点稍下方摸动第七腰椎间隙（第七腰椎与第一骶骨椎之间），插入腰椎穿刺针头。当针到达椎管内时（珠网膜下腔），可见到兔的后肢跳动，即证明穿刺针头已进入椎管。这时不要再向下刺，以兔损伤脊髓。固定好针头，即可将药物注入。（八）小脑延髓池给药此种给药都是在动物麻醉情况下进行的。而且常采用大动物如狗等，小动物很少采用。将狗麻醉后，使狗头尽量向胸部屈曲，用左手摸到其第一颈椎上方的凹陷（枕骨大孔），固定位置，右手取7号钝针头（将针头尖端麻钝），由此凹陷的正中线上，顺平行狗的方向，小心地刺入小脑延髓池。当针头正确刺入小脑延髓池时，注射者会感到针头再向前穿时无阻力，同时可以听到很轻的“咔嚓”一声，即表示针头已穿过硬脑膜进入小脑延髓池，而且可抽出清亮的脑脊液，注射药物前，先抽出一些脑脊液，抽取量根据实验需要注入多少药液决定，即注入多少抽取多少，以保持原来脑脊髓腔里的压力（图8-10）。图

8-10狗小脑延髓池给药

（九）脑内给药此法常用于微生物学动物实验，将病原体等接种于被检动物脑内，然后观察接种后的各种变化。小鼠脑内给药时，选套有塑料管、针尖露出2mm深的5(1/2)针头，由鼠正中额部刺入脑内，注入药物或接种物。给豚鼠、兔、狗等进行脑内注射时，须先用穿颅钢针穿透颅骨，再用注射器针头刺入脑部，再徐徐注入被检物。注射速度一定要慢，避免引起颅内压急骤升高。（十）关节腔内给药此种方法常用于关节炎的动物模型复制。兔给药时，将兔仰卧固定于兔固定台上，剪去关节部被毛，用碘酒或酒精消毒，然后用手从下方和两旁将关节固定，把皮肤稍移向一侧，在膑韧带附着点处上方约0.5厘米处进针。针头从上前方向下后方倾斜刺进，直至针头遇阻力变小，然后针头稍后退，以垂直方向推到关节腔中。针头进入关节腔时，通常可有好象刺破薄膜的感觉，表示针头已进入膝关节腔内，即可注入药液。（十一）其它途径给药皮肤给药为了鉴定药物或毒物经皮肤的吸收作用、局部作用、致敏作用和光感作用等，均需采用经皮肤给药方法。如家兔和豚鼠常采用背部一定面积的皮肤脱毛后，将一定药液涂在皮肤上，经皮肤吸收。直肠内给药此种给药方法常用于动物麻醉。家兔直肠内给药时，取灌肠用的胶皮管或用14号导尿管代替。在胶皮管或导尿管头上涂上凡士林，由助手使兔蹲卧于桌上，以左臂及左腋轻轻按住兔头及前肢，以左手拉住兔尾，露出肛门，并用右手轻握后肢，实验者将橡皮管插入家兔肛门内，浓度约7～9cm，如为雌性动物，注意勿误插入阴道（肛门紧接尾根）。橡皮管插好后，将注射器与橡皮管套紧，即可灌注药液。“

三性试验”

-急性毒性试验

-亚慢性毒性试验

-慢性毒性试验5.4研究内容

-繁殖试验

-蓄积试验

-代谢试验“三致”试验

-致癌变

-致畸变

-致突变急性毒性试验急性毒性：是生物机体一次或24小时内多次接触外源化学物所引起的毒性效应，这种毒性效应可以反应在不同的组织水平上，包括组织、器官和系统的伤害，出现临床症状，甚至死亡。关键点：

半致死量（LD50）和半致死浓度（LC50）的测定1.动物准备

一般采用小动物，如小鼠等。实验动物应预先观察7天左右，以了解其健康情况及正常活动状态。正式实验时，按随机分组原则，一般分成5－6个实验组，每组5－10只动物。

2.剂量选择

LD50或LC50的测定需通过若干剂量组同时给药，最后经数理统计算出。通常用5一6个剂量组，各组间剂量差距可按等差或等比级数设计，组距大小随毒物的毒作用带宽窄而异，常按等比级数1.2一1.5设计，目的是使各剂量组动物的死亡率分布在50％上下。对于没有测试记录的化学物，其剂量选择可先按同系物毒性或文献资料加以估计，也可先用少量动物(比如每组2只)以组距较大的二系列剂量进行预备试验，找出致死作用剂量范围后，再设计出正式实验的剂量组。如倒置现象十分显著，则应从动物选择、药液配制、操作技术及实验条件等方面查找原因并加以克服，重复实验。3.药液配制及染毒实-验给药的剂型，可根据受检化学物的溶解性能，采用水溶液、混悬液、油剂或乳剂由于许多化学毒物不溶或难溶于水，也不易溶于油脂，而有机溶剂又多具有一定毒性，故常配制成乳剂或混悬剂。在非吸人染毒实验中，各剂量组多按单位体重给予等容量药液的方法给药，所以需要首先确定单位体重给药容量L，然后按实验设计的最大剂量组药液浓度，计算配制5Oml乳剂所需毒物量，配成第1号药液，再按设计组距，逐组稀释，分别配制出第Ⅱ号、第皿号、第W号、第V号药液。等容量给药法可以保证不同剂量组动物接受相同容量的药液，排除容量差别可能造成的影响。给药时可按每相差1g体重增减0.Olml计算。急性毒性测定一般可不用对照组，但如配制实验用液中用到新溶剂、新助剂，或实验终结需做病理组织学观察时，则应有对照组。4.症状观察染毒开始后应观察并记录实验动物的中毒表现、生理状况变化和死亡情况。观察时间可根据实验目的、毒作用特点等，确定为几小时、几天、一周或两周，但一般不超过两周。由于不同毒物的毒性作用特征各不相同，故除了观察一般状况及呼吸、循环功能的改变外，还应注意某些特异征象。5.病理学检查及其他指标观察

中毒可导致实验动物病理组织学改变，因此应对中毒死亡动物进行及时的病理学检查，观察器官是否有淤血、出血、水肿或其他变化，并对有变化的脏器做病理组织学检查。对存活动物在观察期满后也应做病理学检查。如果需要，毒性实验可进一步增加观察项目，如对体温、心跳和脑电的测试以及某些理化指标的检查。但需注意：这些指标的测试和检查，不能使用测试半致死量的动物，