紫外分光光度法

第二章紫外-可见吸收光谱法第一节概述第二节朗伯-比尔定律第三节

紫外吸收光谱基本原理第四节紫外可见分光光度计第五节紫外吸收光谱的应用

2024/11/23第一节概述

利用被测物质的分子对可见-紫外光具有选择性吸收的特性而建立的分析方法。一、可见-紫外吸光光度法的特点（1）具有较高的灵敏度。（2）有一定的准确度，该方法相对误差为2%-5%，可满足对微量组分测定的要求。（3）操作简便、快速、选择性好、仪器设备简单。（4）应用广泛2024/11/23单色光：只具有一种波长的光。混合光：由两种以上波长组成的光，如白光。二、物质对光的选择性吸收白光青蓝青绿黄橙红紫蓝1、光的互补性与物质的颜色

物质的颜色是由于物质对不同波长的光具有选择性的吸收作用而产生的，物质的颜色由透过光的波长决定。

如果两种适当颜色的光按一定的强度比例混合可以得白光，这两种光就叫互为补色光。物质呈现的颜色和吸收的光颜色之间是互补关系。2024/11/232、吸收光谱或吸收曲线

吸收曲线：测定某种物质对不同波长单色光的吸收程度，以波长为横坐标，吸光度为纵坐标作图。吸收光谱特征：定性依据吸收峰→λmax

吸收谷→λmin

肩峰→λsh

末端吸收→饱和σ-σ跃迁产生A末端吸收最强峰肩峰峰谷次强峰

max

sh

min

2024/11/23第二节

朗伯-比尔定律

ThetheoryofLambert-BeerLamber-Beer定律偏离Beer定律的因素透光率的测量误差测量条件的选择2024/11/23数学表达式为：A=-lgT=-lgIt/Io=ECLA：吸光度T：透光率

E:吸光系数；C：溶液浓度；L：液层厚度描述物质对单色光吸收强弱与液层厚度和待测物浓度的关系Lamber

定律：A∝lBeer定律：A∝C一、朗伯-比尔定律（吸收光谱法基本定律）2024/11/23续前Lamber-Beer定律的适用条件（前提）

入射光为单色光溶液是稀溶液该定律适用于固体、液体和气体样品在同一波长下，各组分吸光度具有加和性应用：多组分测定2024/11/23续前吸光系数两种表示法：

1）摩尔吸光系数ε：在一定λ下，C=1mol/L，L=1cm时的吸光度

2）E1%1cm百分含量吸光系数/比吸光系数：在一定λ下，C=1g/100ml，L=1cm时的吸光度

3）两者关系ε=10ME1%1cm吸光系数的物理意义：单位浓度、单位厚度的吸光度3、吸光系数2024/11/23二、偏离Beer定律的因素依据Beer定律，A与C关系应为经过原点的直线偏离Beer定律的主要因素表现为以下两个方面（一）光学因素（二）化学因素2024/11/23（一）光学因素

1．非单色光的影响：

Beer定律应用的重要前提——入射光为单色光2．杂散光的影响：

3．反射光和散色光的影响：4．非平行光的影响：（二）化学因素Beer定律适用的另一个前提：稀溶液浓度过高会使C与A关系偏离定律1）离解作用：2）酸效应：3）溶剂作用：2024/11/23三、透光率的测量误差——ΔT影响测定结果的相对误差两个因素：T和ΔTΔT影响因素：仪器噪音

1）暗噪音：与检测器和放大电路不确切性有关

2）讯号噪音：与光讯号有关四、吸光度测量的条件选择：1）测量波长的选择：λmax2）吸光度读数范围的选择：3）参比溶液(空白溶液)的选择：A=0.2~0.72024/11/23五、显色反应及其影响因素显色反应：将被测组分转变成有色化合物的化学反应显色剂：能与被测组分反应使之生成有色化合物的试剂1、对显色反应的要求2、影响显色反应的因素2024/11/23第三节紫外吸收光谱分析基本原理

principlesofUV一、紫外吸收光谱的产生

formationofUV二、有机物紫外吸收光谱ultravioletspectrometryoforganiccompounds2024/11/23一、紫外吸收光谱的产生

formationofUV（一）紫外光与紫外光谱紫外吸收光谱：分子价电子能级跃迁。波长范围：4-800nm.远紫外光区:

4-200nm

近紫外光区:

200-400nm可见光区:400-800nm250300350400nm1234eλ2024/11/23分子吸收光谱的产生——由能级间的跃迁引起物质分子内部三种运动形式：（1）电子相对于原子核的运动；（2）原子核在其平衡位置附近的相对振动；（3）分子本身绕其重心的转动。分子具有三种不同能级：电子能级、振动能级和转动能级分子的内能：电子能量Ee、振动能量Ev

、转动能量Er即:E＝Ee+Ev+Er

ΔΕe>ΔΕv>ΔΕr

能级跃迁：电子受激发，从低能级转移到高能级的过程。2024/11/23价电子：σ电子→饱和的σ键

π电子不饱和的π键

n电子（二）有机物吸收光谱与电子跃迁

ultravioletspectrometryoforganiccompounds基态与激发态：电子吸收能量，由基态→激发态成键轨道与反键轨道：σ<π<n<π*<σ*2024/11/23主要有四种跃迁类型跃迁所需能量为：

σ→σ*

n→σ*

π→π*

n→π*分子中电子的能级和跃迁

2024/11/231

σ→σ＊跃迁

所需能量最大；σ电子只有吸收远紫外光的能量才能发生跃迁；

饱和烷烃的分子吸收光谱出现在远紫外区；

吸收波长λ<200nm；例：甲烷的λmax为125nm,

乙烷λmax为135nm。只能被真空紫外分光光度计检测到；作为溶剂使用；sp*s*RKE,Bnp

E2024/11/232

n→σ＊跃迁

所需能量较大。吸收波长为150～250nm，大部分在远紫外区，近紫外区仍不易观察到。

含非键电子的饱和烃衍生物(含N、O、S和卤素等杂原子)均呈现n→σ*跃迁。sp*s*RKE,Bnp

E2024/11/233.π→π*跃迁：不饱和基团（—C＝C—，—C＝O）

E较小，λ~200nm体系共轭，E更小，λ更大乙烯π→π*跃迁的λmax为162nm，εmax为:1×104L·mol-1·cm－1。165nm217nm

₃

₁

₂

sp*s*RKE,Bnp

E2024/11/234.n→π*跃迁：含杂原子不饱和基团（—C≡N，C＝O）E最小，λ200~400nm（近紫外区）

n

165nm

n

Y=H,Rn→*

180-190nm

→

*

150-160nm

n→*

275-295nm2024/11/235、无机化合物的电子跃迁d—d配位场跃迁—按晶体场理论，金属离子与水或其它配体生成配合物时，原来能量相同的d轨道会分裂成几组能量不等的d轨道，d轨道之间的能量差称为分裂能，配合物吸收辐射能，发生d—d跃迁，吸收光的波长与分裂能的大小反相关。电荷迁移跃迁——指配合物中配位体与金属离子之间，一个电子由一方的一个轨道跃迁到另一方相关的轨道上。——产生电荷迁移跃迁的必要条件：一组分是电子给予体，另一组分是电子接收体。2024/11/23续前紫外光谱电子跃迁类型：n—π*跃迁

π—π*跃迁饱和化合物无紫外吸收电子跃迁类型与分子结构及存在基团有密切联系根据分子结构→推测可能产生的电子跃迁类型；根据吸收谱带波长和电子跃迁类型→推测分子中可能存在的基团（分子结构鉴定）2024/11/23续前1．生色团（发色团）：能产生n→π*跃迁和π→π*跃迁，可吸收紫外-可见光的基团。具有不饱和键和未成对电子的基团；具n电子和π电子的基团；例：C＝C；C＝O；C＝N；—N＝N—注：当出现几个发色团共轭，则几个发色团所产生的吸收带将消失，代之出现新的共轭吸收带，其波长将比单个发色团的吸收波长长，强度也增强（三）相关的基本概念2024/11/232．助色团：本身无紫外吸收，但可以使生色团吸收峰加强同时使吸收峰长移的基团有机物：连有杂原子的饱和基团例：—OH，—OR，—NH—，—NR2—，—X

有机化合物的吸收谱带常常因引入取代基或改变溶剂使最大吸收波长λmax和吸收强度发生变化:

λmax向长波方向移动称为红移，向短波方向移动称为蓝移

(或紫移)。3、红移与蓝移2024/11/23续前4．增色效应和减色效应增色效应：吸收强度增强的效应减色效应：吸收强度减小的效应5．强带和弱带：

εmax>104→强带

εmin<102→弱带6.预离解跃迁

如果分子中的化学键能低于电子激发能，分子在接受较高能量的跃迁过程中，使某些化学键断裂，这种跃迁称为预离解跃迁。不产生分子的吸收或发光光谱。2024/11/23（四）吸收带类型和影响因素1．R带：由含杂原子的不饱和基团的n→π*跃迁产生C＝O；C＝N；—N＝N—E小，λmax250~400nm，εmax<100溶剂极性↑，λmax↓→蓝移（短移）2．K带：由共轭双键的π→π*跃迁产生(—CH＝CH—)n，—CH＝C—CO—λmax>200nm，εmax>104共轭体系增长，λmax↑→红移，εmax↑溶剂极性↑，对于—(—CH＝CH—)n—λmax不变对于—CH＝C—CO—λmax↑→红移2024/11/23续前3．B带：由π→π*跃迁产生芳香族化合物的主要特征吸收带λmax=254nm，宽带，具有精细结构；εmax=200极性溶剂中，或苯环连有取代基，其精细结构消失next4．E带：由苯环环形共轭系统的π→π*跃迁产生芳香族化合物的特征吸收带E1180nmεmax>104

（常观察不到）E2200nmεmax=7000强吸收next苯环有发色团取代且与苯环共轭时，E2带与K带合并一起红移（长移）next2024/11/23续前5、影响吸收带位置的因素：（1）溶剂效应：对λmax影响：next

n-π*跃迁：溶剂极性↑，λmax↓蓝移

π-π*跃迁：溶剂极性↑，λmax↑红移对吸收光谱精细结构影响next

溶剂极性↑，苯环精细结构消失溶剂的选择——极性；纯度高；截止波长<λmax2024/11/23选择溶剂时注意下列几点：溶剂对溶质的溶解性好，且是惰性的。即所成溶液应具有良好的化学和光化学稳定性。选择极性较小的溶剂。溶剂在样品的吸收光谱区应无明显吸收。即溶剂在剪切点以下是透明的。剪切点：以水做溶剂，在1cm厚的样品池中测得溶剂吸光度为0.1时的波长，为溶剂的剪切点。2024/11/23（2）pH值的影响：影响物质存在构型及吸收波长苯酚在酸性或中性水溶液中，有210.5nm及270nm两个吸收带；而在碱性溶液中，则分别红移到235nm和287nm（3）共轭体系的存在----红移如CH2=CH2的

-

*跃迁，

max=165~200nm；而1,3-丁二烯，

max=217nm（4）取代基：红移或蓝移取代基含孤对电子，可使分子红移；取代基为斥电子基，如-R，-OCOR，则使分子蓝移。苯环或烯烃上的H被各种取代基取代，多产生红移。2024/11/23（5）立体结构和互变结构的影响（空间位阻）顺反异构：顺式：λmax=280nm；εmax=10500反式：λmax=295.5nm；εmax=29000互变异构：

酮式：λmax=204nm

烯醇式：λmax=243nm

2024/11/23二、有机化合物的紫外吸收光谱（1）饱和烃及其取代衍生物饱和烃的最大吸收峰一般小于150nm。饱和烃的取代衍生物如卤代烃，可产生n

*的跃迁。例如，CH3Cl、CH3Br和CH3I的n

*跃迁分别出现在173、204和258nm处。2024/11/23（2）不饱和烃及共轭烯烃产生*和

*两种跃迁。在不饱和烃类分子中，当有两个以上的双键共轭时，随着共轭系统的延长，*跃迁的吸收带将明显向长波方向移动，吸收强度也随之增强。共轭烯烃的λmax的计算方法共轭二、三、四烯的λmax的计算（Woodward-Fieser规则）2024/11/23Woodward-Fieser规则2024/11/232024/11/23共轭多烯λmax的计算（Fieser-Kuhn公式）λmax=114+5M+n（48-1.7n）-16.5Rendo-10Rexoεmax=1.74×104nM：烷基数n：共轭双键数Rendo：具有环内双键的环数Rexo：具有环外双键的环数例：全反式β-胡萝卜素的Λmax和εmax的计算Λmax=114+5×10+11（48-1.7×11）-16.5×2=453.3nm（452）εmax=1.74×104×11=19.1×104（15.2×104）2024/11/23α、β不饱和醛、酮、酸、酯的λmax的计算方法基值：α、β不饱和醛207α、β不饱和酮215α、β不饱和六元环酮215α、β不饱和五元环酮202α、β不饱和酸或酯193取代基的取代位置：α、β、γ、δ

烷基：10、12、18、18环外双键不包括C=O例：六元不饱和环酮基值215

共轭双键（30*2）60

同环二烯39

β-位烷基取代12

γ-位及更远烷基取代54

环外双键5

计算值385

实测值3882024/11/23人们对α—莎草酮提出两种结构式，实验值λmax=252nm，问是下面那一种结构式?基本值215nm

位烷基取代

+12nm计算值λmax227nm

基本值215nmα位烷基取代

+10nm

位烷基取代

+24nm

环外双键+5nm计算值λmax254nm

αα

2024/11/23i.单取代苯苯环上有一元取代基时，一般引起B带的精细结构消失，并且各谱带的λmax发生红移，εmax值通常增大。

λmax

B带λmax

E2

苯254204

甲苯262208

苯酚271213

苯甲酸272230（4）苯及其衍生物的紫外光谱2024/11/23b

当一个发色团及一个助色团相互处于（在苯环中）对位时，由于两个取代基效应相反，产生协同作用，λmax产生显著的向红位移。效应相反的两个取代基若相互处于间位或邻位时，则二取代物的光谱与各单取代物的区别是很小的。

260nm

280nm

380nm

280nm

282.5nmii二取代苯a对于二甲苯来说，取代基的位置不同，红移和吸收增强效应不同，通常顺序为：

对位＞间位＞邻位。2024/11/23

c当两个发色基或助色基取代时，由于效应相同，两个基团不能协同，则吸收峰往往不超过单取代时的波长，且邻、间、对三个异构体的波长也相近。例如：

230nm260nm258nm

255nm255nm

2024/11/23苯的多取代衍生物K带的λmax的计算（Scott规则）

基值：

-CO-Alkyl246

-CO-环246

-CHO250

-COO-230

-CN224

iii多取代苯2024/11/232024/11/23推测官能团

200～280nm无吸收不含不饱和键，不含苯环，可能是饱和化合物

210～250nm强吸收π—π*，2个共轭单位

260～350nm强吸收π—π*，3—5个共轭单位

270～350nm弱吸收n—π*，无强吸收，孤立含杂原子的双键C=O,-NO2,-N=N-260nm（230～270）中吸收π—π*，有苯环2024/11/23第四节紫外—可见分光光度计

ultravioletspectrometer基本组成

generalprocess分光光度计的类型

typesofspectrometer

2024/11/23（一）基本组成generalprocess光源单色器样品室检测器显示分为三个部分：光学系统、电学系统及机械系统

1.光源可见光区：钨灯作为光源。紫外区：氢、氘灯。2024/11/23

2.单色器

将光源发射的复合光分解成单色光并可从中选出一任波长单色光的光学系统。①入射狭缝：光源的光由此进入单色器；②准光装置：透镜或返射镜使入射光成为平行光束；③色散元件：将复合光分解成单色光；棱镜或光栅；

④聚焦装置：透镜或凹面反射镜，将分光后所得单色光聚焦至出射狭缝；⑤出射狭缝。2024/11/23续前3．吸收池：玻璃——仅适用于可见光区石英——适用于紫外和可见光区要求：匹配性（对光的吸收和反射应一致）4．检测器：将光信号转变为电信号的装置5．记录装置：讯号处理和显示系统光电池光电管光电倍增管二极管阵列检测器2024/11/23（二）分光光度计的类型typesofspectrometer

2024/11/23（三）分光光度计的校正校正内容：波长校正和吸光度校正。校正方法：校正波长钬玻璃紫外和可见光区分光镨铷玻璃可见光区吸光度校正：K2CrO4标准溶液2024/11/23一、定性分析qualitativeanalysis定性鉴别的依据→吸收光谱的特征吸收光谱的形状吸收峰的数目吸收峰的位置（波长）吸收峰的强度相应的吸光系数第五节紫外-可见吸收光谱的应用

applicationsofUV2024/11/23续前1、对比法同一测定条件下，与标准对照物谱图或标准谱图进行对照比较（1）对比吸收光谱的一致性2024/11/23续前（2）对比吸收光谱的特征值2024/11/23续前（3）对比吸光度或吸光系数的比值：例：2024/11/23续前2、纯度检查和杂质限量测定（1）纯度检查（杂质检查）a峰位不重叠：

找λ→使主成分无吸收，杂质有吸收→直接考察杂质含量b峰位重叠：

主成分强吸收，杂质无吸收/弱吸收→与纯品比较，E↓

杂质强吸收>>主成分吸收→与纯品比较，E↑，光谱变形2024/11/23续前(2)杂质限量的测定：例：肾上腺素中微量杂质——肾上腺酮含量计算

2mg/mL-0.05mol/L的HCL溶液，λ310nm下测定规定A310≤0.05即符合要求的杂质限量≤0.06%2024/11/23（一）单组分定量分析吸光系数法标准曲线法对照法：外标一点法二、定量分析quantitativeanalysis2024/11/23续前1．吸光系数法（绝对法）解：例：维生素B12

的水溶液在361nm处的百分吸光系数为207，用1cm比色池测得某维生素B12溶液的吸光度是0.414，求该溶液的浓度2024/11/23练习例：精密称取B12样品25.0mg，用水溶液配成100ml。精密吸取10.00ml，又置100ml容量瓶中，加水至刻度。取此溶液在1cm的吸收池中，于361nm处测定吸光度为0.507，求B12的百分含量？（维生素B12

的水溶液在361nm处的百分吸光系数为207）解：2024/11/23续前2．标准曲线法2024/11/23示例

芦丁含量测定0.710mg/25mL2024/11/23续前3．对照法（比较法）：外标一点法注：当样品溶液与标准品溶液的稀释倍数相同时2024/11/23练习例：维生素B12的含量测定精密吸取B12注射液2.50mL，加水稀释至10.00mL；另配制对照液，精密称定对照品25.00mg，加水稀释至1000mL。在361nm处，用1cm吸收池，分别测定吸光度为0.508和0.518，求B12注射液注射液的浓度以及标示量的百分含量（该B12注射液的标示量为100μg/mL）解：对照法2024/11/23练习解法二：吸光系数法

2024/11/23续前（二）多组分的定量方法a．两组分吸收光谱不重叠（互不干扰）

两组分在各自λmax下不重叠→分别按单组分定量2024/11/23续前b．两组分吸收光谱部分重叠

λ1→测A1→b组分不干扰→可按单组分定量测Caλ2→测A2→a组分干扰→不能按单组分定量测Ca

2024/11/23续前c两组分吸收光谱完全重叠——混合样品测定解线性方程组法等吸收双波长消去法系数倍率法示差法2024/11/23解线性方程组法步骤：2024/11/23

等吸收双波长法步骤：

消除a的影响测b2024/11/23续前消去b的影响测a注：须满足两个基本条件选定的两个波长下干扰组分具有等吸收点选定的两个波长下待测物的吸光度差值应足够大2024/11/23系数倍率法前提：干扰组分b不成峰形无等吸收点2024/11/23续前步骤：b曲线上任找一点→λ1

另一点→λ2优点：同时将待测组分和干扰组分放大信号K倍，提高了待测组分测定灵敏度abλ1

λ22024/11/231.推断官能团如果一个化合物在紫外区有强的吸收，表明它可能存在共轭体系，吸收波长越长，共轭体系越大。2.判断异构体不同的异构体可能具有不同的紫外光谱，以此来判断属哪个异构体。3.推断分子结构

(可结合Woodward规则的计算结果)三、有机化合物结构辅助解析

structuredeterminationoforganiccompounds2024/11/23

1.可获得的结构信息（1）200-400nm无吸收峰。饱和化合物，单烯。（2）

270-350nm有吸收峰（ε=10-100）醛酮n→π*跃迁产生的R

带。（3）

250-300nm有中等强度的吸收峰（ε=200-2000），芳环的特征吸收（具有精细解构的B带）。（4）

200-250nm有强吸收峰（ε

104），表明含有一个共轭体系（K）带。共轭二烯：K带（

230nm）；

不饱和醛酮：K带

230nm，R带

310-330nm260nm,300nm,330nm有强吸收峰，3,4,5个双键的共轭体系。

2024/11/232.光谱解析注意事项(1)确认

max，并算出㏒ε，初步估计属于何种吸收带；(2)观察主要吸收带的范围，判断属于何种共轭体系；(3)乙酰化位移B带：262nm(ε302)274nm(ε2040)261nm(ε300)(4)pH值的影响加NaOH红移→酚类化合物，烯醇。加HCl兰移→苯胺类化合物。2024/11/233.分子不饱和度的计算定义：不饱和度是指分子结构中达到饱和所缺一价元素的“对”数。如：乙烯变成饱和烷烃需要两个氢原子，不饱和度为1。

计算：若分子中仅含一，二，三，四价元素(H，O，N，C)，则可按下式进行不饱和度的计算：