色谱法讲义完整版本

色谱法讲义第七章色谱分析基础一、概述（一）色谱发展概况最早创立色谱法的是俄国植物学家Tswett。他在研究植物叶子的色素成分时，将植物叶子的萃取物倒入填有碳酸钙的直立玻璃管内，然后加入石油醚使其自由流下，结果色素中各组分互相分离形成各种不同颜色的谱带。当时Tswett把这种色带叫做“色谱”（Chromatographie，Tswett于1906年发表在德国植物学杂志上用此名，英译名为Chromatogra-phy），在这一方法中把玻璃管叫作“色谱柱”，碳酸钙叫作“固定相”，纯净的石油醚叫作“流动相”。在Tswett提出色谱概念后的20多年里没有人关注这一伟大的发明。直到1931年德国的Kuhn和Lederer才重复了Tswett的某些实验，用氧化铝和碳酸钙分离了α-，β-，和γ-胡萝卜素，此后用这种方法分离了60多种这类色素。Martin和Synge在1940年提出液液分配色谱法（Liquid－LiquidPartitionChromatography），即固定相是吸附在硅胶上的水，流动相是某种有机溶剂。1941年Martin和Syngee提出用气体代替液体作流动相的可能性，11年之后James和Martin发表了从理论到实践比较完整的气液色谱方法（Gas－LiquidChromatography），因而获得了1952年的诺贝尔化学奖。在此基础上，1957年Golay开创了开管柱气相色谱法（Open－TubularColumnChromatography），习惯上称为毛细管柱气相色谱法（CapillaryColumnChromatography）。1956年VanDeemter等在前人研究的基础上发展了描述色谱过程的速率理论，1965年Giddings总结和扩展了前人的色谱理论，为色谱的发展奠定了理论基础。另一方面早在1944年Consden等就发展了纸色谱，1949年Macllean等在氧化铝中加入淀粉粘合剂制作薄层板使薄层色谱法（TLC）得以实际应用，而在1956年Stahl开发出薄层色谱板涂布器之后，才使TLC得到广泛地应用。在60年代末把高压泵和化学键合固定相用于液相色谱，出现了高效液相色谱（HPLC）。80年代初毛细管超临界流体色谱（SFC）得到发展，但在90年代后未得到较广泛的应用。而在80年代初由Jorgenson等集前人经验而发展起来的毛细管电泳”（CZE），在90年代得到广泛的发展和应用。同时集HPLC和CZE优点的毛细管电色谱在90年代后期受到重视。到21世纪色谱科学将在生命科学等前沿科学领域发挥不可代替的重要作用。1、色谱法在分析化学中的地位和作用色谱分析法的特点是它具有高超的分离能力，而各种分析对象又大都是混合物，为了分析鉴定它们是由什么物质组成和含量是多少，必须进行分离，所以色谱法成为许多分析方法的先决条件和必需的步骤。2、色谱法的特点色谱法是以其高超的分离能力为特点，它的分离效率远远高于其它分离技术如蒸馏、萃取、离心等方法。（1）分离效率高。例如毛细管气相色谱柱（柱内径0.1-0.25μm），长30-50m其理论塔板数可以到7万-12万。而毛细管电泳柱一般都有几十万理论塔板数的柱效，至于凝胶毛细管电泳柱可达上千万理论塔板数的柱效。（2）应用范围广。它几乎可用于所有化合物的分离和测定，无论是有机物、无机物、低分子或高分子化合物，甚至有生物活性的生物大分子也可以进行分离和测定。（3）分析速度快。一般在几分钟到几十分钟就可以完成一次复杂样品的分离和分析。近来的小内径（0.1mm）、薄液膜（0.2μm）、短毛细管柱（1-10m）比原来的方法提高速度5-10倍。（4）样品用量少。用极少的样品就可以完成一次分离和测定。（5）灵敏度高。例如GC可以分析几纳克的样品，FID可达10-2g／s，ECD达10-3g／s；检测限为10-9g／L和10-12g／L的浓度。（6）分离和测定一次完成。可以和多种波谱分析仪器联用。（7）易于自动化，可在工业流程中使用。3、色谱法的分类色谱法或色谱分析（chromatography）也称之为色层法或层析法，是一种物理化学分析方法，它利用混合物中各物质在两相间分配系数的差别，当溶质在两相间做相对移动时，各物质在两相间进行多次分配，从而使各组分得到分离。可完成这种分离的仪器即色谱仪。色谱法的分类可按两相的状态及应用领域的不同分为两大类。（1）、按流动相分 气相色谱gaschromatography(GC)– 流动相是气体，固定相是固体吸收剂或液体（涂在固体上)。 液相色谱liquidchromatography(LC)– 液体作为动流动相。（2）、按分离机理分类 吸附色谱法 分配色谱法 离子交换色谱法 凝胶色谱法或尺寸排阻色谱法 亲和色谱法（3）、按固定相的外形/相系统的形式分类 柱色谱:填充柱色谱：固定相装于柱内的色谱法。毛细管色谱法：采用内壁涂渍极薄而均匀的固定液膜的毛细管作为色谱柱的气相色谱法。 平板色谱:固定相呈平板状的色谱法。色谱色谱气相色谱(GC)液相色谱(LC)超临界色谱(SFC)气固色谱(GSC)气液色谱(GLC)液固色谱液液色谱离子交换色谱空间排阻色谱反相分配色谱正相分配色谱柱色谱平板色谱电色谱薄层色谱TLC纸色谱TLC亲合色谱毛细管柱电色谱毛细管电泳毛细管区带电泳毛细管凝胶电泳毛细管胶束电动色谱毛细管等电聚焦毛细管等速电泳平面层电色谱（4）、按使用领域不同对色谱仪的分类 实验室用色谱仪分析用色谱仪便携式色谱仪流程色谱仪实验室用制备色谱仪制备用色谱仪工业用大型制备色谱仪 气固色谱：GC是以气体作为流动相的一种色谱法。利用不同物质在固体吸附剂上的物理吸附-解吸能力不同实现物质的分离。应用范围：只适于较低分子量和低沸点气体组分的分离分析。GSC固定相应用多孔固体O2,N2,CO2等稳定气体，低沸点化合物气液色谱：它是利用待测物在气体流动相和固定在惰性固体表面的液体固定相之间的分配原理实现分离。GLC固定相应用惰性载体涂渍高沸点固定液广泛二、色谱流出曲线及有关术语（一）、色谱流出曲线(TheChromatogram)1、色谱流出曲线(TheChromatogram)/色谱图（TheChromatogram）Chromatogram0Chromatogram05101520Time(minutes)AbundanceABCDE在柱子的出口处，由检测器检测到的物质的浓度随时间变化的曲线。或由检测器输出的电信号强度对时间作图，所得曲线称为色谱流出曲线。2、色谱峰（chromatographicpeak）色谱流出曲线上突起的部分。当单个组份从柱中流出时，检测器响应信号的记录。色谱峰的特点：如果进样量很小，浓度很低，在吸附等温线的线性范围内，色谱峰如果对称，可用Gauss正态分布函数表示：c：不同时间t时某物质的浓度，σ：标准偏差，c0：进样浓度，t：保留时间3、色谱流出曲线的用途① 根据色谱峰的个数，可以判断样品中所含组份的最少个数。② 根据色谱峰的保留值(或位置）定性。③ 根据峰面积（峰高）定量。④ 色谱峰的保留值及其区域宽度，是评价色谱柱分离效能的依据。⑤ 色谱峰两峰间的距离，是评价固定相（和流动相）选择是否合适的依据。4、基线（baseline）：在色谱分析中，当只有流动相通过而没有样品通过检测器时，记录所得到的检测信号随时间变化的曲线，应为一条直线。5、峰高((peakheight,h):色谱峰顶点与基线之间的垂直距离（二）、保留值1、死时间(tM):指不被固定相吸附或溶解的气体，从进样开始到柱后出现浓度最大值时所需时间。2、死体积(VM)=tMF0指柱子在填充后，色谱柱管内固定相颗粒间所剩留的空间、色谱仪中管路和连接头间检测器的空间的总和。3、保留时间(tR)：指被测组分从进样开始到柱后出现浓度最大值时所需时间。4、调整保留时间（tr′）:扣除死体积后的保留体积tr′=保留时间(tr)－死时间（t0）5、保留体积（Vr）：指从进样开始到被测定组分在柱后出现浓度极大点时所通过的流动相(载气)体积。6、相对保留值（r2,1）:一种物质与另一种物质调整保留值之比。意义：两组分热力学平衡分配的差别的度量。影响因素：柱温（T）、固定相的性质。用途:定性：一定色谱条件下，两组分的相对保留值是常数。选择固定相：r2,1值大，tr大；r2,1值小，tr小。（三）、区带宽度/区域宽度：（ZoneBroadeningorBandBroadening）数理统计用s来度量Gaussian曲线的宽度。表达方式：标准偏差,半峰宽度,峰底宽度1、标准偏差（s）：0.607h处一半的峰宽。2、半峰宽度（W1/2）:峰高一半处的峰宽度W1/2=2s(2ln2)1/2=2.354s单位：mm或cm；时间min或s；体积。3、峰底宽度（W）:色谱峰两侧的转折点所作切线在基线上的截距。Y=4s三、色谱分析的基本原理本节内容： 色谱分析过程 塔板理论（platetheory） 速率理论（ratetheory） 色谱分离基本方程式混合级组分混合级组分进样分离信号信号转换和放大记录信号分离过程信号产生和处理过程流动相（一）、色谱分析过程分离：基于物质溶解度、吸附能力、立体结构和离子交换等物化性质和结构上的微小差异，使其在流动相和固定相之间的作用力大小或强弱不同，当两相作相对运动时，组分在两相间进行连续多次分配，从而达到彼此分离的目的。分析：利用组分的物理和化学性质(光学性质、电学性质、热学性质和化学显色反应等），设计各种检测器，对分离组分连续检测。气固色谱：流动相是气体，固定相是固体，组分性质不同，吸附能力不同，差速运动气液色谱：流动相是气体，固定相是液体过程：载气+试样组分→溶解到固定相→载气流动→组分挥发→载气流动组分再溶解→载气流动→再挥发→反复过程分配过程：组分在固定相和流动相之间发生的多次溶解挥发的过程（二）、气相色谱基本原理：在气液色谱中，被测物质各组分的分离是基于各组分在固定液中溶解度的不同。当试样由载气携带进入色谱柱后，即被固定液所溶解。随着载气继续流经色谱柱，溶解在固定液中的被测组分又从固定液中挥发出来到气相中去。随着载气的流动，挥发到气相中的被测组分又会溶解在前面的固定液中。这样反复多次溶解、挥发，再溶解、再挥发。由于各组分在固定液中的溶解能力不同，溶解度较大的组分较难挥发，逐渐移在后面；而溶解度较小的组分，则移在了前面，经过一段时间之后，各组分就彼此分离了。1、分配系数：在一定温度下组分在两相之间分配达到平衡时的浓度比.组分保留程度的量度:K值小，先出柱子，K值大，后出柱子影响因素：K只与固定相和温度有关，与两相体积、柱管特性和所用仪器无关。ΔΔK值比较小温度较高ΔK值比较大温度较低2、分配比（partitionratio）/容量因子（capacityfactor）/容量比（capacityratio）在一定温度、压力下，在两相间达到分配平衡时，组分在两相中的质量比。物理意义：k值越大，说明组分在固定相中的量越多，相当于柱的容量大，因此又称分配容量或容量因子。用途：衡量色谱柱对被分离组分保留能力。容量因子越大，保留时间越长；影响因素：组分及固定相热力学性质。柱温、柱压，流动相，固定相的体积。3、分配系数K与分配比k的关系相比率β：反映各种色谱柱型特点的参数例如：填充柱，其β值一般为6～35；毛细管柱，其β值为60～600。 分配系数与分配比都是与组分及固定相的热力学性质有关的常数，随分离柱温度、柱压的改变而变化； 分配系数与分配比都是衡量色谱柱对组分保留能力的参数，数值越大，该组分的保留时间越长； 分配比可以由实验测得。四、色谱分离的基本理论色谱理论色谱理论色谱过程热力学（组分保留值）色谱过程动力学（谱带宽）塔板理论（platetheory）速率理论（ratetheory）色谱理论（一）、塔板理论（platetheory）1952年，Martin等人提出的塔板理论将一根色谱柱当作一个由许多塔板组成的精馏塔，用塔板概念来描述组分在柱中的分配行为。塔板是从精馏中借用的，是一种半经验理论，但它成功地解释了色谱流出曲线呈正态分布。塔板理论假设：在每一块塔板上，溶质在两相中很快就达到平衡，然后随着流动相按一个一个塔板的方式向前转移，而导引出一个描述色谱流出曲线的数学表示式：色谱分离过程-----蒸馏过程，柱子-----分馏塔，柱子=塔板+塔板+塔板+…★塔板数（n）：组分在柱子中经过分配平衡的次数★塔板高度（H）（HEPT，heightequivelenttoonetheoreticalplate）：组分在柱子中经过一次分配平衡所需要的柱长★塔板理论假设：1)塔板之间不连续；2)塔板之间无分子扩散；3)组分在各塔板内两相间的分配瞬间达至平衡，达一次平衡所需柱长为理论塔板高度H；4)某组分在所有塔板上的分配系数K相同；5)流动相以不连续方式加入，即以一个一个的塔板体积加入。〖例〗：设色谱柱由5块塔板（n＝5，n为柱子的塔板数）组成，以r表示塔板编号，r=1，2，3，4（n－l）；某组分的分配比k=1.该组分的分布可计算如下：有单位质量，即m=1（例1μg）的该组分加到第0号塔板上，分配平衡后，由于k=1，即ms=mm,故ms=mm=0.5。当一个板体积（lΔV）的载气以脉动形式进入0号板时，就将气相中含有mm部分组分的载气顶到1号板上，此时0号板液相（或固相）中ms部分组分及1号板气相中的mm部分组分，将各自在两相间重新分配。故0号板上所含组分总量为0．5，其中气液（或气固）两相各为0．25，而1号板上所含总量同样为0．5．气液（或气固）相亦各为0.25。以后每当一个新的板体积载气以脉动式进入色谱柱时，上述过程就重复一次。按上述分配过程，对于n=5，k=1，m=1的体系，随着脉动进入柱中板体积载气的增加，组分分布在柱内任一板上的总量（气液两相中的总质量）。由塔板理论可建立流出曲线方程：当板数很高时，以体积或时间或距离为变数，流出组分浓度变化的方程：式中：c—不同时间t时某物质的浓度，c0—进样浓度，tr—保留时间，σ—标准偏差。n理论塔板数，m组分质量，V保留体积当V=Vr时，c值最大结论：当塔板数n较少时，组分在柱内达分配平衡的次数较少，流出曲线呈峰形，但不对称；色谱峰为正态分布：当塔板数n>50时，峰形接近正态分布。理论塔板数:根据呈正态分布的色谱流出曲线可以导出计算塔板数n的公式，用以评价一根柱子的柱效。由于色谱柱并无真正的塔板，故塔板数又称理论塔板数：理论塔板数由组分保留值和峰宽决定★理论塔板数★塔板高度〖例〗已知某组分峰的峰底宽为40s，保留时间为400s，计算此色谱柱的理论塔板数。解:tr=400s,W=40sn=16(tR/Y)2=16´（400/40）2=1600块★有效理论塔板数neff和有效塔板高Heff由于死时间tm包括在tr中，而实际的tm不参与柱内分配，所以，将t0扣除★有效塔板高度 色谱柱效能¾描述当溶质流经色谱柱时谱带展宽速率：★塔板理论实际指导意义：塔板理论描述了组分在柱内的分配平衡和分离过程，导出流出曲线的数学模型，解释了流出曲线形状和位置，提出了计算和评价柱效的参数。n或H：描述柱效能的指标，当塔板数增加，塔板高度减小，柱效增加，色谱峰W越小，n就越大，而H就越小，柱效能越高。(1)当色谱柱长度一定时，塔板数n越多(塔板高度H越小)，被测组分在柱内被分配的次数越多，柱效能则越高。(2)不同物质在同一色谱柱上的分配系数不同，说明柱效时，必须注明该柱效是针对何种物质、固定液种类及其含量、流动相种类及流速、操作条件等；(3)应定期对柱效进行评价，以防柱效下降、延长柱寿命。(4)柱效不能反应被分离组分的实际分离效果，当两组分的分配系数K相同时，无论该色谱柱的塔板数多大，都无法分离。(5)塔板理论无法解释同一色谱柱在不同的流动相流速下柱效不同的实验结果，无法指出影响柱效的因素及提高柱效的途径。★塔板理论的成就：流出曲线的形状，浓度极大，计算、评价柱效能，塔板理论的缺陷：纵向扩散不能解释造成峰形或谱带扩张的原因，影响板高的各种因素，载气流速u～塔板数n关系（二）、速率理论：1956年，荷兰化学工程师VanDeemter提出了色谱过程动力学速率理论：吸收了塔板理论中的板高H概念，考虑了组分在两相间的扩散和传质过程，从而给出了vanDeemter方程：色谱过程动力学理论---范第姆特方程塔板高度=涡流扩散项+分子扩散项+传质阻力项 该式从动力学角度解释了影响板高（柱效）的各种因素！ 任何减少方程右边三项数值的方法，都可降低H，从而提高柱效。简化式简化式：H=A+B/u+Cu分子扩散系数传质阻力系数流动相线速度涡流扩散项1、涡流扩散项（eddydiffusionterm）在填充色谱柱中，当组分随流动相向柱出口迁移时，流动相由于受到固定相颗粒障碍，不断改变流动方向，使组分分子在前进中形成紊乱的类似“涡流”的流动。引起色谱峰的展宽/扩张。因填充物颗粒大小及填充的不均匀性——同一组分运行路线长短不同，——流出时间不同，——峰形展宽。展宽程度以A表示：A＝2λdp★影响因素dp：填料平均直径的大小，λ：固定相填充不规则因子，固定相颗粒越小dp↓，填充的越均匀，塔板高度H↓，柱效n↑。★谱图现象：在涡流扩散所引起的色谱峰变宽现象减轻，色谱峰较窄。★意义：与填充物的平均颗粒直径的大小有关；与填充的不均匀性有关。与流动相的性质、线速度和组分性质无关。提高柱效，固定相使用细而均匀的颗粒，填充均匀。毛细管，不存在涡流扩散。A＝0。2、分子扩散项/纵向扩散项由于试样组分浓度梯度，使运动的分子产生纵向扩散，它随着流动相向前推进，“塞子”自发地向前和向后扩散，造成谱带展宽。B/u—分子扩散项★原因(1)存在着浓度差，产生纵向扩散;(2)扩散导致色谱峰变宽，H↑(n↓)，分离变差;(3)分子扩散项与流速有关，流速↓，滞留时间↑扩散↑。B＝2γDgγ：弯曲因子。填充柱内流动相扩散路径弯曲的因素，意义：固定相颗粒的几何形状对自由分子扩散的阻碍。Dg：组分在流动相中扩散系数（cm2•s-1）。与组分和载气性质有关，组分相对分子质量大的，Dg小，载气分子质量大的，Dg小3、传质阻力项物质系统由于浓度不均匀而发生的物质迁移过程,称为传质。影响这个过程进行速度的阻力，叫传质阻力。对于气液色谱，传质阻力系数C包括气相传质阻力系数Cg和液相传质阻力系数Cl两项，即C＝Cg＋Cl传质阻力包括气相传质阻力Cg和液相传质阻力CL即：C=（Cg+CL）k:容量因子；Dg:气体扩散系数，DL:液体扩散系数★气相传质过程：指试样组分从气相移动到固定相表面的过程。这一过程中试样组分将在两相间进行质量交换，即进行浓度分配。有的分子还来不及进入两相界面，就被气相带走；有的则进入两相界面又来不及返回气相。这样，使得试样在两相界面上不能瞬间达到分配平衡，引起滞后现象，从而使色谱峰变宽。对于填充柱，气相传质阻力系数Cg。气相传质阻力与填充物粒度平方成正比、与组分在载气流中的扩散系数成反比。意义：用粒度小的填充物相对分子质量小的气体（如氢气）做载气，Cg减小，提高柱效。降低传质阻力办法：减小担体粒度，选择小分子量的气体作载气★液相传质阻力系数C1为固定相的液膜厚度df薄，组分在液相的扩散系数D1大，则液相传质阻力就小。液膜厚度：降低固定液的含量，可以降低液膜厚度，但k值随之变小，又会使C1增大。当固定液含量一定时，液膜厚度随载体的比表面积增加而降低，因此，一般采用比表面积较大的载体来降低液膜厚度，但比表面太大，由于吸附造成拖尾峰，也不利分离。柱温：虽然提高柱温可增大Dl，但会使k值减小，为了保持适当的Cl值，应控制适宜的柱温。气液色谱速率板高方程H=A+B/u+Cgu+Clu★速率理论的要点(1)组分分子在柱内运行的多路径与涡流扩散、浓度梯度所造成的分子扩散及传质阻力使气液两相间的分配平衡不能瞬间达到等因素是造成色谱峰扩展柱效下降的主要原因。(2)通过选择适当的固定相粒度、流动相种类及流速可提高柱效。柱子：填充担体的细度流动相：氮气N2，氢气H2，氦气Ne流速：填充柱:50ml/min,毛细管柱:1ml/min(3)速率理论为色谱分离和操作条件选择提供了理论指导。阐明了流速和柱温对柱效及分离的影响。(4)各种因素相互制约，如流动相流速增大，分子扩散项的影响减小，使柱效提高，但同时传质阻力项的影响增大，又使柱效下降；柱温升高，有利于传质，但又加剧了分子扩散的影响。实际指导意义：对柱效的影响，色谱柱填充的均匀程度，填料颗粒的大小，流动相的种类及流速，固定相的液膜厚度等。五、分离度理论需要解决的问题：塔板理论和速率理论都难以描述难分离物质对的实际分离程度。即柱效为多大时，相邻两组份能够被完全分离。难分离物质对的分离度大小受色谱过程中两种因素的综合影响：保留值之差──色谱过程的热力学因素；区域宽度──色谱过程的动力学因素。1.两组份峰间距足够远：由各组份在两相间的分配系数决定，即由色谱过程的热力学性质决定。2.每个组份峰宽足够小：由组份在色谱柱中的传质和扩散决定，即由色谱过程动力学性质决定。色谱分离中的四种情况：①柱效较高，△K(分配系数)较大,完全分离；②△K不是很大，柱效较高，峰较窄，基本上完全分离；③△K较大,柱效较低，但分离的不好；④△K小，柱效低，分离效果更差。（a）两峰严重相叠，这表示选择性和柱效都差。（b）虽然两峰距离拉开了，但峰形仍很宽，说明选择性好，但柱效低。（c）分离最理想，说明选择性好，柱效也高。柱效和选择性色谱过程动力学性质：柱效--理论塔板数表示色谱过程组分在固定相上的热力学性质：色谱柱的选择性--色谱图上的两峰间的距离表示，距离大，选择性好，用相对保留值表示峰宽分离度：相邻两组分色谱峰保留值之差与两组分色谱峰底宽总和之半的比值，当R＜1时，两峰有部分重叠；当R＝1时，分离程度可达98％；当R＝1.5时，分离程度可达99.7％。作为相邻两组分已完全分离的标志六、色谱分离基本方程式分离度是既能反映柱效率又能反映选择性的指标.分离度¾总分离效能指标分离度R的定义并没有反映影响分离度的诸因素。分离度受柱效（n）、选择因子(α)和容量因子（k）三个参数的控制。与柱效能、选择性、容量因子的关系1.分离度与柱效（n）的关系，降低H--提高R2.分离度与容量比（k）的关系，1～10。K大，R大，时间长3.分离度与柱选择性（α）的关系，α大，分离效果好，一对最难分离物质：α=tr2’/tr1’>1第八章气相色谱流程与结构一、气相色谱仪的结构气相色谱仪由五大系统组成：气源及控制部分气源及控制部分进样系统分离系统检测系统记录及数据处理系统温控系统流动相固定相1.气路系统气相色谱仪的流动相多用高压气瓶做气源，经减压阀把气瓶中15MPa左右的压力减低到0.2～0.5MPa,通过净化器（一般为20～25cm×4cmi.d．的金属管或塑料管，内装5A分子筛，除去载气中的水分和杂质）到稳压阀，保持气流压力稳定。程序升温用气相色谱仪，还要有稳流阀，以便在柱温升降时可保持气流稳定。压力表或流量计可指示载气的流量或流速。气化室是为液体或固体样品进行气化的装置。毛细管气相色谱仪与填充柱气相色谱仪不同之处是进样系统复杂，如在气化室中装分流／不分流系统，使用冷柱头进样系统。另外在毛细管色谱柱末端进入检测器时还要增加一个补充气的管线以保证检测器正常工作。• 当u较小时，分子扩散项B/u是影响板高的主要因素，选择相对分子质量较大的载气（N2，Ar）• 当u较大时，传质阻力项Cu起主导作用，选择相对分子质量小的载气(H2,He)，提高柱效。• 载气的选择还要考虑与检测器相适应。2.进样系统进样装置+气化室，进样系统作用：定量引入样品；加热气化，转入柱内，进样器：微量注射器。气体进样器用六通阀。进样量的选择柱越粗、L↑，固定液含量↑，容许进样量↑。最大允许进样量：在使半峰宽基本不变，峰高与进样量成线性关系。超过最大允许进样量后果：线性关系遭破坏。3.分离系统色谱柱的作用：分离混合组分，分离柱种类：填充柱和开管柱(或称毛细管柱)。构成：色谱柱=固定相：担体/载体+固定液（1）色谱柱类型：填充柱和毛细管柱1）填充柱：材料：不锈钢或玻璃，内装固定相，内径：2mm-4mm，长:1m-3m。形状：U型和螺旋型。内填固定相2）毛细管柱/空心柱：材料：玻璃或石英，内径:0.2mm-0.5mm，长:30m-300m，类型：涂壁，多孔层，涂载体空心柱4.检测器研究过的气相色谱检测器有二三十种，但是在商品仪器上常用的气相色谱检测器只有六七种：①热导检测器（TCD）是基于各种物质有不同的导热系数而设计的检测器。②氢火焰离子化检测器（FID）是气相色谱中最常用的一种检测器。它的敏感度高，线性范围宽，易于掌握，应用范围广，特别适合于毛细管气相色谱使用。③电子俘获检测器（ECD）是一种用Ni或氖做放射源的离子化检测器，它是气相色谱检测器中灵敏度最高的一种选择性检测器，在气相色谱仪中应用范围仅次于TCD和FID，占第三位。④火焰光度检测器（FPD）是基于样品在富氢火焰中燃烧，使含硫、磷化合物经燃烧后又被氢还原而得到特征光谱的检测器。⑤热离子检测器（TID）又称氮磷检测器（NPD），它是在FID的喷嘴和收集极之间放置一个含有硅酸钾的玻璃珠。适于测定氮、磷化合物的选择性的检测器。⑥光离子化检测器（PID）是利用紫外光能激发解离电位较低（<10.2eV）的化合物，使之分离而产生信号的检测器。5.数据处理系统记录仪和色谱处理系统是记录色谱保留值和峰高或峰面积的设备，记录仪就是常用的自动平衡电子电位差计，它可以把从检测器来的电压信号记录成为电压随时间变化的曲线，即色谱图。数据处理系统或色谱工作站是一种专用于色谱分析的微机系统。计算积分器则是现今更为普遍使用的色谱数据处理装置，这种装置一般包括一个微处理器、前置放大器、自动量程切换电路、电压-频率转换器、采样控制电路、计数器及寄存器、打印机、键盘和状态指示器等。二、气相色谱固定相（一）、气液色谱1. 担体2. 固定液（二）、气固色谱固定相为吸附剂（三）、固定相及其选择气－液色谱固定相，固定液+载体/担体，1.载体/担体载体的作用:具有较大惰性表面积承载液膜。载体的要求:比表面大;粒度均匀，筛分范围要窄;机械强度好，化学稳定性及热稳定性好载体分类：红色硅藻土：201红色担体，白色硅藻土：101白色担体，酸洗、碱洗和硅烷化，(去活性中心)，非硅藻土类：玻璃微珠、氟载体等选择：红色硅藻土载体：对惰性组分分离；白色硅藻土载体；硅烷化的白色硅藻土载体：对性质比较活泼的样品白色载体：是将硅藻土与20％的碳酸钠（助熔剂）混合煅烧而成，白色、比表面积较小、吸附性和催化性弱，应用范围：适宜于分析各种极性化合物。类型：国产101，102系列，英国的Celite系列，英国和美国的Chromosorb系列，美国的Gas－ChromA，CL，P，Q，S，Z系列等筛分范围：60～80目或80～100目2.固定液1）对固定液的要求热稳定性好，流失少（最高使用温度）；蒸气压低，固定液在操作温度下应呈液态，粘度要低（最低使用温度）；分配系数要适当，组分选择性要高；填充柱：g2.1＞1．15；毛细管柱，g2.1＞1.08.化学稳定性要好；能牢固地附着于载体上，并形成均匀和结构稳定的薄膜等。2)固定液与组分分子间的作用载气与组分分子的作用：载气惰性，组分在气相中浓度很低，组分分子间作用力很小，可忽略。组分与固定液分子间的作用：在固定相中，此作用力反映了组分在固定液中的热力学性质。作用力大的组分，由于溶解度大，分配系数大。构成K差异。作用力形式：静电力、诱导力、色散力、氢键作用力；形成化合物或络合物的键合力。3）固定液的分类：固定液的极性，化学类型(1)按固定液的极性分类固定液的特性：极性或选择性，作用：描述和区别固定液的分离特征。表示：相对极性，固定液特征常数。表常用固定相的相对极性固定液相对对极性极别固定液相对对极性极别角鲨烷00XE-6052+3阿皮松7-8+1新戊二醇丁二酸聚酯58+3SE-30，OV-113+1PEG-20M68+3DC-55020+2PEG-60074+4已二酸二辛酯21+2已二酸聚乙二醇酯72+4邻苯二甲酸二壬酯25+2已二酸二乙二醇酯80+4邻苯二甲酸二辛酯28+2双甘油89+5聚苯醚OS-12445+3TCP98+5磷酸二甲酚酯46+3β，β’-氧二丙腈100+5固定液的极性的表征不同于化合物极性的表征，化合物的极性用偶极矩表征，而固定液的极性实际上是用典型化合物在固定液上的保留性能来表征，目前多用McReynolds常数表征固定液的极性，即测定五种典型化合物在某一固定液上的保留指数，同时测定这五种典型化合物在角鲨烷上的保留指数，用这两种固定液上保留指数之差来表征固定液的极性。固定液名称型号麦氏平均极性角鲨烷SQ0阿皮松LAPL29甲基硅油（甲基硅橡胶）SE-30，OV-10143苯基（50%）甲基聚硅氧烷OV-17177苯基（60%）甲基聚硅氧烷OV-22219三氟丙基（50%）甲基聚硅氧烷QF-1，OV-210300b-氰已基（25%）甲基聚硅氧烷XE-60357聚乙二醇-20000PEG-20M462己二酸二乙二醇酯DEGA552丁二酸二乙二醇酯DEGS686（2）按分子间作用力分类固定液类别典型固定液色谱保留特性不易极化非极性固定液角鲨烷、正三十六烷、聚二甲基硅氧烷非极性化合物按沸点次序洗脱出来同沸点极性化合物，偶极矩大的较快洗脱出来氢键型化合物类似于极性化合物，但同沸点、同偶极矩的极性化合物中，氢键型化合物较快洗脱出来易极化非极性固定液含有芳香基的聚甲基硅氧烷，阿皮松-L、阿皮松-M非极性化合物按沸点次序洗脱出来同沸点极性化合物要比非极性化合物洗脱出去慢，偶极矩越大的洗脱出来越慢氢键型化合物类似于极性化合物，但同沸点、同偶极矩的极性化合物中，氢键型化合物较快洗脱出来难成氢键的极性固定液氟油、氟蜡不易极化的非极性化合物按沸点次序洗脱出来，但易极化的非极性化合物要比不易极化的非极性化合物洗脱出来慢一些同沸点极性化合物按偶极矩大小决定洗脱出来的快慢，偶极矩大的洗脱出来要慢一些氢键型化合物也按偶极矩大小规律变化能受质子的极性固定液各种脂类固定液，如邻苯二甲酸二壬脂非极性和极性化合物的色谱特性与难成氢键的极性固定液同对氢键型化合物和能给质子化合物洗脱出来要慢一些给质子和受质子力同时存在的固定液聚脂和聚脂固定液，如PEG，DEGS不易极化的非极性化合物按沸点次序洗脱出来，但保留时间较短易极化的非极性化合物洗脱出来较慢同沸点极性化合物，偶极矩大的洗脱出来较慢氢键型化合物洗脱出来的较慢受质子力较强的固定液如THEED对非极性化合物色谱特性与给质子和受质子力同时存在的固定液类似对能给质子的化合物洗脱出来较慢给质子力较强的固定液如OV-210，QF-1对非极性化合物色谱特性与给质子和受质子力同时存在的固定液类似对受质子的化合物洗脱出来较慢（3）按固定液的化学结构分类根据官能团的类型：烃类、醇类、聚醇类、硅酮类、酯类、腈和腈醚类、酰胺和聚酰胺类、有机皂土类等。（4）固定液的选择：相似相溶出峰顺序（i）分离非极性物质：用非极性固定液，试样中各组分按沸点次序流出，沸点低的先流出，沸点高的后流出。（ii）分离极性物质：用极性固定液，试样中各组分按极性次序分离，极性小的先流出。极性大的后流出。（iii）分离非极性和极性混合物：选用极性固定液，非极性组分先流出，极性组分后流出。（vi）分离能形成氢键的试样：用极性或氢键型固定液。试样中各组分按与固定液分子间形成氢键能力大小先后流出，不易形成氢键的先流出，最易形成氢键的最后流出。（v）复杂的难分离物质：用两种或两种以上混合固定液。3．合成固定相目的：控制载体的结构及调配固定相的表面性质。（1）高分子多孔微球（2）化学键合固定相（chemicalbondedphase）三、检测器检测器：检测组分的存在，并将组分的量定量地转换为电信号，加以放大。1.热导检测器(TCD);2.氢火焰离子化检测器(FID)3.电子捕获检测器(ECD);4.火焰光度检测器(FPD);5.氮磷检测器（NPD）6.热离子检测器(TID)。类型：（l）浓度型检测器:（2）质量型检测器:测量的是载气中某组分浓度瞬间的变化，即检测器的响应值和组分的浓度成正比。TCD和ECD。测量的是载气中某组分进入检测器的速度变化，即检测器的响应值和单位时间内进入检测器某组分的量成正比。FID和FPD检测器的性能指标：检测器应具有的条件：1）适合的灵敏度：对一些组分十分灵敏，而对其它则不，其间应相差达107倍；2）稳定、重现性好；3）线性范围宽，可达几个数量级；4）在室温到400oC下使用5）响应时间短，且不受流速影响；6）可靠性好、使用方便、安全；7）对所有待测物的响应相似或可以预测这种响应；8）选择性好；9）不破坏样品。（一）、热导检测器（ThermalConductivityDetector--TCD）（1）原理：根据不同的物质具有不同的热导系数、组分与载气导热率的差异进行检测（2）热导池的结构：池体和热敏元件构成，四根金属丝组成的四臂热导池,二臂为参比臂，另二臂为测量臂，将参比臂和测量臂接入惠斯顿电桥，由恒定的电流加热组成热导池测量线路。（3）影响热导检测器灵敏度的因素（ⅰ）桥电流桥电流增加，使钨丝温度提高，钨丝和热导池体的温差加大，气体就容易将热量传出去，灵敏度就提高。↑电流，灵敏度↑，但钨丝寿命↓。桥电流控制在1OO～20OmA左右N2作载气时为100～150mA;H2作载气时150～200mA为宜。（ⅱ）池体温度池体温度降低，池体和钨丝温差大，提高灵敏度。但池体温度过低，被测试样会冷凝在检测器中。TD>TC。（ⅲ）载气种类载气与试样的热导系数相差愈大，则灵敏度愈高。热导系数大的氢气或氦气作载气，灵敏度高。（4）特点：TCD结构简单，性能稳定，几乎对所有物质都有响应，通用性好，而且线性范围宽，价格便宜。缺点是灵敏度较低。（5）适用范围：与载气导热率不同的可气化物质毛细管柱毛细管柱/TCD1.空气2.甲烷3.二氧化碳4.乙烯5乙烷（二）、火焰离子化检测器（FID）（1）原理：以氢气和空气燃烧的火焰作为能源，利用含碳有机物在火焰中燃烧产生离子，在外加的电场作用下，使离子形成离子流，根据离子流产生的电信号强度，检测被色谱柱分离出的组分。火焰离子化机理可能是一个化学电离过程。有机物在火焰中先形成自由基，然后与氧产生正离子，再同水反应生成H30+离子。如苯，在氢火焰中的化学电离反应如下：（2）结构含碳有机化合物在氢火焰中燃烧产生正离子，收集这些离子并加以放大，得到代表组分的电流。（3）影响操作条件的因素，离子室的结构影响灵敏度，操作条件的变化，包括氢气、载气、空气流速及纯度和检测室的温度响应氢气流速响应氢气流速响应不同氮气流速空气流速空气流速（4）特点：灵敏度很高，比热导检测器的灵敏度高约103倍；检出限低，可达10-12g•S-1；死体积小，响应速度快，线性范围也宽，可达106，结构不复杂，操作简单；适用范围：大多数含碳有机化合物。不能检测永久性气体:CO2,SO2,NOx,硫化氢H2O,3.电子捕获检测器---选择性的检测器(1)适用范围：电负性物质（如含卤素、硫、磷、氰等）（检出限约1O-14g•cm-3）。较多应用于农副产品、食品及环境中农药残留量的测定。(2)缺点：线性范围窄，只有103左右，且响应易受操作条件的影响，重现性较差，对大多数烃类没有响应。(3)电于捕获检测器的结构与工作原理结构：两个电极（不锈钢棒作正极，在两极施加直流或脉冲电压），筒状的β放射源（贴在阴极壁上）原理：一个能源和一个电场。能源多数用63Ni或3H放射源，放射源的β射线将载气（N2或Ar）电离，产生次级电子和正离子，在电场作用下，电子向正极方向移动，形成恒定基流。载气载气载气放射源电极放大器记录器池体当载气带有电负性溶质进入检测器时，电负性溶质就能捕获这些低能量的自由电子，形成稳定的负离子，负离子再与载气正离于复合成中性化合物，使基流降低而产生负信号——倒峰。捕获机理可用以下反应式表示：4.火焰光度检测器(FPD)--质量型检测器（1）适用范围：含磷、硫有机化合物检出限：10-12g•S-1（P）或10-11g•S-11（S）（2）火焰光度检测器的结构（3）火焰光度检测器的工作原理化合物中硫、磷在富氢火焰中被还原，激发后，辐射出400、550nm左右的光谱，可被检测；（4）主要影响因素，流速比；硫的响应受温度影响大。表常用检测器性能TCDFIDECDFPD类型浓度质量浓度6.7.4适用范围各类气相物质含碳有机物含有电负性物质含S、P有机物通用性选择性通用性通用性选择性选择性灵敏度10mVcm/g10-2mVs/g800AmL/g400mVs/g检测限2×10-9g10-12g10-14g10-11（S）～10-12g最小检测浓度100ng1ng0.1ng10ng/g线性范围104107102～104102（S）,102～103（P）四、分离操作条件的选择（一）、色谱柱材料的选择1.材料，一般分析多用不锈钢柱，它的优点是机械强度好又有一定的惰性，如用它来分离烃类和脂肪酸酯类是足够稳定的，但分析较为活性的物质时要避免使用不锈钢柱。在使用高分子小球时也不要用不锈钢柱。其他金属柱现在很少使用。玻璃柱，在分析较为活泼的物质时，多用玻璃柱，它透明便于观察柱内填充物的情况，光滑易于填充成密实的高效柱，其缺点是易碎。（二）、色谱柱的柱形和柱径现代分析用填充柱气相色谱法，多用直径为2-3mm的色谱柱，而微填充柱则使用内径lmm左右的色谱柱，小内径色谱柱可降低范氏方程式中涡流扩散项的λ值，从而提高柱效。因为填充柱的阻力大，载气压力降（△p）大，柱长受到限制，最长只有7m左右，一般多用1～3m的填充柱。具体使用多长的要看在分离物质对的α值大小，在达到分离的要求条件下，宜使用短色谱柱。这样可以降低柱温、缩短分析时间。能使待测组分达到预期的分离效果，尽可能使用较短的色谱柱。一般常用的填充柱为l～3m。填充色谱柱内径为3～4mm。柱长的选择柱长的影响：L↑，n↑，W↑，t↑。L↑↑，R也不一定高。方法：选择一根极性适宜，任意长度的色谱柱，测定两组分的分离度，然后根据基本色谱分离方程式，确定柱长是否适宜。［例］在一根1m长的色谱柱上测得两组分的分离度为0.68,要使它们完全分离(R=1.5),则柱长应为多少？解：根据根据分离度方程式，在其它操作条件不变的条件下，色谱柱长要选择5m左右才能使分离度达到R=1.5,组分达到完全分离。（三）、载气及流速选择1.载气对柱效的影响：主要表现在组分在载气中的扩散系数Dm(g)上，它与载气分子量的平方根成反比，即同一组分在分子量较大的载气中有较小的Dm(g)。根据速率方程：（1）涡流扩散项与载气流速无关；（2）当载气流速u小时，分子扩散项对柱效的影响是主要的，因此选用分子量较大的载气，如N2、Ar，可使组分的扩散系数Dm(g)较小，从而减小分子扩散的影响，提高柱效；（3）当载气流速u较大时，传质阻力项对柱效的影响起主导作用，因此选用分子量较小的气体，如H2、He作载气可以减小气相传质阻力，提高柱效。2.流速（u）对柱效的影响：从速率方程可知，分子扩散项与流速成反比，传质阻力项与流速成正比，所以要使理论塔板高度H最小，柱效最高，必有一最佳流速。对于选定的色谱柱，在不同载气流速下测定塔板高度，作H-u图。由图可见，曲线上的最低点，塔板高度最小，柱效最高。该点所对应均流速即为最佳载气流速。在实际分析中，为了缩短分析时间，选用的载气流速稍高于最佳流速。图1H-u曲线3.载气种类气相色谱用载气从Vandeemter公式可知，使用重载气（氮气、氮气）还是用轻载气（氢气、氦气），要根据具体情况作具体的分析，如主要是降低纵向扩散对柱效的影响，即降低载气的扩散系数，应使用重载气。但用重载气就要延长分析时间。用轻载气虽然会影响纵向扩散而降低柱效，但是也可以降低气相的传质阻力，有利于提高柱效，而且可以缩短分析时间。对TCD来说更应该使用轻载气。近年在用FID进行检测时多用轻载气。4.载气流速对柱效的影响从Vandeemter公式知道，每一支色谱柱都有一个最佳流速点，在此流速下柱效最高。最佳流速是，B和C是纵向扩散项和传质阻力项。因此当固定液含量高时传质阻力项C增加，无论用什么载气都要小，如要用高载气流速，柱效就要降低。而当固定液含量低时，轻载气和重载气得到的柱效相近，但是轻载气可缩短分析时间。例如当使用10％的固定液时，使用氢气或氦气要比氮气的流速大3.5倍。5.载气流速对保留时间的影响载气流速和保留时间的关系决定于下式：对一个给定的色谱柱，当柱温不变时，对某一化合物其K’是一定的，所以该式可写成：式中C:常数；载气流速。所以保留时间和载气流速的倒数成直线关系。6.载气流速对定量结果的影响载气流速对热导检测器信号值的影响按一般检测器理论讲，TCD是浓度型检测器，载气流速对峰高或峰面积应该没有影响。但是实际上载气流速对峰高或峰面积有很大的影响，这是因为当流速快时，热传导未达平衡时被分析物就被洗脱出热导池。载气流速对其他检测器信号值的影响载气流速对FID，ECD，FPD检测器信号值都有不同程度的影响，如FID要使用三种气体（如氮气、氢气和空气），它们的流速都对信号有影响，一般情况下氢气流速:氮气流速=1:1左右，空气流量应大于氢气流量约5～10倍。（四）、固定液及其配比又称为液担比。固定液的选择基本原则相似相溶原则固定液和被分离物分子间的特殊作用力利用固定液的诱导力利用固定液的氢键力利用固定液的受质子力利用固定液的给质子力利用形成超分子的固定液利用混合固定液利用协同效应选择固定液从速率方程式可知，固定液的配比主要影响Csu，降低df，可使Csu减小从而提高柱效。但固定液用量太少，易存在活性中心，致使峰形拖尾；且会引起柱容量下降，进样量减少。在填充柱色谱中，液担比一般为5％～25％。（五）、柱温的选择重要操作参数，主要影响来自于K、k、Dm(g)、Ds(l)；从而直接影响分离效能和分析速度。柱温与R和t密切相关。提高t，可以改善Cu，有利于提高R，缩短t。但是提高柱温又会增加B/u导致R降低，r21变小。但降低t又会使分析时间增长。在实际分析中应兼顾这几方面因素，选择原则是在是在难分离物质对能得到良好的分离，分析时间适宜且峰形不托尾的前提下，尽可能采用较低的柱温。同时，选用的柱温不能高于色谱柱中固定液的最高使用温度（通常低20-50℃）。对于沸程宽的多组分混合物可采用“程序升温法”，可以使混合物中低沸点和高沸点的组分都能获得良好的分离。1、柱温的选择作用：影响色谱柱的选择分离和分析速度柱温：影响分离的最重要的因素。依据:样品待测物沸点，对分离的要求。原则:柱温通常要等于或略高于样品的平均沸点(分析时间20-30min)；对宽沸程的样品应用程序升温方法。2、温度控制方式：恒温和程序升温程序升温:色谱柱的温度按照组分沸程设置的程序连续地随时间线性或非线性逐渐升高，使柱温与组分的沸点相互对应，以使低沸点组分和高沸点组分在色谱柱中都有适宜的保留、色谱峰分布均匀且峰形对称。保留温度:在程序升温中，某一组份的浓度极大值流出色谱柱时的柱温，为该组分的保留温度。 柱温↑,使气相、液相传质速率加快(方程中C)，H（塔板高度）↓ 柱温↑,B↑，柱效↓。 柱温↓,分离↑，选择性↑,分析时间↑。原则：在使最难分离的组分有尽可能好的分离前提下，采取适当低的柱温，但以保留时间适宜，峰形不拖尾为度。固定液的熔点<TC>固定液最高使用温度宽沸程混合物：程序升温柱温高，分析快柱温高，分析快组分出柱子快柱温低，组分在柱子中有充分的时间进行分配平衡，组分色谱峰可拉开距离3、柱温的选择对分析结果的影响（1）、柱温对柱效的影响曾有人发现柱温对柱效的影响也呈双曲线的变化关系:式中T:热力学温度；A，B，C:常数。另外一些研究者发现理论塔板数的对数和温度倒数成直线关系。式中：n柱效；L柱长；U载气流速；DG扩散系数；△H溶解焓；R气体常数；T热力学温度。

（2）、柱温对保留值的影响柱温对相对保留值（α）的影响可用下式表示:式中a，b:常数，a可以是正值，也可能是负值；（3）、柱温对保留时间的影响物质在两相间的分配系数K和温度之间的关系为:式中：C:常数；△Hs：溶解焓；R:气体常数；T:热力学温度；由下式可以推引出保留时间对数和温度的倒数成直线的关系：lgtr=A+RT-1（4）、柱温对峰高、峰面积的影响气相色谱常用峰高或峰面积进行定量分析。一般讲柱温对峰高有很大的影响，因为柱温升高保留时间就会缩短，峰高自然就要升高，相反则峰高就要降低。而柱温对峰面积没有什么影响，这是因为当柱温升高时虽然峰高增加，但同时它的半高峰宽降低，二者的乘积（即峰面积）保持恒定。所以在定量分析时用峰面积定量不受柱温的影响。（六）、气化温度的选择气化温度的选择主要取决于待测试样的挥发性、沸点范围。稳定性等因素。气化温度一般选在组分的沸点或稍高于其沸点，以保证试样完全气化。对于热稳定性较差的试样，气化温度不能过高，以防试样分解。如气化室温度选择不当，会使柱效下降，当气化室温度低于样品的沸点时，样品气化的时间变长，使样品在柱内分布加宽，因而柱效下降。而当气化室温度升至足够高时，样品可以瞬间气化，其柱效恒定。在进行峰高定量时，气化室温度对分析结果有很大的影响，如气室温度低于样品的沸点时，峰高就要降低，所以在用峰高定量时，气化室温度要尽可能高于样品各组分的沸点，当然如果气化室温度太高会导致样品的分解。（七）、检测器温度的选择热导检测器温度一般要比柱箱温度高一些，以防被分析样品在检测器中冷凝，对TCD来说更重要的是检测室要很好地控温，最好控制在0.05℃以内。热导检测器温度升高时其灵敏度要下降。氢火焰离子化检测器（FID）的温度一般要在100℃以上，以防水蒸气冷凝，FID对控温要求不严格，不像TCD对温度那么敏感。电子捕获检测器（ECD），检测室温度对基流和峰高有很大的影响，而且样品不同在ECD上的电子捕获机理也不一样，受检测室温度的影响也不同．所以要具体的情况具体分析。（八）、进样时间和进样量的选择1.进样迅速（塞子状）——防止色谱峰扩张；2.进样量要适当：在检测器灵敏度允许下，尽可能少的进样量：液体样0.1～10ul，气体试样为0.1～10ml五、色谱法定性和定量分析引言GC分析对象:气化室温度下能成为气态的物质。分析过程:样品预处理→气相色谱分析预处理目的:去除样品中大量的水强烈吸附去除样品中极性很强物质去除样品中非挥发性物质样品预处理目的：为保护色谱柱、降低噪声、防止生成新物质（杂峰），需要在进样前对样品进行处理。1）水、乙醇和可能被柱强烈吸附的极性物质，——柱效下降，需除去。2）非挥发份——会产生噪声，同时慢慢分解，——产生杂峰。3）稳定性差的组分——生成新物质——杂峰。（一）、色谱法定性分析:保留值，标准样品1用已知纯物质对照定性在一定操作条件下，各组分的保留时间是定值。1）分别以试样和标准物进样分析——各自色谱图2）对照：如果试样中某峰的保留时间和标样中某峰重合，则可初步确定试样中含有该物质。3）在样品中加入标准物，看试样中哪个峰增加来确定未知物中成分。甲醇甲醇乙醇正丙醇正丁醇正戊醇2用经验规律和文献值进行定性分析当没有待测组分的纯标准样时，可用文献值定性，或用气相色谱中的经验规律定性。（1）．碳数规律在一定温度下，同系物的调整保留时间的对数与分子中碳原子数成线性关系，式中A1和C1是常数，n为分子中的碳原子数（n≥3）如果知道某一同系物中两个或更多组分的调整保留值，则可根据上式推知同系物中其它组分的调整保留值（2）．沸点规律同族具有相同碳数碳链的异构体化合物，其调整保留时间的对数和它们的沸点呈线性关系，即，式中A2和C2均为常数，Tb为组分的沸点（K）。根据同族同数碳链异构体中几个已知组分的调整保留时间的对数值，可求得同族中具有相同碳数的其他异构体的调整保留时间。3．根据相对保留值定性利用相对保留值定性比用保留值定性更为方便、可靠。在用保留值定性时，必须使两次分析条件完全一致，有时不易做到。而用相对保留值定性时，只要保持柱温不变即可。这种方法要求找一个基准物质，一般选用苯、正丁烷、环己烷等作为基准物。所选用的基准物的保留值尽量接近待测样品组分的保留值。4．根据保留指数定性保留指数又称Kovasts指数，根据所用固定相和柱温直接与文献值对照，而不需标准样品。保留指数:人为规定正构烷烃的保留指数为其碳数乘100,如正己烷和正辛烷的保留指数分别为600和800。其他物质的保留指数，采用两个相邻正构烷烃保留指数进行标定。测定：将碳数为n和n+1的正构烷烃加于样品x中进行分析，若测得它们的调整保留时间分别为tr'（Cn）tr'（Cn+1）tr'（x）且tr‘（Cn）＜tr’（x）＜tr'（Cn+1）则组分X的保留指数可按下式计算，［例］由图中测得调整保留距离为：乙酸正丁酯310.0mm，正庆烷174.0mm，正辛烷373.4mm，求乙酸正丁酯的保留指数。解已知n=7即乙酸正丁酯的保留指数为775.6。在与文献值对照时，一定要重视文献值的实验条件，如固定液、柱温等。而且要用几个已知组分进行验证。5双柱、多柱定性对于复杂样品的分析，利用双柱或多柱法更有效、可靠，使原来一根柱子上可能出现相同保留值的两种组分，在另一柱上就有可能出现不同的保留值。6利用检测器的选择性定性7与其他方法结合气相色谱与质谱、Fourier红外光谱、发射光谱等仪器联用是目前解决复杂样品定性分析最有效工具之一。（二）、气相色谱定量分析：GC分析是根据检测器对待测物的响应（峰高或峰面积）与待测物的量成正比的原理进行定量的。通过色谱图上的面积或峰高，计算样品中溶质的含量.1．峰面积测量方法峰面积:定量（l）对称形峰面积的测量——峰高乘半峰宽法A=1.065×h×W1／2（2）不对称峰面积的测量一峰高乘平均峰宽法A=h（W0.15＋W0.85）峰高0.15倍处的峰宽峰高0.85倍处的峰宽2．定量校正因子由于检测器对不同物质的响应不同，因而两个相同的峰面积并不一定说明两个物质的量相等！因此，在计算组分的量时，必须将峰面积A进行“校正”。原理：峰面积与组分的量成正比关系。但是同一检测器，不同物质具有不同的响应值一个混合物中有2种组分，量大小是w1,w2,由气相测的信号分别是S1，S2，如果w1=w2,那么S1≠S2如果A1=A2，w1≠w2,在计算时需将面积乘上一个换算系数，使组分的面积转换成相应物质的量，即：wi=fi′Ai定量校正因子:单位峰面积的组分的量fi′=检测器灵敏度Si与定量校正因子关系fi′=相对定量校正因子由于物质量wi不易准确测量，要准确测定定量校正因子fi′不易达到。在实际工作中，以相对定量校正因子fi代替定量校正因子fi′相对定量校正因子fi：样品中各组分的定量校正因子与标准物的定量校正因子之比。相对质量校正因子相对摩尔校正因子相对体积校正因子3．常用定量方法(1)归一化法:试样中各组分必须全部流出色谱柱，并在色谱图上都出现色谱峰。当测量参数为峰面积时，归一化的计算公式优点：简便、准确，当操作条件如进样量、载气流速等变化时对结果的影响较小。（2）外标法----校准曲线法。将待测组份的纯物质配制成不同浓度的标准溶液，浓度与待测组分相近，取固定量上述溶液色谱分析，得到标准样品的对应色谱图，以峰高或峰面积对浓度作图。在完全相同的条件下，试样分析，得该试样的响应讯号，由标准曲线即可查出百分含量。例：配标准物浓度微克/毫升测得峰面积000.10.0380.250.0880.50.1750.10.3121.50.41720.531未知样的峰面积0.232，代入，求得0.8微克/毫升特点：外标法简便，不需要校正因子，但进样量要求十分准确，操作条件也需严格控制。日常控制分析和大量同类样品的分析。(3)内标法:内标组分：人为加入测定样品的物质。要求样品中没有，响应情况与待测组分近似，出峰位置与待测组分接近的物质。内标峰：内标组分所出的峰。在标准溶液与样品中均加入相同体积内标溶液。Ai/Ais~Ci作图，计算组分含量。Ai/Ais~Ci/Cis（或mi/mis）作图，计算组分含量目的：选择一内标物质，以固定的浓度加入标准溶液和样品溶液中，以抵消实验条件和进样量变化带来的误差。第十章高效液相色谱一、概述高效液相色谱法亦称高压液相色谱法。高效液相仪与气相色谱的仪的区别在于其流动相是液体，其固定相采用十分细小的颗粒填充，高压泵输送流动相，然后由柱后检测器对流出物连续检测。具有分离效能高，应用广，可以分离高沸点、热不稳定的有机物及生化试样的特点。二、高交效液相色谱分析过程高压泵将贮液器中流动相溶剂经过进样器送入色谱柱，注入欲分离的样品时，流经进样器贮液器的流动相将样品同时带入色谱柱进行分离，依先后顺序进入检测器，记录仪将检测器送出的信号记录下来，由此得到液相色谱图。三、高效液相色谱发展历史1903年3月21日俄国植物学家茨维特（MichaelTswett，1872-1919）在华沙自然科学学会生物学会议上发表了“一种新型吸附现象及其在生化分析上的应用”研究论文，介绍了一种应用吸附原理分离植物色素的新方法，并首先认识到这种层析现象在分离分析方面有重大价值。1906年他在德国植物学杂志发表文章，首次命名上述分离后色带为色谱图，称此方法为色谱法（Chromatography）。1907年在德国生物学会年会上，展示过带有色带的分离柱管和纯化过的植物色素溶液。茨维特被世人公认为色谱创始人。1931年，Kuhn,Lederer，采用液固色谱分离结晶胡萝卜素（a和b异构体），同年制得叶黄素结晶。1938年从维生素B中分离出B6。1938年获诺贝尔化学奖。1957年戈雷(Golay)发表“涂壁毛细管气液分配色谱理论和实践”论文，首先提出毛细管速率方程，并第一次实现了毛细管气相色谱分离。1958年Stein和Moore研制出氨基酸分析仪，确定了核糖核酸的分子结构，氨基酸分析仪成为研究蛋白质和酶的重要工具。1972年，Stein和Moore获得诺贝尔化学奖。1968年出现商品化的高效液相色谱仪四、高效液相色谱的特点高效液相色谱具有以下特点，高压：高效液相色谱法工作压力高达20MPa～30MPa。高速：分离一个样品只需几分钟至几十分钟，仅为经典液相色谱的几十分之一。高效：一般气相色谱法的色谱往是数千塔板／米，高效液相色谱法的塔板数可达约3万塔板/米，使分离效率大大提高。高灵敏度：紫外光度检测器的检测限可达10－9g，荧光检测器的灵敏度可达10－11g。高效液相色谱与经典液相色谱比较经典液相色谱高效液相色谱色谱柱：柱长10~200cm，内径10~50mm色谱柱：柱长10~25cm，内径2~10mm常压或减压高压，40~50MPa填料颗粒大，75~600m填料颗粒小，2~50m柱效低，20~50/m柱效高，40000~60000块/m分析速度慢，1~20h分析速度快，0.05~1.0h色谱柱只用一次色谱柱可重复多次使用不能在线检测能在线检测高效液相色谱法与气相色谱法相比，分析对象不同、改变选择性的主要途径不同、分离效率不同、平衡时间不同、操作温度不同、仪器设备不同。GC：载气与组分无亲合力，体系和类型少，高温，柱外效应可忽略，缺点，只分析可气化的试样。HPLC：流动相对组分有亲和力，体系多，类型多，低温，可回收样品，柱外效应较大，缺通用型检测器，成本高。气相色谱法与高效液相色谱法比较

GCHPLC应用范围能气化、热稳定性好，且沸点低的样品；高沸点、挥发性差、热稳定性差的、离子型及高聚物样品不可检测。占有机物20%溶解后能制成溶液的样品。不受挥发性和热稳定性的限制；分子量大，难气化、热稳定性差及高分子和高聚物样品都可检测，范围更广，占有机物的80%。流动相惰性气体，不与待分离组分发生相互作用液体流动相种类多，与组分有相互作用，能改善分离的选择性气体，黏度小，无毒，好处理液体，黏度稍大，有毒，费用较高分离原理吸附和分配吸附、分配、筛析、亲和等进样方式需加热气化或裂解制成溶液色谱柱柱温：常温-300℃，常采用程序升温或恒温加热实现不同物质的分离柱温：常温，采取高压的操作方式克服流动相带来的阻力，常配有梯度淋洗装置提高分离度检测器选择型检测器：ECD,FPD,NPD选择型检测器：UVD,ECD,FD,PDAD通用型检测器：TCD,FID通用型检测器：RID,ELSD仪器组成溶质扩散系数大，柱外效应对分离结果的影响较小。溶质扩散系数小，死体积应尽量小，减小柱外效应的影响。速度＞0.5cm/s分子扩散可忽略；样品制备馏分不易收集制备样品简单，样品馏分收集比较容易，可大量制备液相色谱的分类液-固色谱法、液—液色谱法、离子交换色谱法和凝胶色谱法影响色谱峰扩展及色谱分离的因素涡流扩散项，纵向扩散项，传质阻力项：H=2λdp+2γDm/u+(ωmdp2/Dm+ωsmdp2/Dm+ωsdf2/Ds)u液液色谱传质阻力系数C=流动相传质阻力系数+固定相传质阻力系数流动相中的传质阻力项滞留的流动相中的传质阻力项二、高效液相色谱仪1、高压输液系统:构成：储液罐/高压输液泵/过滤器/压力脉动阻力器。储液罐：盛入溶剂，连过滤器，防止颗粒进泵。高压输液泵:密封性，输出流量恒定，压力平稳，可调范围宽，便于迅速更换溶剂及耐腐蚀。压力：150～350×105Pa。作用：将流动相在高压下，连续不断地送入色谱系统。高压目的：输送流动相及组分。保持渗透性和快速分析。装置：双活塞往复泵：稳定输出流量。2、进样系统作用：将试样引入色谱柱，对分离产生影响：柱外展宽（柱前和柱后展宽）。原因：进样系统、连接管道及检测器中存在死体积进样装置：隔膜注射进样器，高压进样阀：六通阀进样装置3、分离系统-色谱柱和流动相1.色谱柱作用：分离。材料：内部抛光不锈钢管。外型：内径：4mm～5mm，柱长：10cm～50cm高效：填料粒度小：5~10μm。塔板数：7000～10000。固定相要求：耐高压。基体：实心玻璃珠多孔活性材料。2.流动相（1）要求：针对分离组分有良好的选择性，与固定相不溶，对检测器有适当的响应，粘度适宜，化学稳定性，高纯度，安全（2）溶剂的特性参数：溶剂强度，溶解度，极性，选择流动相中溶剂的三角形图（3）流动相组成（4）梯度洗脱装置：梯度淋洗/洗提/淋洗（gradientelution）：将两种或两种以上不同性质但可以互溶的溶剂，随着时间改变而按一定比例混合，以连续改变色谱柱中冲洗液的极性、离子强度或pH等，从而改变被测组分的相对保留值。目的：提高分离效率，加快分离速度。分辨能力增加，峰形改善，为解决由k范围较宽的多组分复杂样品的分离，前面的分不开，后面的成分分离度太大，出峰慢，峰形差的问题4、检测系统检测器是用来连续监测经色谱柱分离后的流出物的组成和含量变化的装置。要求：灵敏度，噪音低、线性范围宽、响应快，死体小、池体积小于15微升。溶质性检测器:仅对被分离组分的物理或化学特性有响应；总体检测器:对试样和洗脱液总的物理或化学性质有响应:5、数据处理系统色谱参数的选择和设定;自动化操作仪器；色谱数据的采集和存储，并作“实时”处理；对采集和存储的数据进行后处理；自动打印，给出一套完整的色谱分析数据和图谱。常用色谱参数、操作程序，及各种定量计算方法存入存储器中，需用时调出直接使用。三、液相色谱法的主要类型（一）分配色谱1、分离原理：利用组分在两相中溶解度的差异进行分离。根据物质在两种互不相溶的液体中溶解度的不同，具有不同的分配系数。分配是在柱中进行的，使这种分配平衡可反复多次进行，造成各组分的差速迁移，提高了分离效率，从而能分离各种复杂组分。2、类型：据固定相状态分（1）液液色谱：固定相是通过物理吸附方法将液相固定液涂在载体表面。缺点：物理浸渍的液体固定相，由于流动相的溶解作用或机械作用易流失，导致柱上保留行为改变。（2）键合相色谱：固定相通过化学反应将有机分子键合到载体或硅胶表面上。按固定相与流动相极性分正相与反相色谱。3、流动相选择：常用溶剂：己烷/甲醇/乙腈/水/乙酸乙酯/乙醇/四氯化碳，常用溶剂的极性顺序：水(最大)>乙腈>甲醇>乙醇>四氢呋喃>正丁醇>己烷>煤油(最小)。二元或多元组合溶剂:调节流动相的极性或增加选择性，以改进分离或调整出峰时间4、固定相：载体+固定液（物理或机械涂渍法），缺点：系统内部压力大，易流失，不实用（1）表面多孔型固定相基体是实心玻璃珠，在玻璃球外面覆盖一层多孔活性材料，如硅胶、氧化铝、离子交换剂、分子筛、聚酸胺等。（2）全多孔型担体由氧化硅、氧化铝、硅藻土等制成的多孔球体；由直径为10nm的硅胶微粒凝聚而成；全多孔型固定相（二）、化学键合相色谱法（CBPC:BondedPhaseChromatography）化学键合固定相:化学反应通过化学键将固定液结合在担体表面。键合相色谱法：采用化学键合固定相的液相色谱法。固定相的结构：载体或担体（基质)+功能层。分类，化学键合相，反相键合相色谱，正相键合相色谱，离子对色谱和离子抑制色谱。a.硅氧碳键型：≡Si—O—C，b.硅氧硅碳键型：≡Si—O—Si—C，稳定，耐水、耐光、耐有机溶剂，应用最广；c.硅碳键型：≡Si—C，d.硅氮键型：≡Si—N。R,-C4,-C8,-C18,-C6H5,-CN,-NH2,-SO3H,-COOH,-NR4＋Cl。疏水基团如不同链长的烷烃（C8和C18）和苯基等。极性基团如氨丙基，氰乙基、醚和醇等。分离机制：分配+吸附（以LLC为基础）。特点：1）不易流失，2）热稳定性好，3）化学性能好，4）盛载载样量大，5）适于梯度洗脱1、反相键合相色谱（RP-HPLC）分离机制：疏溶剂理论，非极性的烷基键合:“分子毛”，有较强的疏水特性。流动相：极性溶剂。任务：分离含有极性官能团的有机化合物时，保留：分子中的非极性部分与固定相表面上的疏水烷基产生缔合作用，使它保留在固定相中；洗脱：被分离物的极性部分受到极性流动相的作用，促使它离开固定相，并减小其保留作用。分离：两种作用力之差，决定了分子在色谱中的保留行为。固定相：极性小的烷基键合相，C8柱，C18柱（ODS柱——HPLC约80%问题）。流动相：极性大的甲醇-水或乙腈-水，流动相极性>固定相极性，底剂+有机调节剂（极性调节剂）。例：水+甲醇，乙腈，THF。流动相极性与k的关系：流动相极性增加，洗脱能力降低，k增大，组分tR增加。出柱顺序：极性大的组分先出柱，极性小的组分后出柱。适用范围：非极性~中等极性组分（HPLC80%问题）的分离。反相键合相色谱法是高效