微生物学检验技术 课件 30项目三十：扩散法药敏试验

项目三十扩散法药敏试验学习目标1．掌握常规药敏试验的药物选择原则；扩散法药敏试验的方法及结果判断与分析。2．熟悉临床常用抗菌药物种类。3．了解临床常用抗菌药物的作用机制。4．能选择合适的抗菌药物进行扩散法药敏试验并判断结果。5．具有正确选择抗菌药物对试验菌株进行扩散法药敏试验，并正确判读结果的能力。项目三十扩散法药敏试验思维导图项目三十扩散法药敏试验一、药物敏感试验概述项目三十扩散法药敏试验一、药物敏感试验概述概述抗菌药物是指具有杀菌或抑菌活性的抗生素或化学合成药物，这类药物对感染性疾病的治疗发挥了重要作用。一种抗菌药物如果以很小剂量便可抑制、杀灭细菌，则称该细菌对该抗菌药物具有敏感性。细菌耐药性指细菌对于抗菌药物不敏感，具有耐受性。不同细菌对抗菌药物的敏感性与耐药性不同，同种细菌不同菌株对同一药物的敏感性与耐药性也有差异。通过在体外检测细菌对抗菌药物的敏感性，可指导临床合理选用抗菌药物。1.β-内酰胺类β-内酰胺类抗菌药物的化学结构中均含有四个基团构成的β-内酰胺环，基主要的作用模式是抑制细胞壁的合成。根据β-内酰胺环的附加环结构或取代基团的特点，临床常用的β-内酰胺类抗菌药物可进一步分为青霉素类、头孢菌素类，以及非典型β-内酰胺类，如碳青霉烯类、拉氧头孢类、单环β-内酰胺类及β-内酰胺酶抑制剂的复合制剂等。（一）临床常用抗菌药物一、药物敏感试验概述1.β-内酰胺类各种β-内酰胺类抗生素的作用机制均相似，都能抑制胞壁粘肽合成酶，即青霉素结合蛋白（penicillinbindingproteins,PBP），从而阻碍细胞壁粘肽合成，使细菌胞壁缺损，菌体膨胀裂解。各菌种都有青霉素结合蛋白，按分子量大小，分别称PBP1、PBP2、PBP3等，PBP1为分子量最大。青霉素结合蛋白又被称为下列酶：转糖基酶、转肽酶、D-羧肽酶、内肽酶。β-内酰胺类抗菌药物通过与青霉素结合蛋白结合，抑制上述酶的活性从而抑制细菌细胞壁合成。一、药物敏感试验概述（一）临床常用抗菌药物1.β-内酰胺类（1）青霉素类：青霉素类（penicillins）抗生素包括天然青霉素、耐青霉素酶青霉素、广谱青霉素、青霉素+β-内酰胺酶抑制剂。青霉素类抗菌药物的作用是通过与青霉素结合蛋白（PBP）结合干扰细菌细胞壁的合成，而哺乳类动物的细胞没有细胞壁，所以青霉素对人体的毒性很低，达到有效杀菌浓度的青霉素对人体细胞几无影响。一、药物敏感试验概述（一）临床常用抗菌药物1.β-内酰胺类（2）头孢菌素类：头孢菌素类（cephalosporins）抗生素与青霉素比较，其对β-内酰胺酶的稳定性高于青霉素，抗菌谱较青霉素广、抗菌作用强、变态反应少、毒性小。作用机制在于其能与青霉素结合蛋白结合，发挥抑菌和杀菌作用。根据其抗菌谱、抗菌活性、对β-内酰胺酶的稳定性以及肾毒性的不同分为五代。一、药物敏感试验概述（一）临床常用抗菌药物1.β-内酰胺类（3）碳青霉烯类：碳青霉烯类（carbapenems）与青霉素类结构稍有不同，此类抗菌药物对β-内酰胺酶的水解有更强的抵抗力，对许多革兰阴性和革兰阳性菌具有广谱的抗菌活性，因其有对β-内酰胺酶稳定以及毒性低等特点，已经成为治疗严重细菌感染最主要的抗菌药物之一。常用的有亚胺培南、美罗培南、帕尼培南、厄他培南、比阿培南、多尼培南。一、药物敏感试验概述（一）临床常用抗菌药物1.β-内酰胺类（4）拉氧头孢类：又分成头霉烯类（cephamycins）和氧头孢烯类（oxacephems）。头霉烯类有有头孢西、头孢替坦、头孢美唑等，对革兰阳性菌有较好的抗菌活性，对厌氧菌有高度抗菌活性，但对非发酵菌无效。氧头孢烯类代表药物为拉氧头孢和氟氧头孢，具有第三代头孢菌素的特点，抗菌谱广，对革兰阴性菌作用强，对产酶的金黄色葡萄球菌也具有一定的抗菌活性。一、药物敏感试验概述（一）临床常用抗菌药物1.β-内酰胺类（5）单环β-内酰胺类：单环β-内酰胺类（monobactams）代表药物有氨曲南和卡芦莫南，属于抗需氧革兰阴性杆菌窄谱抗生素，对脑膜炎奈瑟菌、淋病奈瑟菌、流感嗜血杆菌、铜绿假单胞菌作用强，对革兰阳性菌和厌氧菌无作用。一、药物敏感试验概述（一）临床常用抗菌药物1.β-内酰胺类（6）β-内酰胺酶抑制剂及复合制剂：β-内酰胺酶抑制剂有克拉维酸、舒巴坦、他唑巴坦。其对β-内酰胺酶有很强的抑制作用，与相应抗生素联合用药能有效对抗临床耐药性的产生。目前临床应用的β-内酰胺酶抑制剂复方制剂有阿莫西林-克拉维酸、替卡西林-克拉维酸、氨苄西林-舒巴坦、头孢哌酮-舒巴坦和哌拉西林-他唑巴坦。一、药物敏感试验概述（一）临床常用抗菌药物2.氨基糖苷类氨基糖苷类（aminoglycosides）是由氨基糖与氨基环醇通过氧桥连接而成的苷类抗菌药物，作用机制为：①依靠离子吸附在菌体表面，造成膜的损伤；②与细菌核糖体30S小亚基发生不可逆结合，抑制mRNA的转录和蛋白质的合成，产生无意义的蛋白质。种类有来自链霉菌的链霉素、卡那霉素、妥布霉素、新霉素等，来自小单胞菌的庆大霉素等天然氨基糖苷类，还有阿米卡星，奈替米星等半合成氨基糖苷类。氨基糖苷类抗生素可起到杀菌作用，属静止期杀菌药。一、药物敏感试验概述（一）临床常用抗菌药物2.氨基糖苷类氨基糖苷类抗生素对铜绿假单胞菌、肺炎克雷伯菌、大肠埃希菌等常见革兰阴性杆菌的抗生素后效应较长，可用于治疗需氧革兰阴性杆菌所致的严重感染，也可与作用于细胞壁的抗菌药物（如青霉素、氨苄西林或万古霉素）协同联合应用来治疗某些耐药的革兰阳性菌。但由于其有比较严重的耳毒性和肾毒性，应用受到一些限制。一、药物敏感试验概述（一）临床常用抗菌药物3.喹诺酮类氨基糖苷类抗生素对铜绿假单胞菌、肺炎克雷伯菌、大肠埃希菌等常见革兰阴性杆菌的抗生素后效应较长，可用于治疗需氧革兰阴性杆菌所致的严重感染，也可与作用于细胞壁的抗菌药物（如青霉素、氨苄西林或万古霉素）协同联合应用来治疗某些耐药的革兰阳性菌。但由于其有比较严重的耳毒性和肾毒性，应用受到一些限制。一、药物敏感试验概述（一）临床常用抗菌药物3.喹诺酮类（1）第一代喹诺酮类：有萘啶酸和吡咯酸等，只对大肠埃希菌、志贺菌属、克雷伯菌属、少部分变形杆菌属有抗菌作用，因疗效不佳现已少用。（2）第二代喹诺酮类：在抗菌谱方面有所扩大，对肠杆菌属、枸橼酸杆菌、绿脓杆菌、沙雷杆菌也有一定抗菌作用。吡哌酸是国内主要应用品种。一、药物敏感试验概述（一）临床常用抗菌药物3.喹诺酮类（3）第三代喹诺酮类：抗菌谱进一步扩大，对葡萄球菌等革兰阳性菌也有抗菌作用，对一些革兰阴性菌的抗菌作用则进一步加强。有诺氟沙星、氧氟沙星、培氟沙星、依诺沙星、环丙沙星等。本代药物的分子中均有氟原子，因此称为氟喹诺酮。一、药物敏感试验概述（一）临床常用抗菌药物3.喹诺酮类（4）第四代喹诺酮类：与前三代药物相比在结构上修饰，结构中引入8-甲氧基，有助于加强抗厌氧菌活性，而C-7位上的氮双氧环结构则加强抗革兰阳性菌活性并保持原有的抗革兰阴性菌的活性，不良反应更小，但价格较贵。对革兰阳性菌抗菌活性增强，对厌氧菌包括脆弱拟杆菌的作用增强，对典型病原体如肺炎支原体、肺炎衣原体、军团菌以及结核分枝杆菌的作用增强。常用的有加替沙星与莫西沙星。一、药物敏感试验概述（一）临床常用抗菌药物4.大环内脂类大环内酯类（macrolides）作用特点和机制为：①不可逆结合细菌核糖体50S大亚基的23S单位，抑制细菌蛋白质合成和肽链延伸；②新一代大环内酯类具有免疫调节功能，能增强单核-吞噬细胞吞噬功能。常用药物有红霉素、螺旋霉素、阿奇霉素、克拉霉素、罗红霉素等。大环内酯类抗生素抗菌谱广，对大多数革兰阳性菌、部分革兰阴性菌及一些非典型致病菌（支原体、衣原体等）均有效。红霉素对军团菌有良好的抗菌作用。阿奇霉素、克拉霉素尚可用于流感嗜血杆菌、卡他莫拉菌所致的社区获得性呼吸道感染。一、药物敏感试验概述（一）临床常用抗菌药物5.糖肽类糖肽类（glycopeptides）具有复杂的化学结构，作用机制是与细菌细胞壁肽聚糖合成的前体D-丙氨酰-D-丙氨酸末端结合，阻断肽聚糖合成，从而阻止细胞壁合成，其作用部位与β-内酰胺类抗生素不同，不与青霉素类竞争结合部位，此类抗生素的化学结构和作用机制独特，故与其他抗菌药物无交叉耐药现象。常用的有万古霉素、去甲万古霉素和替考拉宁。抗菌谱主要包含革兰阳性菌（革兰阳性球菌、杆菌和革兰阳性厌氧菌），对革兰阴性菌无效。仅用于严重革兰阳性菌和耐药菌株（如MRSA）感染。临床疗效确切，但肾毒性明显。一、药物敏感试验概述（一）临床常用抗菌药物6.磺胺类磺胺类（sulfanilamides）为人工合成的抗菌药物，作用机制是竞争性地与二氢叶酸合成酶结合，阻止氨基苯甲酸与二氢叶酸合成酶结合，使细菌体内核酸合成的重要物质辅酶F钝化而导致细菌生长受到抑制。常用有三类：一、药物敏感试验概述（一）临床常用抗菌药物6.磺胺类（1）肠道易吸收磺胺：本类药物口服后均可吸收，根据血药浓度持续时间不同可分为短效磺胺、中效磺胺和长效磺胺三类。主要用于全身感染，如败血症、尿路感染、伤寒、骨髓炎等。（2）肠道难吸收磺胺：能在肠道保持较高的药物浓度。主要用于肠道感染如菌痢、肠炎等，如酞磺胺噻唑。（3）外用磺胺：主要用于灼伤感染、化脓性创面感杂、眼科疾病等，如磺胺醋酰、磺胺嘧啶银盐、甲磺灭脓。一、药物敏感试验概述（一）临床常用抗菌药物7.四环素类四环素类（tetracyclines）能特异性地与细菌核糖体30S亚基的A位置结合，阻止氨基酰-tRNA在该位上的联结，从而抑制肽链的增长和影响细菌蛋白质的合成。临床上常作为衣原体、立克次体感染的首选药物。四环素类分为短效、中效和长效，短效四环素有土霉素、四环素；中效四环素有地美环素、美他环素；长效四环素有多西环素、米诺环素。四环素为广谱抗菌药物，包括对革兰阳性菌和阴性菌，如部分葡萄球菌、链球菌、肺炎链球菌、大肠埃希菌等有一定的抗菌作用，对立克次体、支原体、螺旋体、阿米巴等敏感。一、药物敏感试验概述（一）临床常用抗菌药物8.氯霉素类氯霉素类（chloramphenicol）抗菌药物包括有氯霉素、甲砜霉素及无味氯霉素等。通过可逆地与50S亚基结合,阻断转肽酰酶的作用，干扰带有氨基酸的胺基酰-tRNA终端与50S亚基结合，从而使新肽链的形成受阻，抑制蛋白质合成。该类抗菌药物脂溶性强，易进入脑脊液和脑组织。由于氯霉素还可与人体线粒体的70S结合,因而也可抑制人体线粒体的蛋白合成，对人体产生毒性，可引起与剂量相关的骨髓抑制和灰婴综合征。一、药物敏感试验概述（一）临床常用抗菌药物9.林可酰胺类林可酰胺类包括盐酸林可霉素和克林霉素。其作用机制是与细菌50S核糖体亚基结合，抑制蛋白质合成，并可干扰肽酰基的转移，阻止肽链的延长。用于敏感厌氧菌及需氧菌所致的感染，主要用于青霉素过敏患者。适用于厌氧菌、肺炎链球菌、其他链球菌属（粪肠球菌除外）及金黄色葡萄球菌所致的下呼吸道感，克林霉素是治疗肺部厌氧菌感染、衣原体性传播性疾病的首选药物。一、药物敏感试验概述（一）临床常用抗菌药物10.其他抗菌药物（1）硝基呋喃类：硝基呋喃类（nitrofurantoin）药物常见的有呋喃唑酮、呋喃它酮、呋喃妥因和呋喃西林。作用于微生物酶系统，抑制乙酰辅酶A，干扰微生物糖类的代谢，从而起抑菌作用，是一种广谱抗生素，对大多数革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌、真菌和原虫等病原体均有杀灭作用。但由于本类药品口服吸收后在体内很快被代谢灭活，不适于治疗全身感染而仅用于肠道、尿路感染和外用消毒。一、药物敏感试验概述（一）临床常用抗菌药物10.其他抗菌药物（2）硝基咪唑类：硝基咪唑类（nitromidazole）作用机制是硝基环被厌氧菌还原而阻断细菌DNA合成，阻止DNA的转录、复制，导致细菌死亡。临床常使用的有甲硝唑和替硝唑。硝基咪唑类药物对革兰阳性、阴性厌氧菌，包括脆弱类杆菌有较好的抗菌作用，对需氧菌无效。一、药物敏感试验概述（一）临床常用抗菌药物10.其他抗菌药物（3）链阳霉素类：链阳霉素类（streptogramin）代表药物是奎奴普丁-达福普汀（quinupristin-dalfopristin）。用于由多重耐药革兰阳性菌引起的严重感染，尤其是医院内获得性感染。本类药物的特点是对MRSA感染的有效率可达90%以上。链阳霉素类除了对革兰阳性菌具有抗菌活性外，对部分革兰阴性菌和厌氧菌也有抗菌活性。一、药物敏感试验概述（一）临床常用抗菌药物10.其他抗菌药物（4）噁唑烷酮类：噁唑烷酮类（oxazolidinones）对革兰阳性球菌，特别是多重耐药的革兰阳性球菌，具有较强的抗菌活性，与其他药物不存在交叉耐药现象，代表药物是利奈唑胺。一、药物敏感试验概述（一）临床常用抗菌药物10.其他抗菌药物（5）利福霉素类：利福霉素类（rifamycins）具有广谱抗菌作用，对结核杆菌、麻风杆菌、链球菌、肺炎球菌等革兰氏阳性细菌，特别是耐药性金黄色葡萄球菌的作用都很强。目前在临床应用的有利福平、利福喷汀及利福布汀。一、药物敏感试验概述（一）临床常用抗菌药物1.根据抗菌药物的抗菌谱每种抗菌药物都有一定的抗菌谱，药物的类型不同，其抗菌范围也不同。同类别，不同品种的药物，其作用也各有特点。如药敏试验中的青霉素G主要用于革兰阳性菌，妥布霉素主要用于革兰阴性菌。一、药物敏感试验概述（二）抗菌药物选择原则2.根据细菌的种属①A组是对特定的菌种，常规测试并报告的基本抗菌药物。②B组是常规测试，但只选择性报告的基本抗菌药物③C组包括替代性或补充性的抗菌药物。在某些医疗机构，地方或流行菌株对A组/B组多个药物耐药时，需测试该组药物；当对基本测试药物过敏、或测试少见细菌时、或流行病学和感染控制需要时，需测试的补充药物。④U组包括那些仅仅或主要用于治疗泌尿道感染的抗菌药物。⑤O组抗菌药物对该组细菌有临床适应证，但一般不用做常规试验和报告的候选。一、药物敏感试验概述（二）抗菌药物选择原则3.根据某些特殊的耐药机制一般情况下，报告的药物必须是药敏试验过的，但如果一种药物的药敏结果可以推测另外一种或一类药物的结果则可以例外，如葡萄球菌对苯唑西林耐药，提示其对所有β-内酰胺类抗菌药物均耐药。一、药物敏感试验概述（二）抗菌药物选择原则4.根据抗菌药物的药代动力学特点不同的药物在体内吸收、分布、代谢，排泄的过程各不相同，即使作用完全相同的药物，体内过程也往往有所差别，选择药物时应考虑这些因素。如尿液标本测试呋喃妥因和某几种喹诺酮类；脑脊液标本测试美罗培南、氯霉素等，而不测试氨基糖苷类、四环素等。一、药物敏感试验概述（二）抗菌药物选择原则5.根锯流行病学资料不同地区，不同时间病原菌的分布和耐药情况各不相同，应根据本地区病原菌的耐药谱，咨询感染科医生，医院药事委员会及盛染控制委员会的医生，以选择最适于试验和报告的抗菌药物。一、药物敏感试验概述（二）抗菌药物选择原则6.所选药物具有代表性实验室不需要也不可能对每种抗菌药物均进行测试。原则上在各类抗菌药物中透择一种代表性药物做测试，可反映一类药物的耐药特性，如大环内酯类选红霉素，喹诺酮类选环丙沙星或氧氟沙星，头孢菌素类选一代、二代、三代头孢菌素的代表药物，选择药物时还需考虑价格因素。一、药物敏感试验概述（二）抗菌药物选择原则抗菌药物敏感试验（antimicrobialsusceptibilitytest，AST）是检测微生物对抗菌药物的体外敏感性，以指导临床合理选用药物的微生物学试验，简称药敏试验。意义在于：①预测和监控抗菌药物的治疗效果，指导临床医师选择用药；②发现或提示细菌耐药机制的存在，能帮助临床医生选择合适的药物，避免产生或加重细菌的耐药；③监测细菌耐药性，了解本医院及本地区耐药菌的变迁，掌握耐药菌感染的流行病学，以控制和预防耐药菌感染的发生和流行；④对病原菌耐药谱进行分析和分型，可用于某些菌种的鉴定。一、药物敏感试验概述（三）药物敏感试验概述1.最低抑菌浓度最低抑菌浓度（minimalinhibitoryconcentration，MIC）是指抗菌药物能够抑制被测菌生长的最低药物浓度。一般用μg/ml或U/ml表示。对同一细菌而言MIC值越小，其抗菌能力越强，细菌对这种药物就越敏感。一、药物敏感试验概述（三）药物敏感试验概述2.折点折点（Breakpoint）能预测临床治疗效果，用以判断敏感、中介、剂量依赖型敏感、耐药、非敏感的最低抑菌浓度（MIC）或者抑菌圈直径（mm）的数值。3.敏感敏感（susceptible，S）指当抗菌药物对分离株的MIC值或抑菌圈直径处于敏感范围时，使用推荐剂量进行治疗，该药在感染部位通常达到的浓度可抑制被测菌的生长，临床治疗可能有效。一、药物敏感试验概述（三）药物敏感试验概述4.中介中介（intermediate，I）当菌株的MIC值或抑菌圈直径处于中介时，该数值接近药物在血液和组织中达到的浓度，从而治疗反应率低于敏感菌群。该分类意味着采用高于常规剂量治疗时或在药物生理浓集的部位，临床治疗可能有效。该分类同样可作为“缓冲域”，以防止由微小、不可控的技术因素导致的重大偏差，尤其是毒性范围较窄的药物。一、药物敏感试验概述（三）药物敏感试验概述5.剂量依赖型敏感剂量依赖型敏感（Susceptible-dosedependent；SDD）细菌菌株对抗菌药物的敏感性依赖于抗菌药物的剂量。当某种药物对菌株的MIC或抑菌圈直径在SDD范围时，临床可通过提高剂量和（或）增加给药频率等修正给药方案以达到临床疗效。一、药物敏感试验概述（三）药物敏感试验概述6.耐药耐药（resistant，R）是指当抗菌药物对分离株的MIC值或抑菌圈直径处于该分类范围时，使用常规治疗方案，该药在感染部位所达到的药物浓度不能抑制细菌的生长，和（或）被测菌株获得特殊耐药机制，且治疗性研究显示该药临床疗效不确切。一、药物敏感试验概述（三）药物敏感试验概述7.非敏感非敏感（Nonsusceptible；NS）对于那些因未现或罕现耐药，而仅具有敏感折点的抗菌药物，当该药对某分离株的MIC值高于或抑菌圈直径低于敏感折点时，此分类为非敏感。一、药物敏感试验概述（三）药物敏感试验概述将含有定量抗菌药物的纸片贴在已接种测试菌的琼脂平板上。纸片中所含的药物吸收琼脂中的水分溶解后，不断向纸片周围区域扩散，形成递减的梯度浓度。在纸片周围抑菌浓度范围内测试菌的生长被抑制，从而形成透明的抑菌圈。抑菌圈的大小反映测试菌对测定药物的敏感程度，并与该药对测试菌的最低抑菌浓度（MIC）呈负相关关系，即抑菌圈越大，MIC越小。二、扩散法药敏试验操作方法（一）实验原理1.培养基目前，在非苛养菌的常规药敏试验中，CLSI推荐使用的培养基是Mueller-Hinton（M-H）琼脂，可直接购买M-H琼脂平板或先购买脱水的培养基，再按照产品的说明自行制备。其厚度为4mm，pH应为7.2～7.4。新制备的琼脂平板可当天使用或密封于塑料袋中以减少水分蒸发，保存于2～8℃，使用前如琼脂表面过分潮湿，应放于孵箱（35～37℃）或在室温下敞开盖子放置于层流罩中，直到多余的水分蒸发（通常10～30min）。在接种培养基时，其表面或平板盖子的表面不应有可见的潮湿水珠。（二）实验材料二、扩散法药敏试验操作方法2.抗菌药物纸片药敏纸片为直径6.35mm、吸水量为0.02mL的专用药敏纸片。药敏纸片使用前需室温平衡1h～2h。纸片需密封贮存于-20℃冰箱内。开封后的纸片可置于含干燥剂的螺口塑料或玻璃管中2℃～8℃保存，不超过1周。（二）实验材料二、扩散法药敏试验操作方法3.标准比浊管0.5麦氏单位的BaSO4浊度标准管制备方法如下：取0.048mol/L的BaCl2（1.175％W/VBaCl2·2H2O）0.5ml加人到99.5ml的0.18mol/LH2SO4（1%，V/V）中并不断搅动，以维持混悬状态。标准比浊管的正确浓度应使用光径为1cm分光光度计来测定，0.5麦氏单位的标准比浊管在625mm处的吸光度值应为0.08～0.13，按每管4-6ml将硫酸钡悬液分装于带旋盖的管子中贮存于室温暗处，使用前漩涡震荡混匀。（二）实验材料二、扩散法药敏试验操作方法4.被检菌液为确保纸片扩散法药敏试验的重复性，菌株接种必须经过标准化，接种物的准备可通过生长法或直接菌落悬液法，一般采用比浊法校正菌悬液浓度。（二）实验材料二、扩散法药敏试验操作方法4.被检菌液（1）肉汤增菌法：从琼脂平板上选取至少3～5个形态特征一致的菌落，用接种环接触每个菌落顶部后将细菌转移到含4～5m适宜的肉汤培养基管中。将此肉汤培养物置37℃孵育至其浊度等于或超过0.5麦氏标准（通常需2～6h）。用无菌生理盐水或肉汤将旺盛生长的肉汤培养基的浊度调整到光学上相当于0.5麦氏单位，此时对于大肠埃希菌ATCC25922来说，肉汤悬液中细菌数为（1～2）×108CFU/ml。（二）实验材料二、扩散法药敏试验操作方法4.被检菌液（2）直接菌落法：从孵育了18～24h的非选择性培养基（如血琼脂）平板上，挑取单个菌落，直接用胰大豆肉汤或无菌生理盐水制成悬液作为接种物，然后按上述方法将浊度调整至0.5麦氏单位。此法是检测苛养菌（如嗜血杆菌属、淋病奈瑟菌和链球菌）和潜在的对甲氧西林或苯唑西林耐药的葡萄球菌的推荐方法。需要注意的是当用此方法测试甲氧苄啶/磺胺甲噁唑时，来自血琼脂培养基的菌落可能带有足够的甲氧苄啶或磺胺拮抗物，细菌可在抑菌圈内部沿着敏感菌株的周围产生模糊生长。接种物制备后最好应在15min内接种M-H琼脂平板。（二）实验材料二、扩散法药敏试验操作方法1.接种用无菌棉拭子蘸取菌液，在管内壁将多余菌液旋转挤去后，在M-H琼脂平板表面均匀涂抹接种3次，每次旋转平板60°，最后沿平板内缘涂抹1周。盖上皿盖，置室温放置3～5min（不要超过15min），使平皿表面稍干。接种时，注意无菌操作。校正浓度后的菌液在15min内接种完毕。（三）实验过程二、扩散法药敏试验操作方法2.贴抗菌药物纸片接种菌悬液后的M-H琼脂平板置室温下干燥3min～5min。

用纸片分配器或无菌镊子将抗菌药物纸片紧密贴于平皿。各纸片中心相距≥24mm。纸片贴上后不应再移动。（三）实验过程二、扩散法药敏试验操作方法3.孵育贴上纸片15min内，须把平皿倒置放于35℃孵箱中孵育16h～18h。对于某些特殊抗菌药物如苯唑西林或万古霉素，孵育时间需延长至24h。（三）实验过程二、扩散法药敏试验操作方法将平皿置于黑色背景下，利用反射光从平皿背面用游标卡尺或直尺测量无明显细菌生长区域的直径（含纸片），即抑菌圈直径，取整数位，单位为mm。培养基若加入血液，须打开平皿盖，借助反射光，从正面测量抑菌圈直径。测量万古霉素、利奈唑胺和苯唑西林等的抑菌圈时，使用透射光。测量甲氧苄啶和磺胺类药物的抑菌圈时，可忽视轻微生长（20%或较少菌苔生长）而测量较明显抑制的边缘。三、扩散法药敏试验结果判断与分析（一）结果判断1.影响因素（1）培养基：培养基在室温下的pH应为7.2～7.4，若pH过低某些药物会失去效力（如氨基糖苷类、喹诺酮类和大环内酯类），而另一些药物活性可能增强（如四环素类）；琼脂过厚、过硬会影响药物渗透，造成抑菌圈缩小；反之，过薄会使抑菌圈偏大。（二）质量控制三、扩散法药敏试验结果判断与分析1.影响因素（2）药敏纸片：纸片质量是影响药敏试验结果的主要因素。纸片含药量、吸水性直接影响抑菌圈的大小。纸片保存不当可使药效降低。β-内酰胺类药敏纸片应冷冻储存，且不超过1周，否则效价降低。（3）细菌浓度：待检菌液的浓度、接种量应达到规定的麦氏单位，菌液浓度过大可使抑菌圈缩小，反之可使抑菌圈扩大。（4）操作方法：菌液配置好后放置过长时间、纸片贴放位置、纸片移动、孵箱内平板的放置方法等都将影响结果。（二）质量控制三、扩散法药敏试验结果判断与分析1.影响因素（5）培养条件、温度和时间的控制：置35℃孵育16～24h，量取抑菌圈直径。苯唑西林、甲氧