第三章-蛋白质化学

第三章

蛋白质结构与功能

Structureandfunctionof

Protein第一节蛋白质的分子组成第二节蛋白质的分子结构第三节蛋白质结构与功能的关系第四节蛋白质的理化性质第五节蛋白质分离与纯化的基本原理一、什么是蛋白质？蛋白质(protein)是由许多氨基酸（aminoacid)通过肽键相连形成的高分子含氮化合物。二、蛋白质的生物学重要性1.蛋白质是构成生物体的基本成分占人体干重45%，细胞70%2.不同的蛋白质具有不同的氨基酸组成，因此也具有不同的理化特性。蛋白质结构上的多样性决定了其功能上的多样性。蛋白质在生物体内起着催化、运输、运动、防御、调节等多种生物功能

类别功能实例酶蛋白催化细胞内几乎所有的化学反应，控制生物有新陈代谢淀粉酶运输蛋白小分子和离子的细胞间以及细胞器间的转运血红蛋白运动蛋白生物机体的组织、器官或整体的运动肌动蛋白激素蛋白调节有机体的各种新陈代谢活动生长激素贮藏蛋白贮藏营养大豆球蛋白防御蛋白防御致病性微生物或病毒的侵入免疫球蛋白结构蛋白某些细胞组织中的构成成分角蛋白受体蛋白接受和传递调节信息钙调蛋白毒性蛋白侵入动物体能引起中毒症状甚至死亡蛇毒、抗原蛋白质的功能

第一节蛋白质的分子组成一、蛋白质的元素组成1、主要元素：碳（50%—55%）、氢（6%—8%）、氧（19%—24%）、氮（13%—19%）；次要元素：硫、磷、铁、锰、锌、碘。2、蛋白质元素组成的特点基于：各种蛋白质的含氮量很接近：平均为16%；体内的含氮物质以蛋白质为主。则可通过测N→测Pr。即每克样品蛋白质的含量=每克样品的含氮量×6.25二、组成蛋白质的基本单位——氨基酸(aminoacids)1、氨基酸（AA）的通式

H

RCCOOHα-氨基和α-羧基

NH22、特点：（1）20种基本氨基酸中，除脯氨酸为亚氨基酸外，其余19种均符合通式；（2）除甘氨酸的R基为H外，其余19种α-碳原子为不对称碳原子，有L、D型之分，但组成人体蛋白质的氨基酸均为L型；（3）不同氨基酸的侧链基团不同。丙氨酸(Ala)缬氨酸(Val)亮氨酸(Leu)异亮氨酸(Ile)苯丙氨酸(Phe)蛋氨酸(Met)色氨酸(Trp)脯氨酸(Pro)甘氨酸(Gly)丝氨酸(Ser)苏氨酸(Thr)天冬酰胺(Asn)谷氨酰胺(Gln)酪氨酸(Tyr)半胱氨酸(Cys)天冬氨酸(Asp)谷氨酸(Glu)组氨酸(His)赖氨酸(Lys)精氨酸(Arg)3、氨基酸的分类（根据侧链基团的结构和性质不同）（1）非极性疏水性AA：R为疏水基团，无极性。

Ala、Val、Leu、Ile、Met、Phe、Pro、Trp8种（2）极性中性AA：R不带电荷，但显极性。

Gly、Ser、Thr、Tyr、Cys、

Asn、Gln7种（3）酸性AA：R可电离带负电荷，有极性。

Glu、Asp2种（4）碱性AA：R可电离带正电荷，有极性。

Lys、Arg、His3种另，1996年发现了第21种氨基酸：硒半胱氨酸（selenocysteine）；

2002年发现了第22种氨基酸：吡咯赖氨酸（pyrrolysine)

。4.蛋白质中少见的氨基酸羟脯氨酸、羟赖氨酸、四碘钾腺原氨酸（甲状腺素、T4）胱氨酸-OOC-CH-CH2-S+NH3S-CH2-CH-COO--OOC-CH-CH2-S+NH3S-CH2-CH-COO-+NH3半胱氨酸

+胱氨酸二硫键-HHHS-CH2-CH-COO-HS-CH2-CH-COO-+NH35.非蛋白质氨基酸β-丙氨酸、D-苯丙氨酸、同型半胱氨酸、鸟氨酸、г-氨基丁酸三、氨基酸的性质1、两性电离性质pH=pI

净电荷=0

pH<

pI净电荷为正pH>pI净电荷为负CHRCOOHNH3+CHRCOONH2CHRCOONH3++H++

OH-+H++

OH-(pK´1)(pK´2)

当氨基酸溶液在某一pH值时，其所带正负电荷相等，成为两性离子，在电场中既不向阳极也不向阴极移动，此时溶液的pH值就称为该氨基酸的等电点(isoelectricpoint)。等电点——使某种氨基酸所带正、负电荷数相等时溶液的pH值。

甘氨酸

[Gly

+][Gly

±][Gly

-]

根据等电点的定义，在等电点时，氨基酸所带的正负电荷相等，即：[Gly+]=[Gly-]因此有：方程两边取负对数，则得pI表示等电点时的pH，-lgK=pK，则查表得甘氨酸的pK1=2.34，pK2=9.60，即得甘氨酸的等电点pI=1/2（2.34+9.60）=5.97二羧基一氨基的谷氨酸等电点在等电状态下（Glu

±），Glu

2-含量甚微，故不考虑。此时Glu的等电点为：==3.22pI=在等电状态下，Lys2+含量很少，故不考虑。此时Lys的等电点为：二氨基一羧基的赖氨酸的解离平衡为：2、紫外吸收特性

A280nm

3、茚三酮反应：可做氨基酸的定性、定量测定。氨基酸的α-氨基最特殊并且广泛应用的是与茚三酮的反应。茚三酮在弱酸性溶液中与α-氨基酸共同加热，引起氨基酸氧化脱氨、脱羧反应，最后茚三酮与反应产物——氨和还原茚三酮（hydrindantin）发生作用，生成蓝紫色产物。水合茚三酮还原茚三酮还原茚三酮水合茚三酮紫色物质（ruhemann紫）桑格反应（Sangerreaction）桑格（Sanger）用2，4-二硝基氟苯（简称DNFB或FDNB）试剂测定氨基酸及肽中的游离氨基酸，在弱碱性溶液中，DNFB将α-氨基酸转变成黄色的2，4-二硝基苯衍生物，简称DNP-氨基酸。在此氨基酸中α-氨基的一个H为2，4-二硝基苯基所取代。此反应对鉴定多肽链的氨基末端的氨基酸特别有用。FDNB也与赖氨酸的ε-氨基反应，但这个衍生物用层析法容易与α-氨基的DNP衍生物区别开。异硫氰酸苯酯反应也称为艾德曼反应（Edmanreaction），艾德曼反应是测定α-氨基的最有用的反应。用苯异硫氰酸（phenylisocyanate）与α-氨基酸定量反应，即生成苯氨基硫甲酰氨基酸衍生物，然后在硝基甲烷溶液中用甲酸处理，苯氨基硫甲酰氨基酸即裂解生成苯乙内酰硫脲（phenylthiohydantoin，PTH）衍生物。这个反应也称艾德曼反应（Edmandegradation）。这些衍生物无颜色，但容易用层析法分离后显色后鉴定。艾德曼反应广泛用于鉴定多肽链中的N-末端氨基酸。在测定多肽链的氨基酸顺序上，艾德曼反应占有重要地位。第二节蛋白质的分子结构一、多肽的结构1、肽键与肽肽键(peptidebond)：由一个AA的а-氨基与另一个氨酸的

а-羧基脱水缩合生成的化学键。肽peptide：AA通过肽键相连形成的化合物(二肽、三肽、寡肽和多肽)。寡肽oligopeptide

：

一般10肽以下多肽polypeptide：

一般10肽以上多肽链：由许多氨基酸借肽键相互连接而成的一种结构。氨基酸残基：多肽链中的氨基酸，由于参与肽键的形成，已非原来完整的分子，称为——。多肽链有两端：

N末端、C末端天然存在的活性肽类别：激素、抗菌素、辅助因子

实例：谷胱甘肽(glutathione)

短杆菌肽

促甲状腺素释放因子（TRH）

-天冬氨酰-苯丙氨酸甲酯（甜味剂）谷胱甘肽

谷胱甘肽在体内参与氧化还原过程，作为某些氧化还原酶的辅因子，或保护巯基酶，或防止过氧化物积累。短杆菌肽S促甲状腺素释放因子（TRH）蛋白质的分子结构

蛋白质的一级结构蛋白质的二级结构蛋白质的三级结构高级结构蛋白质的四级结构（空间构象）

由一条肽链形成的蛋白质只有一、二、三级结构，由二条或二条以上多肽链形成的蛋白质才可能有四级结构。二、蛋白质分子的一级结构1、一级结构(primarystructure)：指蛋白质多肽链中氨基酸的组成及排列顺序。2、一级结构维系键：肽键和二硫键。3、重要性：是蛋白质空间构象和特异生物学功能的基础。三、蛋白质分子的空间构象(conformation)

蛋白质的构象指蛋白质分子中原子和基团在三维空间上的排列、分布及肽链的走向。蛋白质分子的构象可分为二、三、四级结构。维持蛋白质构象的化学键：次级键（副键），由蛋白质分子的主链和侧链上的极性、非极性和离子基团等相互作用而形成的。

如：氢键、疏水键、离子键、范德华力、二硫键、配位键。氢键(HydrogenBond)：一个已和负电性较强的原子共价结合的氢原子与一个负电性较强的原子之间产生的静电引力。（一）蛋白质的二级结构(secondarystructure)1.概念：蛋白质分子中某一段肽链的局部空间结构，即该段肽链主链骨架原子的相对空间位置，并不涉及氨基酸残基侧链的构象。主链与侧链由肽键和α-碳原子构成的多肽链骨架称为主链，伸展在外的R基团称为侧链。2.主要形式：α-螺旋,β-折叠，β-转角，无规则卷曲。主要维系键：氢键α-螺旋(α-helix)结构特点：①右手螺旋：3.6AA/圈，螺距0.54nm。②氢键维系（形成于每个肽键的N-H和第四个肽键的羰基氧之间）。③侧链伸向螺旋外侧。④侧链基团影响螺旋的形成和稳定。

(带同种电荷，侧链大的R基或Pro存在均妨碍α-螺旋形成)β-折叠

β－转角（β-turn）

特征：多肽链中氨基酸残基n的羰基上的氧与残基（n+3）的氮原上的氢之间形成氢键，肽键回折1800。无规则卷曲示意图无规则卷曲细胞色素C的三级结构模体(motif)/超二级结构：蛋白质分子中α-螺旋、β-折叠、β-转角等组合在一起，彼此相互作用，形成有规则的二级结构组合体，作为三级结构的单元，其基本结合形式有:αα,βββ,βαβ。结构域(structuraldomain)：分子量大的蛋白质,多肽链往往以超二级结构为单元组成两个或两个以上相对独立的区域，再形成三级结构，这些相对独立的区域称为结构域。（二）蛋白质的三级结构(tertiarystructure)1.概念:整条肽链中所有原子或基团的空间排布称为蛋白质的三级结构，即多肽链中全部氨基酸残基的相对空间位置。2.维系键:疏水作用、离子键、氢键、VanderWaals力等次级键。三级结构的特征：

含多种二级结构单元；

有明显的折叠层次；

是紧密的球状或椭球状实体；

分子表面有一空穴(活性部位)；

疏水侧链埋藏在分子内部，亲水侧链暴露在分子表面。3.三级结构的重要性：三级结构形成后，蛋白质分子才形成固有的分子形状；才具有亲水胶体的特性；功能蛋白质的活性部位得以形成并表现出相应的生物学活性。核糖核酸酶三级结构示意图N

His12CHis119Lys41

(三）蛋白质的四级结构(quarternarystructure)1.概念:蛋白质分子中各个亚基的空间排布及亚基接触部位的布局和相互作用,称为蛋白质的四级结构。蛋白质分子中每条具独立三级结构的多肽链称为亚基(subunit).2.维系键:疏水键、氢键、离子键等次级键。Hemoglobin思考：四级结构中的亚基与结构域有何不同？一、根据分子形状分类：球状蛋白：长短轴之比<10纤维状蛋白：长短轴之比>10二、根据组成分类：单纯蛋白结合蛋白：单纯蛋白质+辅基或非蛋白质部分三、根据生物学功能分类四、根据溶解度分类：可溶性蛋白；醇溶性蛋白；不溶性蛋白蛋白质的分类第三节蛋白质结构与功能的关系一、蛋白质的一级结构与功能的关系

一级结构→空间构象→功能1.一级结构中“关键”部分相同,其功能相同。如：不同动物来源的胰岛素一级结构中“关键”部分变化,其活性也改变。Insulinofhuman2.一级结构不同，生物学功能各异。如：催产素与抗利尿激素

SS加压素H2N半胱酪苯丙谷胺天胺半胱脯精甘催产素H2N…………异亮………亮……………383.一级结构变化与疾病的产生分子病如：镰刀状红细胞性贫血

Hb：6位Glu→Val二、蛋白质空间结构与功能的关系⒈蛋白质前体的活化另外，蛋白质仅构象发生改变,其功能活性也随之改变。

核糖核酸酶

2.蛋白质的变构现象(allostericeffect):指一个蛋白质与其配体(或其它蛋白)结合后,引起蛋白质的构象发生改变,并伴随其活性发生改变。协同效应:一个亚基与其配体结合后,能影响此寡聚体中另一亚基与配体的结合。如:Hemoglobin与Myoglobin第四节蛋白质的理化性质一、两性解离和等电点蛋白质两末端的氨基和羧基及侧链中某些基团在一定条件下均可解离.1.蛋白质的等电点(pI):使某一蛋白质分子所带正负电荷数相等,净电荷为零时溶液的PH值。蛋白质的等电点沉淀、离子交换和电泳等基本原理均以蛋白质的两性解离与等电点的特性为基础。电泳:带电粒子在电场中向电性相反的电极移动的现象，可用于分离、鉴定蛋白质。二、高分子性质，即胶体性质蛋白质为分子量1万至100万的高分子物质,其在溶液中形成的质点直径在1-100nm胶体质点范围内。蛋白质胶体稳定的因素:蛋白质颗粒表面具水化层

蛋白质颗粒表面带同性电荷去除这两个稳定因素,蛋白质极易沉淀。蛋白质具有分子扩散现象；布朗运动；可用超速离心法分离蛋白质；有较大的粘度，随蛋白质分子的水合作用和分子的不对称性增大而增大；不能透过半透膜，可用透析法纯化蛋白。三.蛋白质的沉淀1.概念：蛋白质分子聚集而从溶液中析出的现象称为蛋白质的沉淀。2.常用的沉淀方法（1）盐析法：(NH4)2SO4、NaCl、Na2SO4低盐浓度可使蛋白质溶解度增加，称为盐溶作用。高盐浓度因破坏蛋白质的水化层并中和其电荷，促使蛋白质颗粒相互聚集而沉淀，称为盐析作用。采用不同盐浓度可将蛋白质分别沉淀，称分级沉淀；并不易发生变性。（2）有机溶剂沉淀：乙醇、甲醇、丙酮等（3）某些酸类沉淀：PH<PI时，苦味酸、钨酸、三氯乙酸（4）重金属盐沉淀：PH>PI时，Pb2+，Hg2+，Ag+，Cu2+（5）加热凝固：变性沉淀，偏酸或偏碱不易。蛋白质的凝固作用：蛋白质经加热变成较坚固的凝块，不易再溶于强酸和强碱中，称为蛋白质的凝固作用。四.蛋白质的变性(denaturation)1.概念：在某些理化因素的作用下，蛋白质特定的空间构象发生改变或破坏，从而导致其生物学活性的丧失和一些理化性质的改变的现象，称为蛋白质的变性。2.变性因素：理：加热、高压、紫外线、超声波、剧烈震荡等化：强酸、强碱、重金属离子、尿素、乙醇、丙酮等3.变性的本质：蛋白质分子空间构象的改变或破坏（二硫键和非共价键破坏），不涉及一级结构改变或肽键的断裂。4.变性作用的特征：生物活性丧失；某些理化性质改变（溶解度降低，粘度增加，结晶能力消失，易被蛋白酶水解。）5.变性作用的应用举例：变性因素应用于消毒及灭菌，制备、保存蛋白质制剂需防止变性。6.复性：去除变性因素后，有些变性程度较轻的蛋白质仍可恢复或部分恢复其原有的构象和功能。许多蛋白质的变性为不可逆变性。变性的蛋白质易于沉淀，而沉淀的蛋白质不一定发生变性。五.蛋白质颜色反应（可做定性或定量测定）1.茚三酮反应2.双缩脲反应氨基酸无此反应3.酚试剂反应六.蛋白质的紫外吸收

A280nm第五节蛋白质的分离与纯化的基本原理㈠根据溶解度不同的分离纯化方法盐析、有机溶剂沉淀、等电点沉淀㈡根据分子大小不同的分离纯化方法透析、超滤、凝胶层析、离心㈢根据电离性质不同的分离纯化方法电泳、离子交换层析㈣根据配体不同的分离纯化方法亲和层析透析及超滤法*透析(dialysis)利用透析袋把大分子蛋白质与小分子化合物分开的方法。*超滤法

应用正压或离心力使蛋白质溶液透过有一定截留分子量的超滤膜，达到浓缩蛋白质溶液的目的。丙酮沉淀、盐析及免疫沉淀*使用丙酮沉淀时，必须在0～4℃低温下进行，丙酮用量一般10倍于蛋白质溶液体积。蛋白质被丙酮沉淀后，应立即分离。除了丙酮以外，也可用乙醇沉淀。

*盐析(saltprecipitation)是将硫酸铵、硫酸钠或氯化钠等加入蛋白质溶液，使蛋白质表面电荷被中和以及水化膜被破坏，导致蛋白质沉淀。*

免疫沉淀法：将某一纯化蛋白质免疫动物可获得抗该蛋白的特异抗体。利用特异抗体识别相应的抗原蛋白，并形成抗原抗体复合物的性质，可从蛋白质混合溶液中分离获得抗原蛋白。电泳(elctrophoresis)

蛋白质在高于或低于其pI的溶液中为带电的颗粒，在电场中能向正极或负极移动。这种通过蛋白质在电场中泳动而达到分离各种蛋白质的技术,称为电泳。根据支撑物的不同，可分为薄膜电泳、凝胶电泳等。

几种重要的蛋白质电泳:*聚丙烯酰胺凝胶电泳