新生儿溶血病实验室检查（临床输血检验课件）

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常规检查病例分析病例资料：患儿，女，3天【主诉】皮肤黄染3天，伴嗜睡，少动【现病史】患儿母亲孕1产1，自然分娩，生后24h内出现皮肤黄染，且进行性加重，伴嗜睡。精神萎靡，少吃，少动。院外退黄治疗效果不佳，为进一步治疗，遂来我院，门诊以“新生儿黄疸”收入我科。【家族史】其母血型为O型，Rh阳性，无有毒物质接触史，孕期体健，无高血液、抽搐等病史，其父血型为A型，身体健康。问题：1.根据以上资料，判断该患儿可能患有什么疾病？2.为了诊断该疾病，还需要做哪些常规检查？血常规检查红细胞、血红蛋白可正常或下降网织红细胞常增多白细胞可增高血小板计数可正常血涂片可见有核红细胞和球形红细胞血液胆红素测定

胎儿红细胞破坏增多，血红蛋白释放增加，血液中胆红素增高，以未结合胆红素升高为主，若溶血病患儿出生后黄疸逐渐加深，胆红素应动态检测。羊水胆红素含量测定

正常羊水无色透明，严重溶血时羊水呈黄色，测定羊水胆红素含量有助于胎儿病情及考虑母体终止妊娠时间。

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新生儿溶血病概述1.掌握新生儿溶血病的定义及发病原因2.熟悉新生儿溶血病的临床表现3.了解新生儿溶血病的发病机制学习要求新生儿溶血病——定义广义狭义

各种病因使胎儿或新生儿红细胞破坏增多的疾病，病因除母婴血型不合之外、还有红细胞葡萄糖-6-磷酸脱氢酶缺陷、遗传性球形红细胞增多症、地中海贫血等。

特指母婴血型不合，母亲体内产生与胎儿血型抗原不合的血型抗体，这种抗体通过胎盘进入胎儿体内，引起胎儿或新生儿同种免疫性溶血性疾病，常见由ABO和Rh血型系统的血型不合。新生儿溶血病---发病原因ABO-HDN发病原因O/A型O型A型

以左图为例，若母亲为O型，孩子为A型，则孩子必定获得了由父亲遗传来而母亲所缺乏的显性基因A基因。理论上来讲，O型母亲孕育A/B型胎儿、A型母亲孕育B/AB型胎儿、B型母亲孕育A型胎儿都有可能发生HDN，但临床上最多见于O型母亲，A/B型胎儿，其他则比较少见。新生儿溶血病---发病原因Rh-HDN发病原因RhD阴性RhD阳性RhD阳性

在Rh血型不合引起的HDN中，多为RhD阴性母亲孕育了RhD阳性的胎儿。母婴ABO血型不合对Rh血型不合的HDN有一定的保护作用。Rh阳性胎儿红细胞进入Rh阴性母体后，由于同时存在ABO血型不合，母体内ABO抗体可破坏带有相应ABO血型抗原的胎儿红细胞，减少胎儿Rh血型抗原对母体的刺激和相应抗体产生，减轻Rh溶血。

Rh血型不合的HDN发生率少数民族比汉族人高。新生儿溶血病----发病机制

正常妊娠下，母体与胎儿的血液循环系统独立存在，胎儿血细胞一般不进入母体。但在妊娠后期由于胎盘早剥或产道损伤或胎盘剥离过程使胎儿红细胞通过破损子宫绒毛膜进入母体，刺激母体产生相应抗体。一般情况下，首次妊娠，母体产生的抗体基本为IgM类抗体，不能通过胎盘。再次妊娠时，如果胎儿红细胞再次进入母体，母体短期内产生大量IgG类抗体,可以通过胎盘,进入胎儿血液循环,使胎儿红细胞破裂,发生溶血.血型抗体（IgG和IgM)免疫抗体IgG天然抗体IgM二聚体，分子量小，易透过胎盘。“两个手”，盐水中不能出现肉眼凝集。五聚体，分子量大，不能透过胎盘。“十个手”，盐水中可见肉眼凝集新生儿溶血病----发病机制母体中抗体以IgM类为主的:A型/B型母体中抗体以IgG类为主的:O型故90%以上ABO-HDN是母亲为O型，胎儿或新生儿血型为A型或B型，且第一胎即可发生ABO-HDN（自然界广泛存在A、B血型抗原物质）自然界存在A或B型物质，如某些植物、寄生虫、伤寒疫苗、破伤风及白喉类毒素。ABO-HDN发病机制新生儿溶血病----发病机制是不是所有O型母亲都会导致新生儿溶血的发生呢？新生儿溶血病----发病机制ABO-HDN发病影响因素ABO抗原的强弱

ABO抗原在5～6周的胎儿身上已经可以检测出来，但直至出生其抗原发育仍不完全，抗原表达若，抗原位点少，所以每个新生儿红细胞上只能结合很少IgG抗A/抗B以及抗AB抗体，可能不会导致ABO-HDN.新生儿溶血病----发病机制ABO-HDN发病影响因素孕妇体内IgG抗A、抗B的浓度

当母体内存在能够破坏胎儿红细胞的IgG类ABO血型抗体，并不意味着新生儿一定罹患ABO新生儿溶血病，一般认为只有当该抗体效价≥64时才有可能造成新生儿溶血病。新生儿溶血病----发病机制ABO-HDN发病影响因素血型物质的含量某些胎儿的体液中含有可溶性A或B物质，这种物质能中和抗A或抗B的抗体，从而保护胎儿红细胞＋胎儿RBC血型物质IgG类抗体新生儿溶血病----发病机制ABO-HDN发病影响因素IgG亚类IgG1和IgG3型抗体的量与溶血严重性有线性关系。IgG4则关系不大。新生儿溶血病----发病机制ABO-HDN发病影响因素胎盘屏障作用

胎盘上IgG受体数量和种类、吸收IgG抗体的速度都与新生儿溶血病的严重程度有关。新生儿溶血病----发病机制

RhD血型不合多为RhD阴性母亲孕育RhD阳性胎儿所致，RhD阴性人体内无天然Rh抗体，初次免疫反应抗体基本为IgM类,故一般第一胎不发病,Rh-HDN发病机制如下图：

Rh-HDN发病机制Rh阴性孕妇初次妊娠分娩时胎儿Rh阳性红细胞进入母体刺激母体产生抗D抗体胎儿娩出后母体内存在大量IgG类抗D抗体再次怀Rh阳性胎儿，母体IgG抗D抗体进入胎盘，对胎儿红细胞进行破坏，造成溶血初次分娩再次怀孕新生儿溶血病----发病机制

什么情况下Rh-HDN可发生第一胎呢？新生儿溶血病----发病机制第一胎Rh-HDN发病因素

外祖母属于Rh阳性血型，孕妇在儿时受到其母亲即胎儿外祖母Rh阳性红细胞致敏,故Rh阴性血型的孕妇在妊娠第一胎时就可发生新生儿溶血。既往输血史、流产史导致体内产生Rh抗体“外祖母学说”新生儿溶血病----发病机制Rh-HDN发病影响因素

母亲体内IgG的效价是决定HDN严重程度的关键因素.新生儿溶血病----临床表现

水肿黄疸溶血肝脾肿大胆红素脑病（核黄疸）症状取决于母亲抗体滴度、胎儿红细胞抗原强弱、抗体与红细胞结合程度、胎儿代偿性造血能力等因素。新生儿溶血病----临床表现黄疸ABO/Rh溶血胎儿血中胆红素↑胎盘母亲肝脏娩出时黄疸不明显新生儿处理胆红素↓新生儿黄疸新生儿溶血病----临床表现胆红素脑病新生儿处理胆红素↓血清UCB过高胆红素脑病

血脑屏障

发热、嗜睡、吸吮反射减低、痉挛、肌张力低下或增高甚至死亡，存活患儿后期可出现运动障碍、治理不全等后遗症。新生儿溶血病----临床表现贫血胎儿红细胞溶血重胎儿重度贫血Rh-HDN贫血症状明显，出生后萎靡、嗜睡、少吃、少哭，甚至发生心力衰竭。新生儿溶血病----临床表现水肿胎儿贫血严重时低蛋白血症心力衰竭胎儿全身水肿新生儿溶血病----临床表现肝脾肿大胎儿贫血严重时髓外造血↑肝脾肿大临床特点ABO溶血病Rh溶血病发生频率常见不常见发生的母子血型主要发生在母O型胎儿A型或B型母缺少任一Rh抗原胎儿却具有该Rh抗原发生胎次第一胎可发病（约半数）一般发生在第二胎；第一胎也可发病下一胎情况不一定大多数更严重临床表现较轻较重，严重者甚至死胎黄疸生后第2～3天出现24小时内出现并迅速加重贫血

轻可有严重贫血或伴心力衰竭肝脾大

很少发生多有不同程度的肝脾增大晚期贫血很少发生可发生，持续至生后3～6周

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新生儿血清学“三项试验”1.掌握新生儿血清学“三项试验”试验原理2.熟悉新生儿溶血“三项试验”操作步骤3.了解新生儿溶血“三项试验”临床意义学习要求直接抗人球蛋白试验

在盐水介质中，不完全抗体可以致敏人红细胞，但不能让红细胞凝集。加入抗人球蛋白试剂后，抗人球蛋白分子Fab段能与包被在红细胞上球蛋白分子的Fc段结合，借助其桥梁作用，从而使已被不完全抗体致敏的红细胞出现凝集，而未被抗体包被的红细胞则不出现凝集。原理【直接检测新生儿红细胞上是否被不完全抗体所致敏】直接抗人球蛋白试验器材与试剂【器材】试管架、试管、记号笔、微量加样器、37℃水浴箱、塑料吸管、离心机、显微镜、玻片、微柱凝胶孵育器、微柱凝胶离心机【试剂】多特异抗人球蛋白试剂或抗IgG和抗C3d单价抗球蛋白血清、IgG抗D致敏的2%~5%RhD阳性红细胞悬液、2%~5%正常人红细胞悬液和生理盐水、Coombs微柱凝胶卡等。直接抗人球蛋白试验操作（试管法）取受检者红细胞用生理盐水洗涤3次，最后一次洗涤后将上清液弃去，再用滤纸将管口附着的上清液吸尽，配成5%红细胞悬液。1取小试管3支，分别标明被检管、阳性对照、阴性对照2被检管加受检者5%红细胞悬液1滴，阳性对照管加IgG抗D致敏的2%~5%RhD阳性红细胞悬液，阴性管加2%~5%正常人红细胞悬液1滴3在3管中分别加抗多特异性球蛋白试剂1滴，混匀后以1000g离心15s.4配制5%悬红标记试管加样加抗人球试剂直接抗人球蛋白试验操作（试管法）轻晃试管，先用肉眼观察有无凝集，然后在显微镜下观察确认。镜下显示3个及其以上红细胞堆积在一起，并均匀分布在游离红细胞中为阳性，无凝集为阴性。5阳性对照管凝集，阴性对照管不凝集，受检红细胞凝集者为直接抗人球蛋白试验抗阳性，不凝集者为阴性。6阳性者应继续用单特异性抗球蛋白血清检测，方法同多特异性抗球蛋白试剂。7结果观察结果判断单特异性检测直接抗人球蛋白试验操作（微柱凝胶法）将受检者红细胞、阳性对照红细胞和正常人RhD阳性对照红细胞配制0.8%红细胞悬液取出Coombs微柱凝胶卡，标记检测孔、阳性孔和阴性孔在三孔中分别加入多特异性球蛋白试剂50ul分别取0.8%待检者红细胞、0.8%阳性对照红细胞、0.8%正常人红细胞悬液各50ul分别加入检测孔、阳性孔和阴性孔。将加好的凝胶卡置于微柱凝胶孵育器内，37℃孵育15min.将孵育好的凝胶卡置于微柱凝胶离心机内，1000r/min离心10min取出微柱凝胶卡观察结果直接抗人球蛋白试验操作（微柱凝胶法）直接抗人球蛋白试验质量控制1.要证实直抗试验阳性不是补体体外致敏结果，用EDTA抗凝标本，抗凝后立即试验，以免放置过久造成假阳性结果。若怀疑冷抗体引起DAT阳性，标本凝固应保持在37℃，直至血清分离出来。2.每次试验都必须设立阴性和阳性对照。被污染、全凝集或冷凝集均可出现假阳性。3.标本若为直抗阳性需区别直抗类型，即用单特异性IgG抗体、C3d抗体重复上述操作以鉴别致敏在细胞上免疫分子种类。4.Rh新生儿溶血病的直抗结果都相对强，一般≧2+。而ABO新生儿溶血病的直抗呈弱阳性甚至阴性。因此新生儿直抗强弱是区别ABO和Rh-HDN的主要标志。血浆游离抗体试验原理

用新生儿血清加上A、B型红细胞悬液，做酶法及间接抗人球蛋白试验，并以此试验来验证新生儿血清中是否存在与其红细胞不配合的IgG抗A或抗B，这些来自于母亲的IgG抗体可与新生儿红细胞结合，婴儿可能受害，引起新生儿溶血病。血浆游离抗体试验操作（试管法）1取静脉血3~5ml,离心分离血清备用。2取3支试管，分别标记Ac、Bc、Oc管。3于每支试管中各加入待检血清2滴，在相应标记管中分别加入5%A、B、O型试剂红细胞悬液各1滴，混匀，37℃致敏30min4以1000g离心15s，肉眼或显微镜观察凝集结果并记录。若某管出现凝集，说明该管有相应盐水抗体，不必继续操作5若无凝集，用生理盐水洗涤3次后，加入多特异抗球蛋白1滴，以3400r/min离心15s，肉眼及显微镜下观察凝集结果血浆游离抗体试验操作（微柱凝胶法）A取静脉血3~5ml,离心分离血清备用。B取Coombs凝胶卡一张，用笔在相邻3孔下面标记Ac、Bc、OcC于每孔中加50ul待检血清，在相应标记孔加入Ac、Bc、Oc试剂红细胞，阴性及阳性对照红细胞各50ulD将加样完毕的Coombs卡放入微柱凝胶卡孵育器内，37℃孵育15minE将孵育好的Coombs微柱凝胶卡放入微柱凝胶离心机内1000r/min离心10min,取出Coombs微柱凝胶卡，观察并记录结果。血浆游离抗体试验检测意义指示红细胞

意义AcBcOc+---+-++-+/-+/-+---

游离的抗-A游离的抗-B游离的抗-A、抗-B或者抗-AB游离的ABO系统以外抗体无游离抗体血浆游离抗体试验质量控制1.微柱凝胶卡式法检测血清游离抗体时应根据说明书配制红细胞悬液浓度。2.游离试验阳性常发生在新生儿溶血病早期或病情严重时，应在出生后3-7天内进行检查，避免致敏红细胞被破坏导致假阴性结果。但游离试验阴性并不说明病情较轻，该试验在新生儿溶血病检测中仅起到辅助诊断作用。3.游离抗体阳性必须是可以检测到能与患儿红细胞起反应的抗体，不依据患儿血型则无法准确判断该实验结果红细胞抗体放散试验放散实验红细胞上的抗原与血清中的抗体在适当条件下能发生凝集或致敏，这种反应是可逆的，如果改变某些条件，抗体又可以从结合的细胞上放散下来，再用相应红细胞鉴定放散液内抗体的种类，从而进行新生儿溶血病的诊断。常用方法热放散法冷放散法乙醚放散法红细胞抗体放散试验热放散试验

结合在红细胞上的抗体可以用加热的方式进行分离，然后再进行抗体种类鉴定。用生理盐水洗涤待检红细胞，将离心后形成的压积红细胞放入56℃水浴中振摇一定时间后，再高速离心后取上清液（放散液）与已知红细胞反应看是否凝集来鉴定放散液中抗体种类。热放散试验1将受检者红细胞用生理盐水洗涤3次，以3000r/min离心5min,弃去上清液。在压积红细胞中加入等量生理盐水，混匀。2将试管置于56℃水浴振荡箱不断振摇10min，取出试管，立即以900g-1000g离心2min。3分离上清液置于另一试管中即为放散液4取3支洁净试管，分别标明Ac、Bc、Oc管，各管加入放散液2滴，然后按标记各管加入相应（A、B、O）2%-5%酶处理红细胞一滴，混匀，37℃水浴30min5孵育后用生理盐水洗涤3次，弃上清液，各管加入多特异性抗人球蛋白试剂2滴，以1000g离心15s，肉眼观察结果热放散试验热放散试验质量控制1.56℃温度要准确，在加热时要不断振荡试管，使抗体从红细胞上完全分离下来。温度过高，抗原抗体变性；温度过低，已被放散下来的抗体会重新与红细胞结合，因此在离心时要使用经过预热的离心杯。2.制备得到的放散液应立即进行鉴定，否则放散液中的抗体容易变性。如果需要保存，应在放散液中加入AB型血清或牛血清蛋白。3.最后一次洗涤液中应检查是否有残存抗体，如果最后一次洗涤液中检出了残存抗体，说明洗涤不充分，会影响放散效果。乙醚放散试验

乙醚是种较强的有机溶剂，与红细胞结合后破坏溶解红细胞，使结合抗体解离下来，再用标准谱红细胞测定放散液中抗体特异性。可检测吸附于红细胞上的各种IgG抗体乙醚放散试验操作将受检者红细胞用生理盐水洗涤3次,以3000r/min离心5min,弃上清液。在压积红细胞中加入等体积的生理盐水和2倍体积的乙醚，用塞子塞紧试管口，充分混匀振摇10minA1000g离心5min，轻轻取出试管，离心后液体分为三层，上层为乙醚层，中间层为红细胞层，下层为放散液层B将下层深红色的放散液移至另一试管中，置于37℃孵育30min，除尽乙醚C取另一支试管，加入放散液2滴，再加标准谱红细胞悬液1滴，37℃孵育30min，充分洗涤后，弃上清液，加入多特异抗人球蛋白血清1滴D1000g离心15s，轻轻取出试管，轻弹试管，肉眼观察凝集和溶血情况，必要时在显微镜下观察，记录凝集情况E乙醚放散试验质量控制1.操作过程中应注意安全，乙醚为危险化学试剂，防止放散液溢出。2.与所有标准谱红细胞均发生凝集可能由于自身抗体所致。因此，用标准谱红细胞鉴定放散液中抗体时应同时做自身对照试验。冷放散试验

红细胞冰冻导致细胞破碎，膜上结合抗体解离，用标准谱红细胞鉴定放散液中抗体性质。冷放散试验操作01将受检者红细胞用生理盐水洗涤3次，以3000r/min离心5min，弃上清液，保留压积红细胞。03将试管放置平稳，置-70℃~-20℃低温冷冻柜中快速冷冻10min.051000g离心5min,立即将上清液移至另一已标记的试管中，即放散液待用02标记试管，取0.5ml压积红细胞，加0.15ml生理盐水，混匀。塞住试管口，转动试管，使细胞悬液在试管内壁形成薄层04取出试管，立即用流动温水冲洗试管外壁，使红细胞快速融化。06取洁净试管3支，分别标明Ac、Bc、Oc管，各管加入放散液2滴，然后按标记各管加入相应的2%-5%标准A、B、O红细胞悬液1滴，混匀，置37℃水浴箱孵育30min07孵育后用生理盐水洗涤3次，弃上清液，各管加多特异抗人球蛋白试剂2滴，以1000g离心15s，肉眼观察结果冷放散试验质量控制1.操作中充分冰冻，获得更多的放散液2.放散液平均分配在试管中，保证观察结果准确。红细胞抗体放散试验方法学评价

ABO血型不合的HDN采用热放散法，由于Rh血型抗体与红细胞结合能力较强，热放散效果不佳

Rh血型及其他血型系统HDN通常采用乙醚放散法，乙醚放散试验所用致敏红细胞浓度高，所以在“三项试验”中该试验敏感度最高新生儿血清学“三项试验”临床应用新生儿溶血“三项试验”直接抗人球蛋白试验检查新生儿红细胞是否已被母亲不完全抗体致敏游离抗体试验检测新生儿血清中是否有游离的IgG血型抗体放散试验检查新生儿致敏红细胞上释放到放散液的抗体共同辅助诊断HDN并对制定治疗方案提供实验室依据新生儿血清学“三项试验”

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血型的血清学检查病例分析病例资料：患儿母亲，28岁，平时体健，孕1产1.患儿，女，孕39周，自然分娩，体重2.8kg，出生后3天全身及巩膜出现黄染，逐渐加重，延及躯干、四肢及手足心，无哭声尖直，无四肢抽搐。发病以来精神欠佳，无发热，已开奶，无吐奶、呛奶，已排胎便，小便量可，色黄，染尿布。问题：1.患儿诊断什么疾病？2.造成这种疾病的原因可能有？3.有哪些实验室方法可以早期预防并监测这种疾病？血型鉴定

血型鉴定包括夫妻双方的ABO血型系统和Rh血型系统，以确定夫妻血型是否配合。有条件允许可做胎儿羊水ABO血型物质检查，可进一步排除ABO血型不合的HDN。若母亲与胎儿血型相同或不同但是胎儿为O型都可以排除ABO血型不合的溶血，但不能排除其他血型系统的溶血的可能。夫妻ABO、Rh血型相合的判断如下表血型鉴定妻子血型丈夫配合血型丈夫不配合血型OOA、B、ABAO、AB、ABBO、BA、ABABO、A、B、AB/RhD阳性RhD阳性、RhD阴性/RhD阴性RhD阴性RhD+母亲血清Ig抗体效价测定IgG抗A/抗B效价测定

当母亲血清中IgG抗A/抗B效价≧1：64时，提示血型不合，胎儿有可能发生溶血。所以检测母亲血清中有无IgG性质的抗体并测定其效价，即可预计ABO-HDN发生的可能性。为什么要做抗体效价测定？母亲血清Ig抗体效价测定原理

血清以2-巯基乙醇或二硫苏糖醇处理后，IgM抗体分子裂解为6~7s亚单位。此种亚单位虽然仍有与抗原结合能力，但已失去与其相应红细胞凝集作用。IgG抗体分子则不被2-Me或DDT灭活，保持与相应红细胞致敏的血清学特性，所以通过2-Me或DDT处理血清后，可达到检测血清中IgG抗体的目的.母亲血清Ig抗体效价测定器材母亲血清Ig抗体效价测定试剂母亲血清Ig抗体效价测定操作方法抗人球蛋白法微柱凝胶介质法基础延伸母亲血清Ig抗体效价测定抗人球蛋白法1破坏IgM抗体:取受检者血清0.2ml，加2-Me或DTT应用液0.2ml,混合，使用封口膜将试管口封住，室温放置30min或水浴10min.2编号：排列小试管两排，每排10支编号，每排从第2管开始加生理盐水0.2ml.3倍比稀释：第1管加处理后血清0.4ml,取出0.2ml移至第2管内，混合，再从第2管吸出0.2ml移至第3管内，混匀，以此类推，做倍比稀释至第10管，最后一管混匀后吸出0.2ml丢弃。上述1-10管稀释浓度分别为：1:2、1:4、···1:1024。4加悬红：第1排每管各加2%-5%A型红悬0.2ml,第2排每管各加2%-5%B型红悬0.2ml,37℃水浴箱温育30min,观察有无凝集。母亲血清Ig抗体效价测定抗人球蛋白法5678洗涤：若无凝集，将红细胞用PBS洗涤3次，弃去最后一次上清液。每管各加2滴PBS，充分混匀。加抗人球蛋白：每管再加入最适稀释度的抗人球蛋白试剂1滴，混合。离心：3400r/min离心15s，轻轻摇动试管，观察结果判断结果：用显微镜判断凝集强度，1＋以上红细胞凝集为阳性，以1＋以上红细胞凝集的最高稀释度倒数为IgG抗A/抗B效价母亲血清Ig抗体效价测定结果判断标准：4+：红细胞凝集成结实大凝块，背景清晰透明，无游离红细胞。3+：红细胞凝集成数个凝块，背景尚清晰，极少游离红细胞。2+：红细胞凝块分散成许多中小凝块，背景稍浑浊，周围可见到游离红细胞1+：肉眼可见大颗粒，背景浑浊，镜下许多凝集，有较多游离红细胞—：红细胞呈均匀悬液，镜下未见红细胞凝集，红细胞分布均匀。母亲血清Ig抗体效价测定质量控制1.稀释操作时要准备，避免稀释不均，出现“跳管”现象。2.2-Me或DTT应用液未用完的放回4℃冰箱保存。3.IgG抗A（B）效价测定，第1管的血清已经使用等体积的2-Me或DTT应用液破坏，故已经稀释一倍，所以起始效价为2。4.注意操作时间控制，因为2-Me破坏IgM是可逆的,一旦2-Me挥发过多，则IgM会重新形成。母亲血清Ig抗体效价测定微柱凝胶介质法破坏IgM抗体:取受检者血清0.2ml，加2-Me或DTT应用液0.2ml,混合，使用封口膜将试管口封住，室温放置30min或水浴10min.编号：排列小试管两排，每排10支编号，每排从第2管开始加生理盐水0.2ml.倍比稀释：第1管加处理后血清0.4ml,取出0.2ml移至第2管内，混合，再从第2管吸出0.2ml移至第3管内，混匀，以此类推，做倍比稀释至第10管，最后一管混匀后吸出0.2ml丢弃。上述1-10管稀释浓度分别为：1:2、1:4、···1:1024。标记微柱凝胶卡：取Coombs微柱凝胶卡,标记被检者的姓名、性别、年龄及编号，同时标明A1-A10孔和B1-B10孔。1234母亲血清Ig抗体效价测定微柱凝胶介质法加悬红：在A1-A10和B1-B10孔中加入50ul不同稀释度血清。然后各孔对应分别加入50ul2%-5%A、B型标准红细胞悬液56孵育：将加好的凝胶卡置于微柱凝胶孵育器内，37℃孵育15min.7离心：将孵育好的凝胶卡置于微柱凝胶离心机内，1000r/min离心10分钟。8观察结果：红细胞抗原与相应抗体在微柱凝胶中形成的特异性抗原抗体复合物悬浮在凝胶表面或凝胶中为阳性：沉于凝胶的尖底部为阴性反应，以出现1+阳性反应的最高稀释度倒数为IgG抗A或抗B效价。母亲血清Ig抗体效价测定母亲血清Ig抗体效价测定结果判断标准：4+：红细胞复合物（凝集）位于凝胶表面。3+：大部分红细胞复合物位于凝胶表面，少部分位于凝胶中上部2+：大部分红细胞复合物位于凝胶中部，少部分位于凝胶中上部1+：红细胞复合物位于凝胶中下部。—：红细胞完全沉积在凝胶管尖底部。母亲血清Ig抗体效价测定质量控制1.微柱凝胶卡必须保存在室温中，使用前应检查微柱凝胶卡是否胶质均匀、胶面整齐、有无气泡。2.红细胞标本避免受细菌污染，否则易出现假阳性。3.在微柱凝胶卡中出现溶血现象，提示为红细胞抗原-抗体反应，但也不排除其他原因所致溶血，需作认真分析。母亲血清Ig抗体效价测定方法学评价优点缺点抗人球蛋白法成本低操作繁琐，不能保存，不利于复查微柱凝胶介质法灵敏度、可靠性较高，结果直观准确，可以长时间保存易受干扰，需专用设备，检测成本高金无足赤人无完人母亲血清Ig抗体效价测定Rh血型不规则抗体及效价测定留取标本排除IgM不规则抗体筛查不规则抗体鉴定抗体效价测定可能无不规则抗体孕妇3~5ml血清、夫妇双方抗凝血3-5ml盐水介质法抗人球蛋白法－＋确定特异性是否继续做不规则抗体鉴定依据筛查时实验方法灵敏度母亲血清Ig抗体效价测定操作步骤红细胞悬液配制：筛选红细胞、丈夫红细胞及母体红细胞用生理盐水洗涤3次，配制5%红细胞悬液A在标记的所有试管中分别加母亲血清1滴。分别加5%筛选红细胞悬液、丈夫及母亲红细胞悬液各1滴B1000g离心15s，观察结果。C若有凝集，取母体血清0.2ml,加2-Me或DTT应用液0.2ml，混合，使用封口膜将试管口封住，室温放置30min或孵育10min.处理后血清重复以上步骤后继续进行下一步。D若无凝集，则将试管