生物学基本技能 教案 Ⅷ 生物玻片标本的制作

基本技能Ⅷ生物玻片标本的制作一、目标与任务本次教学主题基本技能Ⅷ生物玻片标本的制作学时授课班级授课日期授课地点主讲教师实验目的1.了解生物玻片标本的类别。2.掌握徒手切片和石蜡切片技术。3.掌握涂片、装片标本制作技术技能分解生物玻片标本的类别载玻片和盖玻片装片标本的制作涂片标本的制作压片标本的制作滴片标本的制作切片标本的制作实验操作实训思政元素树立正确科学的世界观、人生观、价值观；具有科学精神；拥有怜悯之心，具有真善美的眼光教学方法讲授法、演示法、讨论法、案例分析法、课堂观摩法、实训法教学媒体教材、课件、教案、多媒体、投影仪二、教学进度教学过程教学内容教学活动教学时间（分钟）教师活动学生活动理论知识讲授一、生物玻片标本的类别生物玻片标本是生物标本的一个类别，其他类别的生物标本多是观察动植物的整体或部分结构形态，是从宏观上观察研究生物，生物玻片标本则是观察研究生物的某些组织、细胞、细胞器、染色体等，一些个体非常小的生物，也有整体做成玻片标本的，如果蝇、一些微生物等。根据不同的制作方法，生物玻片标本分为装片标本、涂片标本、压片标本、滴片标本、切片标本五大类。·装片标本装片标本是指从生物体上取下来的组织块或直接用个体微小的生物体制成的玻片标本。适于对个体较小的动物、动植物较小组织块的观察研究，如植物表皮细胞装片，人体口腔上皮细胞装片，昆虫的翅、足、口器装片，果蝇的成体、蛹、幼虫、卵装片，微小生物如衣藻、水绵、变形虫、线虫、水螅装片，细菌装片，红色面包霉装片等。·涂片标本涂片标本是指从生物体上采集的液体（如血液、骨髓液）均匀地涂抹于载玻片上制成的玻片标本。适于对细胞计数、形态观察等方面的研究，如人类血液涂片、人类骨髓液涂片等；适于制作涂片标本的材料有单细胞生物、小型藻类、血液、骨髓液、细菌培养液、动植物的疏松组织、精巢、花药等。·压片标本压片标本是指将生物材料置于载玻片和盖玻片之间，施加一定压力，将组织细胞压散或将细胞压破制成的玻片标本。适于制作压片标本的材料有经过软化处理的植物组织和细胞、植物的生殖细胞、动物的组织和细胞、昆虫的唾液腺细胞和性腺细胞等。·滴片标本滴片标本是指把动植物的组织或血液进行处理，制成细胞悬液，滴在载玻片上制成的玻片标本。适于对细胞中染色体的观察研究。例如，洋葱的染色体玻片标本、人类外周血染色体玻片标本、小白鼠骨髓细胞染色体玻片标本等。·切片标本切片标本是指徒手或用切片机直接从生物体上切取的动植物组织薄片制成的玻片标本。适于对某一组织的结构特征、细胞形态的观察，如植物叶脉切片、植物根尖切片、动物血管切片等。因要求不同，可用刀片进行徒手切片；也可将组织块包埋于石蜡中用切片机进行石蜡切片，切成5～10μm的薄片，供光学显微镜观察；还可将组织块包埋于环氧树脂或甲基丙烯酸中用冰冻切片机进行冰冻切片，切成厚度在20～50nm的超薄切片，专供在电子显微镜下观察。二、载玻片和盖玻片（一）载玻片载玻片是制作生物玻片标本最基本的玻璃器皿。载玻片是用来放置显微观察材料的一种玻璃片或石英片。载玻片一般长7～8cm、宽2.5～3cm，标准厚度为1.1±0.04mm，可用范围最大可达11.2mm，太厚会影响聚光器效能，太薄则容易碎裂。按其平面上是否有凹陷，分为平面载玻片和凹陷载玻片。根据载玻片四周的光滑度，分为毛边载玻片和磨砂边载玻片。按能否直接在载玻片上写字，分为普通载玻片和记号载玻片。按用途，分为显微载玻片和细胞培养载玻片。（二）盖玻片盖玻片是覆盖在载玻片上的观察材料之上的一种更小、更薄的玻璃片。盖玻片起到进一步把材料固定、压薄、使材料不能接触到显微镜的物镜的作用。盖玻片一般为正方形，个别也有长方形、圆形。三、装片标本的制作（一）植物装片标本的制作（1）擦拭。用洁净的细软纱布或擦镜纸把载玻片和盖玻片擦拭干净。（2）滴加。把载玻片放在试验台上，用滴管在载玻片的中央滴一滴清水。（3）撕取。用镊子从洋葱鳞片叶内侧撕取内表皮一小块（面积如玉米粒般大小），把其浸入载玻片上的水滴中，用镊子轻轻展平。（4）加盖。用镊子夹起盖玻片，使它的一边先接触载玻片上的水滴，然后缓缓放下，盖在要观察的材料上。（5）染色。滴一滴碘液在盖玻片的左侧，用吸水纸从盖玻片的右侧吸引，使染液浸润全部材料。（6）观察。在显微镜下观察细胞的形状和细胞排列的情况。（二）动物装片标本的制作（1）固定。把果蝇成虫放入卡诺固定液中，进行杀生和固定。（2）保存。把杀死且固定好的果蝇放入70%乙醇中进行短期保存或长期保存。（3）擦拭。用洁净的细软纱布或擦镜纸把载玻片和盖玻片擦拭干净。（4）放置。用毛笔选取一只结构完整的果蝇，慢慢放置到载玻片的中间位置。（5）舒展。用解剖针轻轻拨动，使果蝇背部向上，前、中、后足和翅膀以及触角展开，呈现一种自然站在载玻片上的状态。（6）滴胶。用特制的滴胶棒，往果蝇身体上滴加配置好的加拿大树胶2～3滴。（7）加盖。加上一个直径较小的圆形盖玻片，让盖玻片自然下垂。注意要让加拿大树胶填满整块盖玻片与载玻片的空间。（8）干燥。25℃或室温条件下，平放8～10天。（9）观察。在低倍镜或高倍镜下观察果蝇的复眼结构、腹部横纹、生殖器等。雄果蝇还要观察前足上的性梳。（三）微生物装片标本的制作（1）培养。培养真菌：将一个馒头加适量的水，用塑料袋把馒头包好，将包好的馒头放置在温度较高的地方2～3天，即可得到生长良好的真菌。（2）擦拭。用洁净的细软纱布或擦镜纸把载玻片和盖玻片擦拭干净。（3）滴加。把载玻片放在实验台上，用滴管在载玻片的中央滴一滴清水。（4）挑取。用解剖针在馒头上挑一点真菌，放置在载玻片上的清水中，并用解剖针轻轻将真菌分散开。（5）加盖。盖上盖玻片，用镊子夹住盖玻片，将盖玻片的一侧与载玻片上的水相切呈45°的夹角，并慢慢放下盖玻片使装片里面没有气泡。（6）敲击。用镊子或用火柴棒轻轻在盖玻片上敲击，使真菌均匀分布。（7）清理。清理装片上多余的水。将吸水纸覆在盖玻片上，让其自然吸干装片上的水。（8）观察。在显微镜下观察真菌的形状和特征。四、涂片标本的制作（一）植物涂片标本的制作（1）培养。按常规方法培养洋葱，使其生根，当根尖生长至1cm时用0.2%秋水仙素溶液再培养3～4h。（2）固定。用剪刀剪取根尖，放入卡诺固定液中3～5h，进行杀生和固定。（3）保存。固定好的材料存放于70%乙醇中。（4）处理。用2.5%的纤维素酶和果胶酶处理40～50min，直至材料像豆腐一样松软。（5）涂布。切取2~3个根尖的分生区，用镊子将材料捣碎并反复在载玻片中央位置涂抹，然后去掉多余的残渣。6）干燥。在材料上滴加几滴固定液，并快速用火柴把有材料处点燃，至火焰自动熄灭即可。（7）染色。用醋酸洋红或碱性品红染液染色5～10min。（8）冲洗。自来水缓缓冲洗几遍，把多余的染液去除。（9）观察。适当晾干后，进行观察，从低倍镜到高倍镜，最后用油镜观察洋葱的染色体。（二）动物涂片标本的制作（1）滴加。左手拇指和食指平持一张载玻片，将采到的血滴滴到载玻片一端。（2）涂布。右手持一张载玻片作为推片，呈30°～45°角于血滴前方靠近血滴。右手移动盖玻片使其一端与血液接触。将盖玻片往前推动，速度不能太慢，保证血液被均匀地涂布开。（3）风干。做好的血涂片，在室温下放置几分钟，使其慢慢风干。（4）染色。在涂布有血细胞的载玻片上滴加瑞氏染液A，染色1min，再滴加瑞氏染液B（B液为A液的3倍），染色3～10min。滴加B液后，用嘴或洗耳球轻轻吹动染液，促使两种染液混合。（5）水洗。用流动较慢的流水慢慢冲洗载玻片，冲洗掉多余染液和一些沉渣。（6）干燥。室温下放置几分钟，自然干燥。（7）观察。在显微镜下进行观察，从低倍镜开始观察，逐次转换为高倍镜甚至油镜观察。（三）细菌涂片标本的制作（1）培养。将细菌放在合适的培养基和合适的温度条件下进行培养，使细菌大量繁殖。（2）擦拭。用洁净的细软纱布或擦镜纸把载玻片和盖玻片擦拭干净。（3）挑取。无菌操作条件下，用接种环取细菌培养液1～2环。（4）涂布。均匀涂布在载玻片的中央，涂布的范围为1～1.5cm。（5）干燥。室温下自然干燥，也可以将载玻片在火焰上加热烘干或用电吹风吹干。（6）染色。根据观察的需要决定染色方法。（7）冲洗。把载玻片上的染液冲洗掉，室温下适当晾一会儿。（8）观察。从低倍镜到高倍镜观察细菌的形态特征。五、压片标本的制作（一）植物压片标本的制作（1）培养。按常规方法培养洋葱，使其生根，当根尖生长至1cm时用0.2%秋水仙素溶液再培养3～4h。（2）固定。用剪刀剪取根尖，放入卡诺固定液中3～5h，进行杀生和固定。（3）保存。固定好的材料存放于70%乙醇中。（4）处理。用2.5%的纤维素酶和果胶酶进行处理40～50min，也可用1N盐酸处理5～10min，直至材料像豆腐一样松软。（5）切取。切取根尖的分生区（小米粒般大小），放置在载玻片的中央。（6）染色。在材料上滴加醋酸洋红染液或碱性品红染液1～2滴，室温下染色5～10min。（7）加盖。把盖玻片缓缓盖在材料上方。（8）敲击。把一小片吸水纸放置在盖玻片上方，左手固定住盖玻片，右手用火柴棒高频率轻轻敲击盖玻片，促使材料块的细胞均匀地在载玻片上摊开。（9）压片。把载玻片固定在实验台边上，右手拇指按在盖玻片上，突然用力下压，促使细胞破碎，染色体散开。（10）观察。从低倍镜到高倍镜进行观察，找到染色体时，转用油镜观察染色体的特征，统计染色体的数目。（二）动物压片标本的制作（1）擦拭。用洁净的细软纱布或擦镜纸把载玻片和盖玻片擦拭干净。（2）滴加。在载玻片中央滴加一滴生理盐水。（3）解剖。用毛笔挑取一只果蝇幼虫，把幼虫放置在载玻片中央，让幼虫头部向右，尾部向左。左手拿一解剖针轻轻按住幼虫虫体中后部，右手拿一解剖针扎住幼虫头部口器部位（一小黑点处），轻轻向右拉动，使幼虫头部与身体分开，唾液腺就在果蝇口器的两边。（4）挑取。根据唾液腺的位置和形态结构特征，找到两个唾液腺，把其周围的其他组织去除，仅仅剩下两只唾液腺在载玻片上。用吸水纸吸取生理盐水。（5）染色。在材料上滴加一滴醋酸洋红染液，室温下染色5～10min，室温太低时，可以把载玻片在酒精灯上稍微加热，增加染色效果。（6）压片。缓慢在材料上加上盖玻片，在盖玻片上加一层吸水纸，左手在实验台边缘固定载玻片，右手拇指按住载玻片上方，突然用力下压，把唾液腺腺体细胞压破，使唾液腺染色体压散开。（7）观察。从低倍镜到高倍镜观察唾液腺染色体的形态特征和结构特征。六、滴片标本的制作（一）植物滴片标本的制作（1）培养。按常规方法培养洋葱，使其生根，当根尖生长至1cm时用0.2%秋水仙素溶液再培养3～4h。（2）固定。用剪刀剪取根尖，放入卡诺固定液中3～5h，进行杀生和固定。（3）保存。固定好的材料存放于70%乙醇中。（4）处理。切取5～6个根尖的分生区，放入装有2.5%纤维素酶和果胶酶的离心试管中酶解20～40min，直至材料像豆腐一样松软。（5）离心。每分钟1000转离心5min。（6）低渗。倒去酶解液，加入1mL低渗液，用滴管把材料吹散开，呈现一个个细胞，再加入低渗液4mL，低渗15～20min。（7）固定。倒去低渗液，加入5mL卡诺固定液，固定10min。（8）离心。每分钟1000转离心5min。可以把7）、8）步重复1～2次。（9）制悬液。倒去固定液，离心管中可剩余1mL固定液。用滴管在离心管中反复吹吸，制成细胞悬液。（10）滴片。用滴管吸取细胞悬液，滴管高度离载玻片30cm，向准备好的载玻片中央位置滴2～3滴。适当晾干载玻片。（11）染色。在载玻片中央位置滴加改良碱性品红染液4～5滴，室温下染色10～15min。（12）观察。低倍镜下找到所要观察细胞的视野，高倍镜下找到染色体散开的图像，油镜下观察染色体的形态特征，统计染色体的数目。（二）动物滴片标本的制作（1）预处理。在实验开始前3～4h，给小白鼠在腹部注射秋水仙素溶液，小白鼠每克体重注射量为2μg。（2）杀生。用拉断脊髓的方法处死小白鼠。（3）取股骨。解剖取下小白鼠的股骨，用小片白纱布包在股骨上，用手反复搓动，以除掉股骨上的肌肉。（4）抽骨髓。把股骨两端剪开，用小注射器把股骨中的细胞冲到离心管中。（5）低渗。加入1mL低渗液，用滴管把材料吹散开，呈现一个个细胞，再加入低渗液4mL，低渗15～20min。（6）离心。每分钟1000转离心5min。 （7）预固定。倒去低渗液，加入5mL卡诺固定液，固定10min。（8）固定。倒去低渗液，加入5mL卡诺固定液，再固定10min。（9）离心。每分钟1000转离心5min。 （10）制悬液。倒去固定液，离心管中可剩余1mL固定液。用滴管在离心管中反复吹吸，制成细胞悬液。（11）滴片。用滴管吸取细胞悬液，滴管高度离载玻片30cm，向准备好的载玻片中央位置滴2～3滴。适当晾干载玻片。（12）染色。在载玻片中央位置滴加改良碱性品红染液4～5滴，室温下染色10～15min。（13）观察。低倍镜下找到所要观察细胞的视野，高倍镜下找到染色体散开的图像，油镜下观察染色体的形态特征，统计染色体的数目。七、切片标本的制作（一）徒手切片1.适用范围徒手切片是用手直接握住小刀，把选取的材料切成适于用显微镜观察的薄片。这种切片方法比较简便，有一把锋利的刀片在短时间内就可以完成。新鲜材料不经固定液处理就能切成10μm厚度的切片，有利于观察组织和细胞的生活状态及原有结构。2.实验物品准备培养皿、切片刀、夹持物、毛笔。3.操作步骤（二）动物组织石蜡切片1.适用范围石蜡切片是组织学常规制片技术中应用最为广泛的方法。石蜡切片不仅用于观察正常细胞组织的形态结构，也是病理学和法医学等学科用于研究、观察及判断细胞组织形态变化的主要方法，而且已相当广泛地用于其他学科领域的研究中。2.实验物品准备轮转式切片机、切片刀、恒温水箱式摊片仪、经过清洁处理的载玻片（防尘备用）、眼科弯镊、中号羊毫毛笔和粘片剂、解剖刀、镊子、剪刀、解剖针、包埋器、染色缸、烧杯等。3.操作步骤（三）植物组织石蜡切片植物切制片技术是制作在显微镜下观察的植物体特