基因工程与分子生物学常用技术课件

关于基因工程与分子生物学常用技术第一页，本课件共有34页第一节基因工程与基因重组

(GeneticEngineeringandGeneticrecombination)

一、基因工程的基本概念

不同来源的DNA分子可以通过磷酸二酯键连接形成重新组合的DNA分子，称为DNA重组。

将基因进行克隆，并表达制备特定的产物，或定向改造细胞乃至生物个体的特性所用的方法及相关的工作统称为基因工程。第二页，本课件共有34页(一)工具酶1.限制性核酸内切酶

(1)能够切割DNA中磷酸二酯键的酶称核酸酶，其中有选择地切割DNA分子特异序列的核酸酶，称为限制性核酸内切酶，简称限制性内切酶。(2)命名HindⅢ

属

系

株

序Haemophilusinfluenzaed株流感嗜血杆菌d株的第三种酶(3)识别特征5′•••GAATTC•••3′3′•••CTTAAG•••5′

限制性内切酶识别的DNA序列具有回文结构特征。第三页，本课件共有34页

不同的限制性内切酶识别和切割的特异性不同，结果有3种不同的情况：①产生3′突出粘性末端：以EcoRⅠ为例：5′•••G↓AATTC•••3′5′•••GAATTC•••3′3′•••CTTAA↑G•••5′3′•••CTTAAG•••5′

②产生5′突出粘性末端：以PstⅠ为例：5′•••CTGCA↓G•••3′5′•••CTGCAG•••3′3′•••G↑ACGTC•••5′3′•••GACGTC•••5′

③产生平末端：NruⅠ为例：5′•••TCG↓CGA•••3′5′•••TCGCGA•••3′3′•••AGC↑GCT•••5′3′•••AGCGCT•••5′(4)切割位点第四页，本课件共有34页2.DNA聚合酶(1)基因工程主要应用E.coliDNA聚合酶Ⅰ、T4DNA聚合酶和TaqDNA聚合酶等。(2)主要用途：①利用5/→3/聚合活性，合成DNA第二条链；②对DNA的3/端进行填补或末端标记；③E.coliDNA-polⅠ用于缺口平移，制作探针；④T4DNA聚合酶可用于DNA序列测定；⑤TaqDNA聚合酶用于聚合酶链式反应(PCR)。3.DNA连接酶

使单链切口形成磷酸二酯键，共价地连接。第五页，本课件共有34页4.逆转录酶(1)用于真核mRNA逆转录，构建cDNA文库。(2)用于进行3/端填补和标记，制备DNA探针。(3)用于DNA序列测定。

5.多核苷酸激酶

(1)用于放射性标记DNA链的5/端。

(2)用于缺少5/-磷酸基的DNA磷酸化。6.碱性磷酸酶此酶防止载体的自身连接。7.末端脱氧核苷酸转移酶能催化单核苷酸转移到DNA的3/-端羟基上。第六页，本课件共有34页(二)载体1.为携带目的基因，实现其无性繁殖或表达有意义的蛋白质所采用的一些DNA分子，称为载体。2.载体的选择标准能自主复制。易进入宿主细胞。具有多克隆位点。易从宿主细胞中分离纯化。有易被识别和筛选的标志。质粒噬菌体粘粒病毒3.常用载体第七页，本课件共有34页①质粒是细菌中独立于染色质以外的、能自主复制的、并与细菌或细胞共存的遗传成分，可赋予宿主细胞某些遗传性状。②通常质粒的大小为2～300kb。③一般只能容纳10kb的外源DNA片断。(1)质粒(plasmid)第八页，本课件共有34页(2)噬菌体(bacteriophage，phage)①噬菌体是感染细菌的一类病毒，因其寄生在细菌中并能溶解细菌细胞，故称为噬菌体。

②噬菌体由头和尾构成，感染时尾管将基因组DNA注入大肠杆菌，而将其蛋白质外壳留在菌外。③具有溶菌性和溶原性两种不同的繁殖方式。

第九页，本课件共有34页(3)粘粒(cosmid)②粘粒本身约4～6kb，可克隆DNA大片段，可用作建立真核基因组文库的载体。①粘粒是将λ噬菌体的cos区与质粒组合的装配型载体。(4)病毒

病毒载体更多地用于真核表达系统，如腺病毒、痘病毒、反转录病毒和猴空泡病毒。第十页，本课件共有34页二、重组DNA技术的基本原理和过程

基因工程中最主要是分子克隆，克隆是指由一个细胞经过无性繁殖后所形成的子代群体。进行分子克隆所采用的技术即重组DNA技术，故又称为分子克隆技术或基因工程技术。

制备目的基因和相关载体；将目的基因和载体进行连接；将重组的DNA导入受体细胞；

DNA重组体的筛选和鉴定；

DNA重组体的扩增、表达。

基本步骤第十一页，本课件共有34页(一)目的基因的制备1.制备基因组DNA文库

(genomiclibrary)

将基因组DNA酶切成片段，再与载体分子拼接成重组DNA，将其引入宿主细胞进行扩增，所得分子克隆混合体称基因组文库。2.制备cDNA文库

(cDNAlibrary)

将mRNA逆转录合成cDNA，再与载体连接成重组DNA，将其引入宿主细胞并进行扩增，所得分子克隆的混合体称为cDNA文库。第十二页，本课件共有34页3.聚合酶链式反应(PCR)

如已知目的基因序列，则可采用PCR从基因组DNA中获得目的基因，也可以采用逆转录PCR(RT-PCR)直接从mRNA获得特定基因的cDNA。4．化学合成

如已知肽链的氨基酸顺序，则可按对应密码子推导出DNA的碱基序列，然后合成该段DNA序列。第十三页，本课件共有34页(二)目的基因与载体的连接1．粘性末端连接2．同聚物加尾连接3．平末端连接4．人工接头连接

将目的基因插入载体，用DNA连接酶连接双链DNA粘性末端序列，在体外重新连接成人工重组体。方法主要有以下四种：第十四页，本课件共有34页(三)将外源DNA导入宿主细胞常用的方法有以下两种：1.转化(transformation)

转化是指将质粒或其他外源DNA导入处于感受态的宿主细胞，并使其获得新的表型的过程。2.感染(infection)

感染是指以噬菌体进入宿主菌或病毒进入宿主细胞中繁殖的过程。第十五页，本课件共有34页1.遗传学方法针对载体携带有某些标志基因如抗药性标志基因(ampr、tetr、kanr等)和目的基因而设计的筛选方法。2.分子杂交方法

利用32P标记的探针与重组DNA或克隆DNA片段进行分子杂交，直接筛选并鉴定目的基因。3.免疫学方法利用特异性抗体与目的基因表达产物特异结合的方法筛选。(四)目的基因的筛选和鉴定第十六页，本课件共有34页(五)克隆基因的表达

利用重组DNA技术所获得目的基因或DNA序列，可实现在受体细胞中的表达，即产生mRNA或蛋白质产物。(六)重组DNA技术操作过程总结归纳

分切接转筛分离目的基因限制酶切目的基因与载体拼接重组体转入受体菌筛选重组体第十七页，本课件共有34页2.特点针对性强、特异性强、灵敏度高、适应性强。三、基因诊断和基因治疗1.基因诊断是指利用分子生物学技术和方法，直接检测基因结构及其表达水平是否正常，从而对疾病作出诊断的方法。(一)基因诊断(genediagnosis)

3.应用遗传性疾病肿瘤感染性疾病遗传易感性疾病器官移植配型法医学中个体识别、亲子鉴定第十八页，本课件共有34页1.基因治疗是指以正常基因矫正、替代缺陷基因，或从基因水平调控细胞中缺陷基因表达的一种治疗疾病的方法。2.

狭义的基因治疗是指将目的基因导入靶细胞，与宿主细胞的基因整合后表达以达到治疗疾病的方法。3.

广义的基因治疗是指将某种遗传物质转移到患者细胞内，使其在体内发挥作用以达到治疗疾病的方法。

(二)基因治疗(genetherapy)第十九页，本课件共有34页5.基因治疗的基本程序(1)选择和制备目的基因：治疗性基因。(2)选择基因转运载体：通常选择病毒载体。(3)选择靶细胞：体细胞、生殖细胞。(4)转移基因：将治疗基因导入并表达。4.基因治疗的基本策略基因增补基因置换基因矫正基因失活基因疫苗第二十页，本课件共有34页(TheTechnologyandApplicationinMolecularBiology)第二节分子生物学技术及其应用

核酸分子杂交(nucleicacidhybridization)是指利用DNA复性原理，把不同来源的DNA单链或DNA与RNA混合，如单链分子间有碱基配对关系，则可形成杂化双链的过程。一、核酸分子杂交技术第二十一页，本课件共有34页(一)探针(probe)2.理想探针的特点

(1)带有标记的示踪物，便于检测、鉴定；

(2)应是单链；

(3)具有高度特异性；

(4)探针长度一般为数十至数千个碱基;(5)具有高灵敏度和稳定性，标记方法简便安全。1.

探针是一段与被测的核苷酸序列(靶基因序列)互补的带有标记的核苷酸片段。第二十二页，本课件共有34页(二)核酸分子杂交的基本方法Southern印迹杂交

(1)指将经酶切和电泳分离的待测DNA片段转印到固相支持物上，然后与标记的DNA探针杂交。

(2)可用于分子克隆、遗传病诊断、法医鉴定、肿瘤研究和器官移植等方面。2.Northern印迹杂交

(1)指将经电泳分离后的待测RNA片段转印到固相支持物上，然后与标记的核酸探针进行杂交。

(2)主要用于检测各种基因转录产物，主要是mRNA。第二十三页，本课件共有34页第二十四页，本课件共有34页3.斑点及狭缝印迹杂交

(1)指将RNA或DNA变性后直接点样于硝酸纤维素膜或尼龙膜上，再与探针杂交，称为斑点印迹。若采用狭缝点样器加样后杂交，其印迹为线状，称为狭缝印迹杂交。

(2)主要用于基因组中特定基因及其表达的定性及定量研究。4.原位杂交

(1)指将标记的核酸探针与经适当方法处理的细胞或组织中的核酸进行杂交，称为原位杂交。

(2)该方法不需从组织或细胞中提取核酸，有很高的灵敏度，并可保持组织与细胞的形态，更能准确地反映出组织细胞的相互关系及功能状态。第二十五页，本课件共有34页二、聚合酶链反应(一)PCR的基本原理1.PCR有三个反应步骤DNA的变性DNA与引物的退火(复性)引物的延伸。第二十六页，本课件共有34页n个循环加热变性模板DNA退火DNA延伸P25′

3′5′

3′5′

3′

3′P15′2.变性→复性→延伸这三个步骤为一个循环，每次循环的产物作为下个循环的模板，如此循环多次，则DNA成指数扩增。第二十七页，本课件共有34页PCR反应体系：

1.引物是PCR特异性反应的关键，取决于引物与模板DNA互补的程度。

2.酶浓度酶催化的PCR反应的TaqDNA聚合酶量约需2.5U。

3.dNTP的质量dNTP的质量与浓度和PCR扩增效率有密切关系，dNTP粉呈颗粒状，如保存不当，易变性失去生物学活性。

4.模板核酸模板核酸的量与纯化程度是PCR成败与否的关键环节之一。(二)PCR的基本反应第二十八页，本课件共有34页1．可分析基因转录产物；构建cDNA文库；克隆特异cDNA；合成cDNA探针。2．可判断突变的基因片段，如癌基因和抑癌基因中点突变的检测和鉴定。3．用于病原微生物的微量检测及鉴别菌株；突变基因的筛选；法医学鉴定；DNA序列分析；器官移植配型等。4．应用于遗传性疾病的诊断如地中海贫血、苯丙酮酸尿症等；感染性疾病如肝炎、结核等诊断。5．根据已知致癌基因顺序设计特异的模板和引物，用于筛选特异的抗肿瘤化合物。(三)PCR