生物学案：第三章第二节制备和应用固定化酶

学必求其心得，业必贵于专精学必求其心得，业必贵于专精学必求其心得，业必贵于专精第二节制备和应用固定化酶学习目标重点难点1。能记住固定化酶的概念.2．能说出常见几种制备固定化酶的方法.3．能记住固定化细胞技术的概念。4．能说出常见细胞固定化的方法。重点：能分析比较常见几种固定化酶的方法的优点及缺点。难点：1．制备固定化酵母菌细胞的流程。2．说出固定化细胞及酶在实际中的应用。一、固定化酶技术的应用1．固定化酶固定化酶是指用______或______的方法将酶与__________结合在一起形成的仍具有________的酶复合物。在催化反应中,它以固相状态作用于底物，反应完成后,容易与水溶性反应物和产物分离，可被__________。预习交流1．直接使用的酶能反复利用吗？2．任何一项新技术有利，也必有弊。固定化酶是将酶固定在不溶于水的载体上的一项新技术，由该特点你是否想到了固定化酶的不足？能否结合过氧化氢酶对过氧化氢的分解实验对固定化酶的不足之处进行解释说明?2．制备固定化酶的方法项目吸附法交联法包埋法方法利用物理吸附、离子键作用利用多功能试剂进行酶与载体之间交联包埋在固化的载体中载体________、________、__________、离子交换树脂等戊二醛凝胶方式____________________—包埋成格子型微胶囊型预习交流在固定化酶的三种方法中，酶不适合哪种方法?二、固定化细胞技术的应用1．固定化细胞技术通过各种方法将______与一定的载体结合，使其仍保持原有的__________，这一过程称为____________。2．细胞固定化的方法细胞固定化的方法也有多种，主要有________和________两大类。________是制备固定化动物细胞的主要方法,此法也可制备固定化植物细胞,它既可将植物细胞吸附在__________的大孔隙或裂缝之中,也可将植物细胞吸附在__________的外壁上。包埋法是指将细胞包埋在______________中，其中，__________是应用最广泛的细胞固定化方法，它所使用的载体主要有________、__________和______等.固定化细胞技术有许多优点,可以取代____________进行发酵，生产各种物质。预习交流1．固定化细胞的实质是固定酶,那么是胞内酶还是胞外酶呢?2．固定化细胞技术固定的是活细胞还是死细胞？答案：一、1.物理化学固相载体酶活性反复利用预习交流：1．提示:不能,混在产物里难以回收利用.2．提示：将酶固定在不溶于水的载体上,限制了酶分子与底物分子（或离子)的接触，减少了酶与底物的接触面积，降低了化学反应的速度。例如，用肝脏研磨液（内含过氧化氢酶)分解过氧化氢就比用成块的鲜肝分解过氧化氢的速度快,因为成块的鲜肝过氧化氢酶大部分存在于肝细胞内，与过氧化氢的接触面积小,不利于过氧化氢的分解,而肝脏研磨液将过氧化氢酶从肝细胞内释放出来，增加了过氧化氢酶与过氧化氢分子的接触面积，使反应更容易进行。2．纤维素琼脂糖多孔玻璃物理吸附、离子结合法、共价键结合预习交流:提示：酶不适合用包埋法,因为酶分子太小容易从材料中漏掉。二、1.细胞生物活性细胞固定化2．吸附法包埋法吸附法泡沫塑料中空纤维能固化的载体凝胶包埋法琼脂糖海藻酸钠明胶游离的细胞预习交流：1．提示:胞外酶。2．提示：活细胞。在预习中还有哪些问题需要你在听课时加以关注？请在下列表格中做个备忘吧！我的学困点我的学疑点一、固定化酶技术的应用1．固定化酶的概念指用______________的方法将酶与__________结合在一起形成的仍具有酶活性的酶复合物。2．固定化酶的方法（1）填写下列固定化酶的方法A________B________C1__________C2__________(2）吸附法是把酶固定在________、________、__________等载体上。（3）交联法最常用的交联剂是________.（4）包埋法最常用的载体是______。(5）这三种方法中包埋法适合较大的酶分子还是较小的？原因是什么？3．固定化酶是否可以永远地利用下去?下列关于固定化酶的说法中，错误的是（）.A．固定化酶的活力也受强酸、高温等因素的影响B．酶固定化后会使酶的利用率提高C．利用固定化酶可降低生产成本D．反应结束后，固定化酶与产物混合成为杂质1．酶的共性及固定化酶的优点（1)酶：起催化作用,绝大多数是蛋白质。（2）酶的活力在受高温、强酸、强碱和重金属离子等外界条件影响下变性失活。（3）普通酶促反应的缺陷：①一次性使用难回收，增加生产成本，难以连续化生产.②反应结束后，杂质与产物混合在一起，不利于产物进一步纯化。（4)固定化酶的优点：①可以使反应过程管道化、自动化，产物易从反应液中回收；②酶的稳定性有所改进；③酶的使用效率提高。2．固定化酶的应用实例—-生产高果糖浆（1）高果糖浆高果糖浆是指果糖含量为42%左右的糖浆。（2）固定化酶反应的过程将葡萄糖异构酶固定在颗粒状载体上↓放入底部有许多小孔的反应柱（酶颗粒不能通过，反应液能通过)↓葡萄糖溶液从反应柱的上端注入↓流经反应柱↓与固定化葡萄糖异构酶接触，转化成果糖↓果糖从反应柱的下端流出二、固定化细胞技术的应用1．固定化细胞的概念：通过各种方法将细胞与一定的______结合，使细胞仍保持原有的__________,这一过程称为细胞的固定化。2．阅读教材P54内容，填写表格内容。细胞固定化的方法方法________；________优点①________________________②________________________缺点①__________________________②____________________③____________________下列关于固定化细胞技术的说法中,正确的是()。A．吸附法的优点是操作简单、吸附牢固B．包埋法的优点是操作复杂、条件温和、对细胞无毒性C．吸附法容易对酶活性产生影响D．凝胶包埋法常用的凝胶种类有琼脂、海藻酸钠凝胶、角叉菜胶和明胶等在固定化细胞技术中，载体的主要作用是固定细胞,不让细胞溶于产物中，要保证酶和底物尽可能多地接触，所以多孔。当然，也要考虑固定的材料尽可能对酶的催化不产生影响或产生的影响最小。固定化细胞在催化化学反应的同时，自身获得了物质和能量，因此，不需额外提供营养物质。三、制备固定化酵母菌细胞1．写出制备固定化酵母菌细胞的流程（阅读教材P54“酵母菌细胞的固定化技术”）制备________→______________→__________________→________洗涤→____________2．制备固定化酵母菌细胞中麦芽汁的作用是什么?3．制备固定化酵母菌细胞中活化的目的是什么?4．将海藻酸钠冷却的目的是什么?5．饱和硼酸-氯化钙溶液的作用是什么？6．将注射器中的溶液如何放入CaCl2溶液中?7．此实验成功的关键是什么?8．浓度高低对结果有何影响?9．配制海藻酸钠时小火加热并不断搅拌的目的是什么?10．发酵过程中锥形瓶为什么要密封？11．当观察到哪些现象时，可以说明实验获得成功?下列有关固定化酵母细胞制备步骤，正确的是（）。A．应使干酵母与自来水混合并搅拌，以利于酵母菌活化B．配制海藻酸钠溶液时要用小火或间断加热的方法C．向刚溶化好的海藻酸钠溶液中加入已活化的酵母菌细胞，充分搅拌并混合均匀D．将与酵母菌细胞混匀的海藻酸钠溶液注入CaCl2溶液中，会观察到CaCl2溶液中有球形或椭球形的凝胶珠形成制备固定化酵母菌细胞的注意事项（1）酵母菌细胞的活化：在缺水的状态下，微生物会处于休眠状态.活化就是让处于休眠状态的微生物重新恢复正常的生活状态.酵母菌细胞所需要的活化时间较短,一般需要1h左右，要提前作好准备。此外，酵母菌细胞活化时体积会变大，因此活化前应该选择体积足够大的容器,以避免酵母菌细胞的活化液溢出容器。（2)加热：加热使海藻酸钠溶化是操作中最重要的一环，影响到实验的成败。海藻酸钠的浓度影响固定化细胞的质量。如果海藻酸钠浓度过高，将很难形成凝胶珠；如果浓度过低，形成的凝胶珠所包埋的酵母菌细胞的数目少，影响实验效果。（3)凝胶珠的检测：刚形成的凝胶珠应在CaCl2溶液中浸泡一段时间,以便形成稳定的结构。检验凝胶珠的质量是否合格可以使用下列方法：一是用镊子夹起一个凝胶珠放在实验桌上用手挤压，如果凝胶珠不容易破裂，没有液体流出，就表明凝胶珠的制作成功。二是在实验桌上用力摔打凝胶珠，如果凝胶珠很容易弹起,也能表明制备的凝胶珠是成功的.（4)观察凝胶珠的颜色和形状.如果制作的凝胶珠颜色过浅、呈白色，说明海藻酸钠的浓度偏低,固定的酵母菌细胞数目较少;如果形成的凝胶珠不是圆形或椭圆形，则说明海藻酸钠的浓度偏高，制作失败，需要再作尝试。四、直接使用酶、固定化酶、固定化细胞的比较填写表格内容。直接使用酶固定化酶固定化细胞酶的种类____________________________常用载体-高岭土、皂土、硅胶、凝胶明胶、琼脂糖、海藻酸钠、醋酸纤维素、聚丙烯酰胺制作方法—____________、________________________是否需要营养物质____________催化反应__________________________反应底物各种物质（大分子、小分子）各种物质（大分子、小分子）小分子物质缺点①对环境条件非常敏感,易失活②难回收，成本高，影响产品质量________________反应物不易与酶接近，尤其是大分子物质，反应效率下降优点__________________________________________________________________________________下列关于固定化酶和固定化细胞的叙述,正确的是（)。A．固定化细胞技术在多步连续催化反应方面优势明显B．固定化酶的应用中，要控制好pH、温度和溶解氧C．利用固定化酶降解水体中有机磷农药，需提供适宜的营养条件D．利用固定化酵母菌细胞进行发酵,糖类的作用只是作为反应底物一般来说，酶更适合采用化学结合法和物理吸附法固定，而细胞多采用包埋法固定。这是因为细胞体积大，而酶分子很小；体积大的细胞难以被吸附或结合,而体积小的酶容易从包埋材料中漏出。答案：活动与探究一：1．物理学或化学固相载体2．（1）吸附法交联法凝胶包埋法微胶囊法（2）纤维素琼脂糖多孔玻璃（3)戊二醛(4）凝胶(5)提示：较大的酶分子；较小的容易从包埋材料中漏出。3．提示:不能.酶是生物催化剂，其活性受环境影响较大,随着时间推移活性降低，一般一个反应柱可以连续使用半年。迁移与应用：D解析：固定化酶容易与产品分离，有利于产物的纯化；能反复使用提高了酶的利用率，因此可降低成本；固定化酶本质是蛋白质，活力也受强酸、高温等因素的影响.活动与探究二:1．载体生物活性2．吸附法包埋法不用破碎细胞提取酶，又能充分利用细胞内的酶保留细胞内多酶系统,能催化多步连续反应只能用于生产胞外酶和分泌到细胞外的产物营养物质和产物的扩散受载体限制溶解氧的传递和输送限制好氧性发酵迁移与应用:D解析:细胞固定化的方法主要有吸附法和包埋法.它们各有利弊,吸附法的主要优点是酶活性不受影响，但吸附过程相当复杂，这一过程与细胞的性质、载体的性质以及两者之间的相互作用等有关，吸附力较弱且吸附不牢固，细胞容易脱落。包埋法操作简单，条件温和，对细胞无毒性，适合于生长细胞的固定化。活动与探究三：1．麦芽汁活化酵母菌细胞制备固定化细胞无菌水发酵麦芽汁2．提示：为酵母细胞提供营养物质。3．提示：使酵母细胞从休眠状态恢复到正常状态。4．提示：防止将酵母菌细胞冻死。5．提示：使胶体聚沉，形成凝胶珠。6．提示：以恒定的速度滴加。7．提示：海藻酸钠溶液的浓度.8．提示：浓度高会很难形成凝胶珠，浓度低包埋数目过少。9．提示：防止海藻酸钠焦糊.10．提示：酵母菌的酒精发酵需要无氧条件.11．提示:利用固定的酵母菌细胞发酵产生酒精，可以看到产生了很多气泡，同时会闻到酒味。迁移与应用：B解析：由于在缺水状态下，微生物处于休眠状态,为了加速酵母菌细胞的活化，将干酵母与蒸馏水混合后用玻璃棒充分搅拌。为避免海藻酸钠发生焦糊，溶化时要用小火或间断加热.如果将刚溶化好的海藻酸钠与已活化的酵母菌细胞混合，有可能会杀死酵母菌细胞.将与酵母菌细胞混匀的海藻酸钠用注射器缓慢滴加到CaCl2溶液中，而不是注入。活动与探究四:一种或几种一种一系列酶化学结合法固定化物理吸附法固定化包埋法固定化否否是单一或多种单一一系列不利于催化一系列酶促反应催化效率高、耗能低、低污染①既能与反应物接触，又能与产物分离②可以反复利用成本低、操作容易迁移与应用：A解析:A项中，固定化细胞技术由于保留了细胞内原有的多酶系统,连续催化反应的优势非常明显。B项中，固定化酶的应用中,不需控制溶解氧；C项中，不需各种营养条件；D项中,糖类的作用不只是作为反应底物，还能维持酵母菌细胞的渗透压，防止酵母菌细胞过多地吸水或失水.1．若用固定化酵母菌细胞发酵葡萄糖溶液时发现无酒精产生，原因不可能是（）。A．实验瓶盖了塞子B．瓶内氧气充足，进行了有氧呼吸C．固定化酵母菌细胞内可能没有酵母菌细胞D．所谓的葡萄糖溶液可能是其他物质2．下列叙述正确的是（)。A．一种固定化酶能催化一系列的化学反应B．固定化细胞能产生一系列酶C．酵母菌细胞活化就是使酵母菌细胞由无氧呼吸变成有氧呼吸D．固定化酶更适合大分子反应物3．在制备固定化酵母菌细胞的实验中,CaCl2溶液的作用是（)。A．用于调节溶液pH B．用于进行离子交换C．用于胶体聚沉 D．用于为酵母菌提供Ca2＋4．固定化细胞常用包埋法固定化，原因是（).A．包埋法固定化操作最简便 B．包埋法对酶活性的影响最小C．包埋法固定化