专题18 生物技术与工程综合 -5年（2020-2024）高考1年模拟生物真题分类汇编（原卷版）

2020-2024年五年高考真题分类汇编PAGEPAGE1专题18生物技术与工程综合考向五年考情考情分析生物技术与工程综合2024年6月浙江卷第23题2024年1月浙江卷第22题2023年6月浙江卷第23题2023年1月浙江卷第24题2022年6月浙江卷第29题2022年1月浙江卷第29题2021年6月浙江卷第29题2021年1月浙江卷第29题2020年7月浙江卷第29题2020年1月浙江卷第29题选择性必修3模块的综合考查，以发酵工程、细胞工程的真实情景为引入，结合多个工程的知识进行解答，其中基因工程基本上年年考查，这一模块考查学生基础知识掌握程度、知识综合应用能力、分析和获取信息的能力。1、（2024年6月浙江卷）植物体在干旱、虫害或微生物侵害等胁迫过程中会产生防御物质，这类物质属于次生代谢产物。次生代谢产物在植物抗虫、抗病等方面发挥作用，也是药物、香料和色素等的重要来源。次生代谢产物X的研发流程如下：筛选高产细胞→细胞生长和产物X合成关系的确定→发酵生产X回答下列问题：（1）获得高产细胞时，以X含量高的植物品种的器官和组织作为_____，经脱分化形成愈伤组织，然后通过液体振荡和用一定孔径的筛网进行_____获得分散的单细胞。（2）对分离获得的单细胞进行_____培养，并通过添加_____或营养缺陷培养方法获取细胞周期同步、遗传和代谢稳定、来源单一的细胞群。为进一步提高目标细胞的X含量，将微生物菌体或其产物作为诱导子加入到培养基中，该过程模拟了_____的胁迫。（3）在大规模培养高产细胞前，需了解植物细胞生长和产物合成的关系。培养细胞生产次生代谢产物的模型分为3种，如图所示。若X只在细胞生长停止后才能合成，则X的合成符合图_____（填“甲”“乙”“丙”），根据该图所示的关系，从培养阶段及其目标角度，提出获得大量X的方法。_____（4）多种次生代谢产物在根部合成与积累，如人参、三叶青等药用植物，可通过_____培养替代细胞悬浮培养生产次生代谢产物。随着基因组测序和功能基因组学的发展，在全面了解生物体合成某次生代谢产物的_____和_____的基础上，可利用合成生物学的方法改造酵母菌等微生物，利用_____工程生产植物的次生代谢产物。2、（2024年1月浙江卷）锌转运蛋白在某种植物根部细胞特异性表达并定位于细胞质膜，具有吸收和转运环境中Zn2+的功能。为研究该植物2种锌转运蛋白M和N与吸收Zn2+相关的生物学功能，在克隆M、N基因基础上，转化锌吸收缺陷型酵母，并进行细胞学鉴定。回答下列问题：（1）锌转运蛋白基因M、N克隆。以该植物______为材料提取并纯化mRNA，反转录合成cDNA。根据序列信息设计引物进行PCR扩增，PCR每个循环第一步是进行热变性处理，该处理的效果类似于生物体内______的作用效果。PCR产物琼脂糖凝胶电泳时，DNA分子因为含______而带负电荷，凝胶点样孔端应靠近电泳槽负极接口；当2个PCR产物分子量接近时，若延长电泳时间，凝胶中这2个条带之间的距离会______。回收DNA片段，连接至克隆载体，转化大肠杆菌，测序验证。（2）重组表达载体构建。分别将含M、N基因的重组质粒和酵母表达载体同时进行双酶切处理，然后利用______连接，将得到的重组表达载体转化大肠杆菌。用PCR快速验证重组转化是否成功。此反应可以用大肠杆菌悬液当模板的原因是______。（3）酵母菌转化。取冻存的锌吸收缺陷型酵母菌株，直接在固体培养基进行______培养，活化后接种至液体培养基，采用______以扩大菌体数量，用重组表达载体转化酵母菌。检测M、N基因在受体细胞中的表达水平，无显著差异。（4）转基因酵母功能鉴定。分别将转化了M、N基因的酵母菌株于液体培养基中培养至OD600为0.6。将菌液用______法逐级稀释至OD600为0.06、0.006和0.0006，然后各取10μL菌液用涂布器均匀涂布在固体培养基上，培养2天，菌落生长如图。该实验中阴性对照为______。由实验结果可初步推测：转运蛋白M和N中，转运Zn2+能力更强的是______，依据是______。注：OD600为波长600nm下的吸光值，该值越大，菌液浓度越高；空载体为未插入M或N基因的表达载体。3、（2023年6月浙江卷）赖氨酸是人体不能合成的必需氨基酸，而人类主要食物中的赖氨酸含量很低，利用生物技术可提高食物中赖氨酸含量。回答下列问题：（1）植物细胞合成的赖氨酸达到一定浓度时，能抑制合成过程中两种关键酶的活性，导致赖氨酸含量维持在一定浓度水平，这种调节方式属于______。根据这种调节方式，在培养基中添加______，用于筛选经人工诱变的植物悬浮细胞，可得到抗赖氨酸类似物的细胞突变体，通过培养获得再生植株。（2）随着转基因技术与动物细胞工程结合和发展，2011年我国首次利用转基因和体细胞核移植技术成功培育了高产赖氨酸转基因克隆奶牛。其基本流程为：①构建乳腺专一表达载体。随着测序技术的发展，为获取富含赖氨酸的酪蛋白基因（目的基因），可通过检索______获取其编码序列，用化学合成法制备得到。再将获得的目的基因与含有乳腺特异性启动子的相应载体连接，构建出乳腺专一表达载体。②表达载体转入牛胚胎成纤维细胞（BEF）。将表达载体包裹到磷脂等构成的脂质体内，与BEF膜发生______，表达载体最终进入细胞核，发生转化。③核移植。将转基因的BEF作为核供体细胞，从牛卵巢获取卵母细胞，经体外培养及去核后作为______。将两种细胞进行电融合，电融合的作用除了促进细胞融合，同时起到了______重组细胞发育的作用。④重组细胞的体外培养及胚胎移植。重组细胞体外培养至______，植入代孕母牛子宫角，直至小牛出生。⑤检测。DNA水平检测：利用PCR技术，以非转基因牛耳组织细胞作为阴性对照，以______为阳性对照，检测到转基因牛耳组织细胞中存在目的基因。RNA水平检测：从非转基因牛乳汁中的脱落细胞、转基因牛乳汁中的脱落细胞和转基因牛耳组织细胞，提取总RNA，对总RNA进行______处理，以去除DNA污染，再经逆转录形成cDNA，并以此为______，利用特定引物扩增目的基因片段。结果显示目的基因在转基因牛乳汁中的脱落细胞内表达，而不在牛耳组织细胞内表达，原因是什么？______。4、（2023年1月浙江卷）甲植物细胞核基因具有耐盐碱效应，乙植物细胞质基因具有高产效应。某研究小组用甲、乙两种植物细胞进行体细胞杂交相关研究，基本过程包括获取原生质体、诱导原生质体融合、筛选融合细胞、杂种植株再生和鉴定，最终获得高产耐盐碱再生植株。回答下列问题：（1）根据研究目标，在甲、乙两种植物细胞进行体细胞杂交前，应检验两种植物的原生质体是否具备__________的能力。为了便于观察细胞融合的状况，通常用不同颜色的原生质体进行融合，若甲植物原生质体采用幼苗的根为外植体，则乙植物可用幼苗的__________为外植体。（2）植物细胞壁的主要成分为__________和果胶，在获取原生质体时，常采用相应的酶进行去壁处理。在原生质体融合前，需对原生质体进行处理，分别使甲原生质体和乙原生质体的__________失活。对处理后的原生质体在显微镜下用__________计数，确定原生质体密度。两种原生质体1∶1混合后，通过添加适宜浓度的PEG进行融合；一定时间后，加入过量的培养基进行稀释，稀释的目的是__________。（3）将融合原生质体悬浮液和液态的琼脂糖混合，在凝固前倒入培养皿，融合原生质体分散固定在平板中，并独立生长、分裂形成愈伤组织。同一块愈伤组织所有细胞源于__________。下列各项中能说明这些愈伤组织只能来自于杂种细胞的理由是哪几项？__________A．甲、乙原生质体经处理后失活，无法正常生长、分裂B．同种融合的原生质体因甲或乙原生质体失活而不能生长、分裂C．培养基含有抑制物质，只有杂种细胞才能正常生长、分裂D．杂种细胞由于结构和功能完整可以生长、分裂（4）愈伤组织经__________可形成胚状体或芽。胚状体能长出__________，直接发育形成再生植株。（5）用PCR技术鉴定再生植株。已知甲植物细胞核具有特异性DNA序列a，乙植物细胞质具有特异性DNA序列b；M1、M2为序列a的特异性引物，N1、N2为序列b的特异性引物。完善实验思路：Ⅰ．提取纯化再生植株的总DNA，作为PCR扩增的__________。Ⅱ．将DNA提取物加入PCR反应体系，__________为特异性引物，扩增序列a；用同样的方法扩增序列b。Ⅲ．得到的2个PCR扩增产物经__________后，若每个PCR扩增产物在凝胶中均出现了预期的__________个条带，则可初步确定再生植株来自于杂种细胞。5、（2022年6月浙江卷）回答下列（一）、（二）小题：（一）回答与产淀粉酶的枯草杆菌育种有关的问题：（1）为快速分离产淀粉酶的枯草杆菌，可将土样用___________制成悬液，再将含有悬液的三角瓶置于80℃的___________中保温一段时间，其目的是___________。（2）为提高筛选效率，可将菌种的___________过程与菌种的产酶性能测定一起进行：将上述悬液稀释后涂布于淀粉为唯一碳源的固体培养基上培养，采用___________显色方法，根据透明圈与菌落直径比值的大小，可粗略估计出菌株是否产酶及产酶性能。（3）为了获得高产淀粉酶的枯草杆菌，可利用现有菌种，通过___________后再筛选获得，或利用转基因、___________等技术获得。（二）回答与植物转基因和植物克隆有关的问题：（4）在用农杆菌侵染的方法进行植物转基因过程中，通常要使用抗生素，其目的一是抑制___________生长，二是筛选转化细胞。当选择培养基中抗生素浓度___________时，通常会出现较多假阳性植株，因此在转基因前需要对受体进行抗生素的___________检测。（5）为提高培育转基因植株的成功率，植物转基因受体需具有较强的___________能力和遗传稳定性。对培养的受体细胞遗传稳定性的早期检测，可通过观察细胞内___________形态是否改变进行判断，也可通过观察分裂期染色体的___________，分析染色体组型是否改变进行判断。（6）植物转基因受体全能性表达程度的高低主要与受体的基因型、培养环境、继代次数和___________长短等有关。同时也与受体的取材有关，其中受体为___________时全能性表达能力最高。6、（2022年1月浙江卷)回答下列（一）、（二）小题：（一）红曲霉合成的红曲色素是可食用的天然色素，具有防腐、降脂等功能。研究者进行了红曲色素的提取及红色素的含量测定实验，流程如下：（1）取红曲霉菌种斜面，加适量____________洗下菌苔，制成菌悬液并培养，解除休眠获得____________菌种。经液体发酵，收集红曲霉菌丝体，红曲霉菌丝体与70%乙醇溶液混合，经浸提、____________，获得的上清液即为红曲色素提取液。为进一步提高红曲色素得率，可将红曲霉细胞进行____________处理。（2）红曲色素包括红色素、黄色素和橙黄色素等，红色素在390nm、420nm和505nm波长处均有较大吸收峰。用光电比色法测定红曲色素提取液甲的红色素含量时，通常选用505nm波长测定的原因是____________。测定时需用____________作空白对照。（3）生产上提取红曲色素后的残渣，经__________处理后作为饲料添加剂或有机肥，这属于废弃物的无害化和__________处理。（二）我国在新冠疫情方面取得了显著的成效，但全球疫情形势仍然非常严峻、尤其是病毒出现了新变异株——德尔塔、奥密克戎，更是威胁着全人类的生命健康。（4）新冠病毒核酸定性检测原理是：以新冠病毒的单链RNA为模板，利用__________酶合成DNA，经PCR扩增，然后在扩增产物中加入特异的__________，如果检测到特异的杂交分子则核酸检测为阳性。（5）接种疫苗是遏制新冠疫情蔓延的重要手段。腺病毒疫苗的制备技术要点是：将腺病毒的复制基因敲除；以新冠病毒的__________基因为模板合成的DNA插入腺病毒基因组，构建重组腺病毒。重组腺病毒在人体细胞内表达产生新冠病毒抗原，从而引发特异性免疫反应。在此过程中，腺病毒的作用是作为基因工程中目的基因的____________。将腺病毒复制基因敲除的目的是____________。（6）单克隆抗体有望用于治疗新冠肺炎。单克隆抗体的制备原理是：取免疫阳性小鼠的____________细胞与骨髓瘤细胞混合培养，使其融合，最后筛选出能产生特定抗体的杂交瘤细胞。与植物组织培养相比，杂交瘤细胞扩大培养需要特殊的成分，如胰岛素和____________。7、(2021年6月浙江卷)回答下列（一）、（二）小题：（一）回答与甘蔗醋制作有关的问题：（1）为了获得酿造甘蔗醋的高产菌株，以自然发酵的甘蔗渣为材料进行筛选。首先配制醋酸菌选择培养基：将适量的葡萄糖、KH2PO4、MgSO4溶解并定容，调节pH，再高压蒸汽灭菌，经__________后加入3%体积的无水乙醇。然后将10g自然发酵的甘蔗渣加入选择培养基，振荡培养24h。用__________将少量上述培养液涂布到含CaCO3的分离培养基上，在30℃培养48h。再挑取分离培养基上具有__________的单菌落若干，分别接种到与分离培养基成分相同的__________培养基上培养24h后，置于4℃冰箱中保存。（2）优良产酸菌种筛选。将冰箱保存的菌种分别接入选择培养基，培养一段时间后，取合适接种量的菌液在30℃、150r/min条件下振荡培养。持续培养至培养液中醋酸浓度不再上升，或者培养液中______含量达到最低时，发酵结束。筛选得到的优良菌种除了产酸量高外，还应有____________________（答出2点即可）等特点。（3）制醋过程中，可将甘蔗渣制作成固定化介质，经_________后用于发酵。其固定化方法为_________。（二）斑马鱼是一种模式动物，体外受精发育，胚胎透明、便于观察，可用于水质监测，基因功能分析以及药物毒性与安全性评价等。（1）由于人类活动产生的生活污水日益增多，大量未经处理的污水直接排入河流、湖泊会引起水体__________，导致藻类大量繁殖形成水华。取水样喂养斑马鱼，可用斑马鱼每周的体重和死亡率等指标监测水体污染程度。（2）为了研究某基因在斑马鱼血管发育过程中的分子调控机制，用DNA连接酶将该基因连接到质粒载体形成_______，导入到大肠杆菌菌株DH5α中。为了能够连接上该目的基因、并有利于获得含该目的基因的DH5α阳性细胞克隆，质粒载体应含有__________（答出2点即可）。提取质粒后，采用____法，将该基因导入到斑马鱼受精卵细胞中，培养并观察转基因斑马鱼胚胎血管的发育情况。（3）为了获取大量斑马鱼胚胎细胞用于药物筛选，可用__________分散斑马鱼囊胚的内细胞团，取分散细胞作为初始材料进行__________培养。培养瓶中添加成纤维细胞作为__________，以提高斑马鱼胚胎细胞克隆的形成率。8、(2021年1月浙江卷)回答下列（一）、（二）小题：（一）某环保公司从淤泥中分离到一种高效降解富营养化污水污染物的细菌菌株，制备了固定化菌株。（1）从淤泥中分离细菌时常用划线分离法或________法，两种方法均能在固体培养基上形成________。对分离的菌株进行诱变、________和鉴定，从而获得能高效降解富营养化污水污染物的菌株。该菌株只能在添加了特定成分X的培养基上繁殖。（2）固定化菌株的制备流程如下；①将菌株与该公司研制的特定介质结合；②用蒸馏水去除________；③检验固定化菌株的________。菌株与特定介质的结合不宜直接采用交联法和共价偶联法，可以采用的2种方法是________。（3）对外，只提供固定化菌株有利于保护该公司的知识产权，推测其原因是________。（二）三叶青为蔓生的藤本植物，以根入药。由于野生三叶青对生长环境要求非常苛刻，以及生态环境的破坏和过度的采挖，目前我国野生三叶青已十分珍稀。（1）为保护三叶青的________多样性和保证药材的品质，科技工作者依据生态工程原理，利用________技术，实现了三叶青的林下种植。（2）依据基因工程原理，利用发根农杆菌侵染三叶青带伤口的叶片，叶片产生酚类化合物，诱导发根农杆菌质粒上vir系列基因表达形成________和限制性核酸内切酶等，进而从质粒上复制并切割出一段可转移的DNA片段（T-DNA）。T-DNA进入叶片细胞并整合到染色体上，T-DNA上rol系列基因表达，产生相应的植物激素，促使叶片细胞持续不断地分裂形成________，再分化形成毛状根。（3）剪取毛状根，转入含头孢类抗生素的固体培养基上进行多次________培养，培养基中添加抗生素的主要目的是________。最后取毛状根转入液体培养基、置于摇床上进行悬浮培养，通过控制摇床的________和温度，调节培养基成分中的________，获得大量毛状根，用于提取药用成分。9、(2020年7月浙江卷)回答下列（一）、（二）小题：（一）回答与柑橘加工与再利用有关的问题：（1）柑橘果实经挤压获得果汁后，需用果胶酶处理，主要目的是提高果汁的__________。为确定果胶酶的处理效果，对分别加入不同浓度果胶酶的果汁样品，可采用3种方法进行实验：①取各处理样品，添加相同体积的__________，沉淀生成量较少的处理效果好。②对不同处理进行离心，用比色计对上清液进行测定，OD值__________的处理效果好。③对不同处理进行__________，记录相同体积果汁通过的时间，时间较短的处理效果好。（2）加工后的柑橘残渣含有抑菌作用的香精油及较多的果胶等。为筛选生长不被香精油抑制且能高效利用果胶的细菌，从腐烂残渣中分离得到若干菌株，分别用无菌水配制成__________，再均匀涂布在LB固体培养基上。配制适宜浓度的香精油，浸润大小适宜并已__________的圆形滤纸片若干，再贴在上述培养基上。培养一段时间后，测量滤纸片周围抑制菌体生长形成的透明圈的直径大小。从直径__________的菌株中取菌接种到含有适量果胶的液体培养基试管中培养，若有果胶酶产生，摇晃试管并观察，与接种前相比，液体培养基的__________下降。（二）回答与基因工程和植物克隆有关的问题：（1）天然农杆菌的Ti质粒上存在着一段DNA片段（T-DNA），该片段可转移并整合到植物细胞染色体上。为便于转基因植物在组织培养阶段的筛选，设计重组Ti质粒时，应考虑T-DNA中要有可表达的目的基因，还需要有可表达的__________。（2）结合植物克隆技术进行转基因实验，为获得转基因植株，农杆菌侵染的宿主一般要选用具有优良性状、较高的遗传稳定性、__________及易被农杆菌侵染等特点的植物材料。若植物材料对农杆菌不敏感，则可用__________的转基因方法。（3）利用带侧芽的茎段获得丛状苗的过程与利用茎段诱导产生愈伤组织再获得丛状苗的过程相比，前者总培养时间__________，且不经历__________过程，因而其遗传性状稳定，是大多数植物快速繁殖的常用方法。（4）与发芽培养基相比，配制转基因丛状苗生根培养基时，可根据实际情况适当添加__________，促进丛状苗基部细胞分裂形成愈伤组织并进一步分化形成__________，最终形成根。还可通过改变MS培养基促进生根，如_____（A．提高蔗糖浓度B．降低培养基浓度C．提高大量元素浓度D．不添加琼脂）。10、(2020年1月浙江卷)回答下列（一）、（二）小题：（一）回答与泡菜制作有关的问题：（1）用萝卜等根菜类蔬菜制作泡菜，用热水短时处理，可抑制某些微生物产生_____，从而使成品泡菜口感较脆。同时，该处理也会使泡菜发酵时间缩短，其原因是_______。（2）泡菜发酵初期，由于泡菜罐加盖并水封，会使______菌被逐渐抑制。发酵中期，乳酸菌大量繁殖，会使______菌受到抑制。发酵后期，乳酸生产过多，会使乳酸菌受到抑制。（3）从泡菜汁中可分离制作酸奶的乳酸菌，首先对经多次发酵的泡菜汁进行过滤，然后取滤液进行______，再用______的方法在某种含牛乳的专用的培养基中进行初步筛选。该培养基必须含有______，以便于观察是否产酸。（4）自然界中醋杆菌常与乳酸菌共同生长。若要筛选出醋杆菌，则其专用的培养基中应添加______。（二）回答与基因工程和植物克隆有关的问题：（1）为了获取某植物叶片无菌的原生质体，先将叶片经表面消毒并去除下表皮，再将其置于经______处理的较高渗透压的混合酶液中。酶解后，经多次离心获得原生质体。然后测定该原生质体的活性，可采用的方法有______（答出2点即可）。（2）若要获得已知序列的抗病基因，可采用______或PCR的方法。为了提高目的基因和质粒重组的成功率，选择使用______，对含目的基因的DNA片段进行处理，使其两端形成不同的黏性末端，对质粒也进行相同的处理，然后用DNA连接酶连接形成重组质粒。通过在大肠杆菌中______，以获得大量的重组质粒，最终将其导入原生质体中。（3）原生质体在培养过程中，只有重新形成______后，才可进行有丝分裂。多次分裂形成的小细胞团可通过______或器官发生的途径再生植株。选择题1．（2024·浙江温州·三模）普通小麦是两性植株，体细胞中染色体成对存在。条锈病由条锈菌引起，严重危害小麦生产，Yr5和Yr15基因都是有效的显性抗条锈病基因。回答下列问题：(1)Yr5基因和Yr15基因分别在斯卑尔脱小麦和野生二粒小麦中被发现，两种基因的根本区别是不同。将Yr5基因或Yr15基因导入普通小麦中，实现了物种间的(填变异类型)，提高了小麦的抗逆性。(2)研究者将Yr15基因整合到普通小麦1B染色体的短臂上(如图甲)，获得抗条锈病小麦品系F。提取抗条锈病小麦的作为PCR的模板扩增Yr15基因，用凝胶电泳技术分离、鉴定扩增产物。利用上述方法不能区分纯合和杂合的抗条锈病小麦，因为，两者电泳后DNA条带的数量和位置相同。(3)研究者培育了不抗条锈病小麦品系T，其1B染色体的短臂(1BS)被黑麦1R染色体的短臂(1RS)取代，形成了B．R染色体(如图乙)，B．R染色体形成的原因是发生了染色体结构变异中的。品系T的其他染色体形态、功能与正常小麦相同。为检测小麦细胞中的B．R染色体，研究者根据该染色体中DNA片段的特殊核苷酸序列，设计了荧光标记的探针1RNOR，将该探针导入小麦的体细胞，根据观察到荧光点的数目可判断细胞中B．R染色体数目。注：B．R染色体可与IB染色体联会并正常分离，但IRS与IBS不能发生重组。(4)以纯合的不抗条锈病小麦品系T、条锈菌、探针1RNOR及抗条锈病小麦品系F(含杂合子和纯合子)为材料，可快速获得大量纯合的抗条锈病小麦，方法如下：让纯合小麦品系T与小麦品系F杂交得到F₁代，。(5)研究者将Yr5基因导入小麦品系T中，得到图丙所示植株，将该植株与杂合的小麦品系F杂交，让所有F₁植株进行自交，用探针1RNOR对F₂植株进行检测，若各种基因型的植株结籽率相同，F₂植株中抗条锈病且含荧光点的植株占。2．（2024·浙江金华·模拟预测）纤维素酶能将纤维素降解为单糖或寡糖，且转化过程绿色、低碳，被认为是纤维素资源化利用的可持续方法。在牛、羊等反刍动物的瘤胃中有能分解纤维素的微生物。某科研团队按照下图所示的流程分离瘤胃中的纤维素分解菌，实验中需要甲、乙两种培养基，并在平板上筛选到有透明降解圈的菌落。(1)过程①中甲培养基中除水、无机盐、氮源还应有成分，培养基表面加入一层无菌的石蜡主要目的是。(2)过程②中用适宜浓度NaCl溶液而不用无菌水进行梯度稀释的目的是。(3)科学家发现分离到的微生物产纤维素酶能力弱，进一步研究发现其体内的M基因抑制了其体内纤维素酶基因表达。某科研团队基于CRISPR/Cas9系统拟对某细菌内的M基因进行敲除，以探究该基因对其体内纤维素酶基因表达的调控效果。CRISPR/Cas9系统是其中一种能敲除特定基因的系统，该系统主要包含Cas9蛋白和由tracrRNA和crRNA形成的sgRNA两部分组成，sgRNA能特异性识别并结合特定的DNA序列，从而引导Cas9蛋白到相应位置剪切DNA。①在设计sgRNA序列时，必须事先测定M基因的，从而设计一段能得到sgRNA的DNA．在sgRNA与目的基因特定碱基序列部分结合，结合区最多含有种核苷酸，若要将M基因从目标DNA上剪切下来，需要设计种sgRNA。②将sgRNA基因和Cas9蛋白基因导入目标细菌，科研人员为提高转化效率，常常用处理目标细菌一旦细胞中同时含有sgRNA和Cas9，Cas9就会与sgRNA结合在一起并在sgRNA的带领下，来到能够与sgRNA的目的基因处，特异性地切割M基因。③将CRISPR/Cas9系统基因重组载体成功转染至目标细菌后，与对照组相比，实验组纤维素酶的表达量如图所示，由此得出的实验结论是，判断依据是。3．（2024·浙江绍兴·模拟预测）A型塞内卡病毒(SVA)会导致猪患水疱传染病，症状与猪口蹄疫等传染病非常相似，增加了临床鉴别诊断的难度。VP1蛋白是SVA核衣壳的主要成分，可作为SVA诊断的靶蛋白。研究人员尝试制备抗VP1蛋白单克隆抗体，以便快速、准确检测SVA病毒。回答下列问题：(一)基因工程抗原的制备(1)提取病毒RNA，经形成cDNA，根据GenBank上发表的VP1蛋白基因序列，设计一对特异性引物，在引物的(5’或3’)端引入限制酶BamHⅠ和XhoI的识别序列，并进行PCR扩增。考虑一个模板DNA分子的扩增，PCR第四次循环时，需要消耗对引物。扩增产物经琼脂糖凝胶电泳，分析正确后，通常还需进行序列测定，原因是。(2)将回收后的VP1基因片段及pET-28a载体经酶切和连接后转化大肠杆菌DH5a菌株，接种至LB固体培养基。37℃恒温箱培养，挑取至LB液体培养基，置于37℃摇床震荡培养12h，提取重组质粒，经鉴定正确后，转化至大肠杆菌BL21菌株。扩增成功转化的菌株，最后经后收集菌体沉淀，并细菌，纯化得到VP1蛋白。(二)抗VP1蛋白单克隆抗体的制备(3)用纯化的VPl蛋白多次免疫小鼠，然后诱导小鼠的脾细胞和SP2/0细胞融合，推测SP2/0细胞的生长特点是。常用方法有PEG融合法、电融合法和。通过选择培养的方法筛选出杂交瘤细胞，再经过96孔板培养和抗体检测筛选出能够产生特异性抗体的杂交瘤细胞。将筛选到的2个杂交瘤细胞株分别注射到小鼠腹腔中，从腹水中成功提取得到了2种鼠源单克隆抗体—2E10和3E4。(4)为进一步确定2E10和3E4在VP1蛋白上的结合位点，将VP1蛋白截为4段(VP1-1~VP1-4)，电泳后分别用2E10和3E4为探针进行杂交，结果如图所示。根据实验结果，可判断2E10和3E4与VP1的结合位点是(填“相同”或“不同”)的，依据是。4．（2024·浙江绍兴·模拟预测）绍兴腐乳，又叫“霉豆腐”，具有酒醉醇香、细腻松酥、入口即化等特点，是浙江地区的传统名菜。其制作的流程是：让豆腐表面长出毛霉→加盐腌制→加卤汤装瓶→密封腌制。腐乳味道鲜美的主要原因是微生物产生的蛋白酶和脂肪酶等将豆腐中的蛋白质和脂肪等分解成小分子的肽、氨基酸、脂肪酸等，其中的氨基酸与钠盐作用形成氨基酸钠（其中的谷氨酸钠是味精的主要成分）。研究人员欲从自然发酵的传统“霉豆腐”中筛选出新的毛霉菌株以进一步改良风味。(1)腐乳发酵过程中所用的毛霉菌株是一种菌。腌制完成后需要加卤汤装瓶，卤汤中酒精的含量一般控制在12%左右，从发酵角度分析主要原因是酒精含量过高，导致；过低，导致杂菌生长，引起变质。(2)酪素培养基的原理是在培养基中添加酪素，如果菌株能产生蛋白酶并分泌到胞外，则能将酪素降解形成透明圈，从培养基的用途上分，该培养基属于（填“选择”或“鉴别”）培养基。Hc值是透明圈直径与菌落直径的比值，据Hc值初步筛选出三种具有高蛋白酶活力的菌株编号为M2、M3、M4，原人工接种发酵工艺所用的毛霉菌株编号为M1。将各组毛霉孢子以1：1的比例两两混合，接种于豆腐小块表面，分别以接种为对照，培养后测定各组蛋白酶活力和脂肪酶活力如图1所示（柱状图上的误差线“I”代表数据的波动范围）。根据下图1数据，最优的毛霉菌株组合是。(3)根据以上研究，研究者想通过以下细胞工程的方案获得M2M3杂种菌株，以期获得优质毛霉菌株。处理③过程可选择、离心等物理方法，也可选择合适的化学方法；在此处理前需要先对原生质体2和3进行。在获得杂种毛霉后，往往还需要经过和鉴定。结果发现，利用细胞工程得到的杂种毛霉并没有达到预期的效果，其原因可能之一是。(4)另一研究小组想通过改造M4菌株形成新的单菌株毛霉发酵工艺，图3为M4菌株改造的基本思路。图3的流程是利用工程对毛霉进行改造，A是指活力更高的（蛋白质）。若图4为目的基因的部分序列：现需要在目的基因上游添加EcoRⅠ识别序列（5'-G↓AATTC-3'），下游添加BamHⅠ识别序列（5’-G↓GATCC-3'）以便与载体正确链接，利用PCR扩增目的基因应选择的一对引物是。上游引物下游引物A5'-…GAATTCATGACAGTTAGT…-3'5'-…GGATCCTCACCGGCAGTA…-3'B5'-…GGATCCATGACAGTTAGT…-3'5'-…GAATTCTCACCGGCAGTA…-3'C5'-…GAATTCTACTGTCAATCA…-3'5'-…GGATCCAGTGGCCGTCAT…-3'D5'-…GAATTCAGTGGCCGTCAT…-3'5'-…GGATCCTACTGTCAATCA…-3'5．（2024·浙江绍兴·模拟预测）叶酸是生物体内极其重要的维生素，化学性质不稳定，部分植物和微生物可以合成叶酸，人类则需额外补充。GCHI和ADCS是叶酸合成途径中两种重要的酶。研究人员通过RACE技术获得转录因子APBP2基因，并将其在粮食作物小麦中过量表达，结果显示转基因小麦中叶酸量显著提高，人类有望通过食用面包补充部分叶酸。回答下列问题：(1)RACE技术是一种基于PCR技术利用低含量的mRNA快速扩增DNA的有效方法，通过此技术获取大量APBP2基因需经逆转录和两个基本过程，这两个过程需要逆转录和酶。(2)PCR的产物可通过凝胶电泳鉴定，由于APBP2基因在电泳缓冲液中带电，电泳时加样孔一端应该靠近极。电泳结果如图甲，其中1号泳道是DNAMarker的电泳结果，DNAMarker是一组已知长度和的标准DNA片段混合物，2号泳道是以为材料做的阳性对照组，3号泳道为实验组。含有APBP2基因条带的凝胶可以用刀片切割下来，回收凝胶中的DNA片段，从而达到目的。

(3)为提高转录因子APBP2的表达量，研究人员构建了携带特异性强启动子的APBP2基因表达载体，如图乙。强启动子是一段有特殊结构的DNA片段，能被识别并结合，驱动基因的持续转录，该特异性启动子能使APBP2基因在小麦植株的部位表达。(4)将含重组Ti质粒的农杆菌和小麦愈伤组织混合培养一段时间，经过后进行植物组织培养，在培养基中加入进行筛选，此物质能抑制叶绿体和线粒体中蛋白质的合成，从而引起植物细胞死亡。愈伤组织是一种相对没有的薄壁细胞团，经液体悬浮培养可以分散成胚性单细胞，在适宜的培养基中，这种单细胞可以发育成，再继续发育成转基因小麦株系。(5)在小麦内过量表达转录因子APBP2可提高小麦叶酸量，推测APBP2基因在细胞内发挥的作用可能是。6．（2024·浙江·模拟预测）CRISPR/Cas9基因编辑系统是由Cas9蛋白和向导RNA构成的复合体，可利用向导RNA识别并结合特定DNA序列，引导Cas9蛋白对目标DNA进行编辑，其过程如下图所示。利用该系统对某种野生食用真菌进行了DNA编辑，培育出转基因真菌。CRISPR/Cas9系统的相关基因能否成功转入受体细胞是遗传转化体系建立的重要前提。(1)将真菌细胞置于一定浓度的PEG溶液中，一段时间后再与重组DNA混合可以提高转化效率，其中PEG的作用是。在转基因真菌的培育中，一般以原生质体为主，极少尝试菌丝体和孢子，说明遗传转化体系中的选择是制约转化效率的另一重要因素。(2)野生型核基因组中含有pyrg、ura3基因，这两类基因表达可产生乳清核苷-5’-磷酸脱羧酶，参与催化尿嘧啶的合成，通过CRISPR/Cas9编辑系统中的向导RNA与基因中的序列进行，将Cas9蛋白带到靶基因附近并对基因进行剪切。当目标基因序列被破坏后，菌体表现为尿嘧啶营养缺陷，只能在含有和5-氟乳清酸的培养基上正常生长，利用这种选择作用可以初步区分出野生型真菌及完成了转化的转基因品系。研究发现CRISPR/Cas9编辑系统中的向导RNA序列长度应当适中否则极易脱靶即难以精准找到目标DNA序列，脱靶最可能的原因是。(3)Cas9蛋白和向导RNA基因在真菌细胞中表达水平低，可通过在基因一端添加合适的来构建高表达基因编辑系统，还可以通过基因优化，使其转录产物中含有真菌细胞高频使用，以此来提高翻译效率。(4)该食用菌是某种逆转录病毒的特定宿主，侵染时，病毒将（填物质）注入食用菌细胞合成双链DNA片段，说明注入的酶可能具有①以病毒核酸为模板，催化键的形成、②解开的作用。这些功能的实现由酶分子相应的结构区域完成，体现了酶的以及酶功能的复杂性。食用菌细胞中合成的这些DNA片段通过进入细胞核内，并（选填“随机”或者“定向”）整合到食用菌的核基因组中，使其发生（填变异类型），进而引发食用菌减产。(5)某些食用菌具有天然抗击该种逆转录病毒的能力，有同学指出，可能是因为这些食用菌中含有限制性内切核酸酶切割了病毒核酸，你认为这种推测合理吗？，请说明原因。7．（2024·浙江·三模）天冬氨酸激酶（AK）和二氢吡啶二羧酸合成酶（DHDPS）是玉米赖氨酸合成途径中的关键酶。野生型玉米赖氨酸含量很低，科学家利用蛋白质工程技术将天冬氨酸激酶第352位苏氨酸替换为异亮氨酸，将二氢吡啶二羧酸合成酶第104位天冬酰胺替换为异亮氨酸，显著提高两种酶的活性，使玉米中赖氨酸含量提高数倍。回答下列问题：(1)将天冬氨酸激酶基因模板链中的单个碱基替换为，可得到改造后的基因（苏氨酸的密码子为ACU、ACC、ACA、ACG，异亮氨酸的密码子为AUU、AUC、AUA）。将改造后的基因导入玉米细胞中，使玉米获得高活性天冬氨酸激酶。用（写出1点即可）等物理或化学因素处理玉米种子也可能得到类似结果，但该育种方式具有一定的盲目性，因为基因突变具有的特点。(2)将改造后的AK基因（记为基因A）和改造后的DHDPS基因（记为基因D）导入玉米细胞，经组培获得高赖氨酸含量的植株甲、乙、丙，已知三个植株中的每个细胞中仅导入一个基因A和1个基因D。让植株甲、乙、丙分别自交，所得子代表型及比例如下：亲本子代表型及比例甲高赖氨酸含量：低赖氨酸含量=9：7乙高赖氨酸含量：低赖氨酸含量=3：1丙高赖氨酸含量：低赖氨酸含量=1：1（注：不考虑基突变和交叉互换）①植株甲的子代中，低赖氨酸含量植株基因型有种，高赖氨酸含量植株中纯合子占。②为快速获得稳定遗传的高赖氨酸含量玉米，应取植株（“乙”或“丙”）的置于适宜培养基上培养，对全部幼苗进行染色体加倍处理，最终所得纯合植株中高赖氨酸含量个体占。③若植株乙和植株丙进行杂交，所得子代表型及比例为。(3)分别提取野生型玉米和第（2）小题中植株甲的DNA，用下图所示引物1和引物2进行PCR扩增，用限制酶A充分切割扩增产物，之后进行凝胶电泳，已知图乙泳道1对应野生型玉米，请在图乙泳道2中画出植株甲对应的结果。

8．（2024·浙江绍兴·模拟预测）果蔬生产过程中，农药、化肥、土壤微生物等均可产生NO（一氧化氮），NO作为一种气体信号分子对植物的生命活动产生一定影响；NO同时也是重要的环境响应因子，在植物的抗逆境生理中发挥重要作用。某研究小组为探究NO对某果蔬植株光合作用强度的影响进行了如下实验。实验中用SNP（硝普钠）作为NO的供体。回答下列问题。(1)实验中测定了叶片的NO含量、叶绿素和类胡萝卜素含量、气孔导度，结果如图1。测定色素含量时，需用提取色素并测定含量。提取液中的叶绿素主要吸收光。相较于甲组，推测乙组叶片的光合作用强度较弱，依据是。(2)进一步检测发现，转录因子（HY5）基因敲除的植株叶绿素含量下降。PORC基因是叶绿素合成的关键基因，推测HY5蛋白可直接结合PORC基因的启动子调控其转录。为研究HY5基因与PORC基因的关系，研究者利用亮氨酸合成缺陷型酵母菌进行相关转基因实验，其操作步骤如下。①先将载体1导入亮氨酸缺陷型酵母细胞，但始终无法在添加金担子素（AbA，一种抗生素）和亮氨酸的培养基上获得重组酵母菌菌落，因此，可采过技术筛选出重组酵母细胞。②再将载体2导入①步骤获得的重组酵母细胞，接种到选择培养基上，能筛选获得如图2所示的重组酵母细胞。关于该选择培养基的配方正确是。A．加亮氨酸和AbA

B．不加亮氨酸加AbAC．不加亮氨酸和AbA

D．加亮氨酸不加AbA③据此分析步骤①中培养基上无法培养得到菌落的原因是。(3)已知NO不直接影响PORC基因的表达也不影响其表达产物的活性，综合上述研究，阐明NO降低植物叶绿素的可能机制：叶绿素合成减少。(4)NO作为环境响应因子，还能通过抑制需氧呼吸中、三羧酸（TCA）循环、电子传递链途径中关键酶的活性，抑制了呼吸速率，延缓了植物衰老，此功能与（植物激素）的作用相互拮抗。9．（2024·浙江杭州·模拟预测）为使甘蓝具有抗除草能力，科研人员将除草剂草甘膦抗性基因转入甘蓝植株，获得抗草甘膦转基因甘蓝。（见图1，注：BamHI识别的序列是G↓GATCC；BgⅢ识别的序列是A↓GATCT，EcoRI识别的序列是C↓AATTC）

(1)利用PCR扩增草甘膦抗性基因时，需要在引物的（填“3'端”或“5'端”）添加限制酶识别序列，若产物中除了目的基因外有其他DNA片段存在，原因可能是（答2条）。(2)构建表达载体时切割质粒应选择酶切。酶切后的目的基因存在正向与反向两种连接方式，可用酶对两种重组质粒进行剪切，再通过琼脂糖凝胶电泳技术分析产物大小进行区分，电泳结果出现长度为的片段即为所需基因表达载体。(3)步骤②将重组质粒与经处理农杆菌的混合，完成转化后先置于培养基中培养，其目的是。再将菌液涂布在含有抗生素的固体培养基中进行筛选。步骤③将农杆菌与甘蓝愈伤组织共培养后，在培养基中添加以便筛选出含目的基因的甘蓝愈伤组织。(4)基因芯片技术是一种能有效地对转基因作物进行检测的新技术，通常被检测的特定DNA序列包括两类：一类是非目的基因序列，主要为载体上通常具有的各种组成元件；另一类则是目的基因序列本身。使用方法如下：第一步，针对待测的特定DNA片段设计引物，扩增出的特定DNA片段带上标记制成探针，经变性后通过芯片点样仪固定到杂交膜上，再经过一定的处理，便得到可用于检测的DNA芯片（见图2）；第二步，从待测植物中提取DNA作为模板，加入引物进行扩增；第三步，将扩增产物经过变性处理后铺于芯片表面，放入杂交盒中，在适宜条件下进行杂交；第四步，待反应结束后，对芯片进行清洗等处理，用仪器检测芯片上的杂交结果。

利用基因芯片可检测特定DNA序列依据的是原则。对抗草甘膦转基因甘蓝进行检测的基因芯片的阵列设计为：第1列为空白对照，第2列固定甘蓝植株的内源基因作为阳性对照，第3列固定与甘蓝DNA序列高度（填“同源”或“非同源”）的DNA片段作为阴性对照，第4~6列可分别固定、和潮霉素抗性基因进行检测，每列重复多次以保证结果的准确性。若该基因芯片检测有效，转基因甘蓝的样本在芯片的第列上均应出现检测信号。(5)叶绿体转化是植物基因工程的新热点，叶绿体的诸多特点为叶绿体转化提供优势，如叶绿体基因组小，功能清晰，使基因操作方便；叶绿体细胞具有自我复制功能，一个植物细胞可含有多个叶绿体，每个叶绿体中含有多个基因组，可大大提高；另外，叶绿体基因位于细胞质中，可有效避免。10．（2024·浙江·模拟预测）小麦是雌雄同花植物。科研人员偶然发现一株高秆雄性不育小麦（甲），其雄性不育受显性基因M控制，另有一株矮秆可育小麦（乙），株高由A、a基因控制。科研人员进行了以下实验：杂交一：甲×乙→F1矮秆雄性不育：矮秆雄性可育=1∶1杂交二：F1中的矮秆雄性不育×高秆雄性可育（野生型）→F2矮秆雄性可育：高秆雄性不育=1：1回答下列问题：(1)A、a基因的根本区别是，其显性现象的表现形式是。(2)杂交一实验中甲作为（父本/母本）。根据杂交一、二实验结果可知，甲和乙的基因型分别为、，两对等位基因的遗传（遵循/不遵循）自由组合定律。(3)假设让实验二的F2自由交配，后代中高秆雄性可育植株占。(4)研究发现所有的雄性不育植株都特异性地携带了TRIM序列，且M及其等位基因的编码区相同；为研究该序列与雄性不育之间的关系，科研人员在野生型小麦中获得了M等位基因的启动子并利用Ti质粒构建表达载体，部分结构如下图所示，GFP表达后会发出绿色荧光。将载体转入小麦幼胚，获得转基因植株，对植株表型和M基因表达情况进行鉴定。a．通用的强启动子b．M等位基因启动子c．插入TRIM序列的M等位基因启动子d．M编码区e．M基因f．无关基因实验材料转入载体组成I、II植株表型M基因表达情况雄性不育小麦-雄性不育仅在花药发育早期表达，在根、茎、叶、雌蕊中均不表达野生型小麦-可育在花药发育各时期均不表达，在根、茎、叶、雌蕊中均不表达野生型小麦ad死亡-野生型小麦①________②________仅在花药发育早期表达，在根、茎、叶、雌蕊中均不表达（1）表中①处转入的载体组成为（从a~f中选择），②处植株表型为。（2）在存活的转基因小麦花药中特异性检测到绿色荧光。根据实验结果推测导致雄性不育的原因是。11．（2024·浙江·三模）干旱胁迫会引起植物细胞内重要生理代谢途径紊乱，如细胞呼吸电子传递链受损、光反应中电子散逸，细胞内活性氧自由基（ROS）积累等，因此干旱胁迫下ROS对膜脂质、蛋白质及DNA等的氧化损伤是植物损伤的重要方式。Lon1蛋白具有降低叶绿体和线粒体内ROS产生，维护细胞正常代谢的功能。某研究团队以耐干旱胁迫突出的“夏普蓝”蓝莓为材料，构建了如下图所示表达载体，导入烟草后以研究Lon1蛋白在植物应对干旱胁迫时的相关功能。回答下列问题：注：1.KpnⅠ和SmaⅠ为限制酶，CaMV35S表示启动子，Lon1为目的基因。2.Gus基因表达产物能催化无色X-Gluc生成蓝色物质，植物无此基因。3.左右边界之间的区段表示T-DNA片段。(1)获取目的基因及构建重组表达载体。通过检索基因数据库，获得蓝莓，以此设计引物并在引物的5’端添加。由图可知，SmaⅠ识别位点位于目的基因模板链的端。PCR扩增产物可用电泳技术分离后将含有切割下来以便回收并提纯。(2)利用农杆菌转化烟草细胞及培育转基因植株。使用的外植体是带有伤口的叶圆片，将重组的农杆菌和叶圆片共培养一段时间，该过程需控制好（答两点）和pH、温度等环境条件，以保证外植体的存活率和转化率均较高。将共培养后的叶圆片转入添加适当抗生素的培养基上培养，目的是。培养基中还含有（答两点）等有机成分及植物生长调节剂来调控叶圆片细胞脱分化、再分化过程，从而得到转基因烟草植株。(3)筛选转基因烟草植株及耐旱特性观察鉴定。选取转基因烟草叶片，将其置于含的鉴别培养基中染色，若叶片出现蓝色斑点即为转基因烟草转化成功。染色前需对叶片进行处理，以防对结果产生干扰。将转基因烟草叶片，一组置于添加10%PEG的MS培养基中培养，另一组置于未添加PEG的MS培养基中培养。添加10%PEG的作用是。另取野生型烟草叶片作为对照。(4)电镜下显示正常培养的烟草细胞叶绿体、线粒体形态结构完整。添加PEG的野生型烟草细胞出现叶绿体基粒片层结构模糊，线粒体变形嵴断裂等现象，而添加PEG的转基因烟草细胞未出现上述现象；检测各组植株叶绿素相对含量，结果如下图。推测干旱胁迫下Lon1蛋白可能是通过，来维护光合作用的正常进行，从而抵御干旱。12．（2024·浙江·模拟预测）莫内林是从一种西非植物的浆果中分离提纯到的甜味蛋白，甜度是蔗糖的3000倍左右。下图1所示利用大肠杆菌生产莫内林，其中M基因可表达合成莫内林。表1是为PCR扩增M基因设计的引物，画线部分是所需使用的限制性内切核酸酶的识别序列。Ampr为氨苄青霉素抗性基因，氨苄青霉素可抑制细菌细胞壁的形成，对真核生物生长无影响限制性内切核酸酶识别序列及切割位点：BamHI：5’-G↓GATCC-3’

XhoI：5’-C↓TCGAG-3’

Sau3AI：5’-↓GATC-3’

SacI：5’-GAGCT↓C-3’引物15’GGAATTCCTCGAGGGCGAATGGGAAATTATCG3’引物25’TTTGGATCCTTACGGCGGCGGAACCGGAC3’(1)若选用XhoI和Sau3AI对质粒A进行切割，为实现其与目的基因的连接，可在目的基因两端添加。引物1的结合位点可能在（选填图1中的编号）。引物1的画线部分序列在A中（有/没有），引物2画线部分的序列在B中（有/没有）的可能性较高。(2)已知C中的培养基成分有水、酵母粉、蛋白胨和氯化钠，并按一定比例添加氨苄青霉素。将C中有生长优势的菌落经多次后作为菌种在发酵罐中培养，积累产物，发酵罐中培养基成分与C中培养基相较可不添加，并采用的方法对装填在发酵罐中的培养基灭菌。(3)通过大肠杆菌生产的莫内林甜度较天然莫内林大为降低，天然莫内林也易因温度等因素导致甜度降低甚至甜味消失，科学家分析其中的原因并进行了后续的工程学改造，请结合所学知识，分析两种莫内林甜度降低的原因分别是。(4)针对上述问题，从分子水平对蛋白质进行改造是解决莫内林甜度降低的工程学思路。以甜味蛋白质的三维结构为基础，选择影响其与受体相互作用的关键氨基酸残基，进行定点突变，将获取的新基因与酵母质粒中构建，导入到真核细胞如甲醇营养型毕赤酵母中，并评价突变体的功能，筛选能产生等优良性能的甜味蛋白质的菌种。研究结果表明，相对于天然的野生型甜味蛋白质monellin，突变体E2N/E23A的甜味均提高了约3倍左右，而突变体E2N/E23A的热稳定性(Tm值)提高了约10℃。(5)接上题，与大肠杆菌转化不同，毕赤酵母转化前一般先用低温山梨醇溶液处理，使其处于一种的生理状态；同时需将外源DNA处理成线性，分析原因可能是。转化后的毕赤酵母进行发酵培养分为两个阶段：生长阶段，以甘油为碳源、获取大量的功能性细胞；诱导阶段，通过添加甲醇来诱导表达重组蛋白。培养基中除加入甘油、甲醇外，还需要提供的营养物质有。13．（2024·浙江·三模）葡萄是两性花植株。无核葡萄品质优良，但抗寒性差，中国野生山葡萄具有较强抗寒性。回答下列问题：Ⅰ．利用中国野生山葡萄培育抗寒无核葡萄品种(1)人工杂交。研究者对无核种子败育型（经过授粉受精，胚和胚乳一段时间后停止发育）葡萄植株进行、套袋、挂牌，一段时间后授以野生山葡萄的，完成杂交。(2)胚离体培养。杂交后7-10天，剪取子房经75%乙醇或消毒后，用多次冲洗，用解剖针将其剥开，取胚珠接种于培养基上，培养、筛选获得抗寒无核葡萄植株。Ⅱ．利用基因工程技术对抗寒相关D基因的功能展开相关研究(3)科研人员利用pG载体首先构建了重组质粒，导入到敲除GAL4基因的酵母AH109菌株中，如下图所示。GAL4基因可编码酵母中具有转录激活功能的蛋白，AH109菌株为色氨酸、组氨酸缺陷型菌株，只有在添加相应氨基酸的培养基中才能生长。①为了能够筛选得到重组酵母，培养基的配方为下列选项中的组，此外还需额外添加，通过显色反应做进一步验证。A组：加色氨酸和组氨酸B组：不加色氨酸和组氨酸C组：加组氨酸，不加色氨酸D组：加色氨酸，不加组氨酸②实验结果表明抗寒相关D基因编码的蛋白质具有转录激活功能，完善实验分组及预期实验结果。对照组1：酵母菌导入pG-GAL4重组载体，实验结果：有菌落，变蓝。对照组2：酵母菌导入，实验结果：。实验组：酵母菌导入，实验结果：。(4)将抗寒相关D基因导入无核葡萄植株中，研究者常构建含D基因和抗除草剂基因的稳定表达载体，用含的培养基筛选愈伤组织，用PCR方法筛选出植株，72小时诱导培养，检测植株中D蛋白的含量以判断抗寒能力。14．（2024·浙江·三模）农杆菌转化法存在单个Ti质粒可承载外源基因大小有限的不足，研究人员通过改进转化过程，获得了抗虫牧草。表为实验所用菌株和质粒特性，图为质粒2的T-DNA片段基因和限制酶识别序列分布。实验农杆菌和质粒特性菌株E含有利福平抗性基因质粒1质粒2含有链霉素抗性基因和Vir基因，无T-DNA片段含有卡那霉素抗性基因，无Vir基因，有T-DNA片段备注：利福平、链霉素和卡那霉素都是抗生素，Vir基因在特定物质下表达，其产物是T-DNA片段转入植物细胞的必需物质。有无T-DNA片段不影响质粒其他基因的表达。回答下列问题：(1)愈伤组织获取。选取牧草种子后，剥去外壳，70%乙醇消毒后，用冲洗，接种在培养基中，通过和细胞增殖，获得愈伤组织。(2)构建重组载体和转化农杆菌。选用限制酶对质粒2进行酶切，目的是保留潮霉素抗性和。用处理农杆菌后，将其与质粒1和质粒2共培养一段时间。将转化后的农杆菌接种到含有的培养基中培养，一段时间后，挑取单克隆培养物，接种到不含抗生素的培养基中培养一段时间。采用双质粒转化农杆菌的优点是。(3)转基因愈伤组织的获取。将重组农杆菌分别接种至含乙酰丁香酮（AS）和不含AS的培养基中预培养，再与愈伤组织共培养3天，然后取少量愈伤组织接种到不同浓度潮霉素的培养基中培养30分钟，结果如表所示。表不同浓度潮霉素对愈伤组织存活率的影响潮霉素浓度（mg/L）020406080不含AS组存活率（%）93862300含AS组存活率（%）939077150由表2可知，AS的作用是，应选用的潮霉素浓度作为筛选浓度对所有转化后愈伤组织进行筛选。(4)抗虫牧草的鉴定。将愈伤组织接种至分化培养基培养至幼苗，经炼苗后，转移至移植到土壤中培育，获得抗虫牧草甲、乙、丙。取三组牧草的适量叶片细胞，提取总DNA。以抗虫基因的特异序列和叶肉细胞自身基因的特异序列分别做2对引物，PCR扩增后进行，结果显示植株甲、丙成功导入抗虫基因，组1和组2分别是阴性对照和阳性对照，请在电泳结果图2上绘制组1和组2的电泳结果。植株甲和丙不能立即推广种植，原因是。15．（2024·浙江宁波·二模）草甘膦是一种除草剂，但会影响水稻产量。水稻产量与高产基因有关，研究人员拟采用农杆菌转化法对水稻高产基因进行定位，并进一步培育能稳定遗传的抗草甘膦高产水稻新品种。回答下列问题：Ⅰ.水稻高产基因定位水稻穗粒数可影响水稻产量。农杆菌Ti质粒的T－DNA可以转移并随机插入野生型水稻基因组中（可在基因组单一位点插入也可以同时插入多个位点），导致被插入的基因功能丧失，从而得到一系列水稻突变体。研究者从中筛选得到一株穗粒数异常突变体，并进行下列研究。(1)提取DNA。采集适量突变体和野生型水稻的幼嫩叶片，分别冷冻后研磨成粉末状，依次加入SDS、RNA酶等试剂，去除蛋白质和等大分子杂质。提取过程中需加入酶抑制剂并保持轻柔操作，以避免，从而提高总DNA提取率。(2)PCR扩增。对提取获得的两组总DNA分别进行PCR扩增。为避免外源DNA等因素的污染，微量离心管、枪头和蒸馏水等在PCR前需进行处理。可以通过在紫外灯下直接观察电泳结果中DNA条带的及粗细程度来评价扩增是否成功。(3)结果鉴定。分别用EcoRI、HindⅢ、BamHI三种限制酶处理突变体总DNA扩增产物，处理后进行电泳，并与野生型DNA和Ti质粒对照。电泳后的DNA与含放射性同位素标记的DNA探针（T－DNA的一条单链）进行杂交，得到突变体总DNA不同酶切处理后的放射性检测结果如图1所示。①不同酶切结果的杂交带位置不同的原因是：不同酶切后含的片段长度不同，因此各组DNA片段在凝胶中电泳时的不同，最终导致分布于不同位置。②若杂交结果显示突变体在不同限制酶处理时均出现杂交带，野生型组（填“有”或“无”）杂交带，Ti质粒组（填“有”或“无”）杂交带，则表明T－DNA成功插入水稻染色体基因组中，且可判断突变体为T－DNA位点插入，依据是。（注：T－DNA上没有EcoRI、HindⅢ、BamHI三种限制酶的酶切位点）。(4)用某种限制酶处理突变体的DNA（如图2所示），断开DNA分子中的个磷酸二酯键，再用将两端的黏性末端连接成环，以此为模板，利用下表中的引物①②进行PCR，扩增出序列，扩增产物（填“不含”或“含”）T－DNA完整序列。经过与野生型水稻基因组序列比对，确定T－DNA插入2号染色体上的B基因中。T-DNA序列引物序列5ˊ-AACTATGCGC…….CGTAGCCTAT-3ˊ①5ˊ-GCGCATAGTT-3ˊ3ˊ-TTGATACGCG…….GCATCGGATA-5ˊ②5ˊ-CGTAGCCTAT-3ˊ(5)研究发现，该突变体产量明显低于野生型，据此推测B基因可（填“促进”或“抑制”）水稻穗粒的形成，可控制高产性状。Ⅱ.抗草甘膦高产水稻培育，研究者构建如图3所示的Ti表达载体，采用农杆菌转化法将抗草甘膦基因R和基因B转入野生型水稻中，培育稳定遗传的抗草甘膦高产水稻新品种。(6)转基因技术的理论基础有：T－DNA和水稻DNA均为结构、生物界共用一套等。(7)根据基因表达载体的结构组成分析，Ti质粒中的CaMV35S是，其功能是酶的识别和结合部位。Ti表达载体中，B基因和R基因转录的模板链的方向（填“相同”或“相反”）。(8)现需选出单一位点插入R基因和B基因且稳定遗传的水稻新品种，筛选方案如下：①转基因后的水稻植株自交，收获种子（F₁）并播种在含的选择培养基上，若能够萌发并生长的个体即为的个体；②F₁存活个体自交所得种子（F₂）按单株收种并播种于选择培养基上，选择存活率约的培养基中的幼苗继续培养获得F₂植株；③将F₂植株自交所得种子