《益生菌活菌计数及代谢活力检测拉曼光谱法》

T/xx001—2023

益生菌活菌计数及代谢活力检测拉曼光谱法

1范围

本文件规定了益生菌产品活菌计数及代谢活力的术语和定义、描述了益生菌活菌计数方法和代谢活力

的拉曼光谱检测方法。

本文件适用于含益生菌产品的活菌计数及代谢活力检测。包括添加的植物乳杆菌、嗜酸乳杆菌、鼠李

糖乳杆菌、副干酪乳杆菌、罗伊氏乳杆菌、格氏乳杆菌、卷曲乳杆菌、乳双歧杆菌、长双歧杆菌、婴

儿双歧杆菌和嗜热链球菌等一种或多种菌种。

2规范性引用文件

下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成文本必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅

该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本

文件。

GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法。

T/CIFST009-2022食品用益生菌通则。

3术语和定义

下列术语和定义适用于本文件。

3.1

益生菌probiotics

一类当摄入足够量时，可对生物体（人和动物）健康有益的活的菌类微生物。

[T/CIFST009-2022，3.1]

3.2

活菌密度viableprobioticdensity

被测样品单位质量或体积内可增殖（可培养）的益生菌活菌总数。

3.3

代谢活力metabolicactivity

活细胞原位代谢活动的强度。为细胞原位代谢状态的一项指标。

4缩略语

下列缩略语适用于本文件。

CDR：碳-氘键峰值占比（C-Dratios）；

DNA：脱氧核糖核酸（DeoxyribonucleicAcid）；

MRS培养基：乳酸细菌培养基（ManRogosaSharpeMedium）；

MAL：代谢活力水平（MetabolicActivityLevel）；

MAL-HI：代谢活力异质性指数（MetabolicActivityLevelHeterogeneityIndex）；

PDMS：聚二甲基硅氧烷（Polydimethylsiloxane）。

5检测原理

利用重水（D2O）同位素标记时，具有代谢活力的细胞会同化氘（D）并代替氢（H）进行合成代谢，

使得细菌的脂类、蛋白质、DNA等生物质被氘化，所产生新的C-D键可被拉曼光谱灵敏检测到，并且

碳-氘（C-D）峰强度可反映细胞的代谢活力。基于细胞的代谢活力来进行活菌计数，即具有代谢活力

的细胞为活细胞。CDR为C-D键的峰值光谱强度除以C-D键和C-H键的峰值光谱强度之和，以量化C-H

键中D的替代程度，即碳-氘峰值占比；所述C-D键的光谱强度是指在拉曼位移波数范围（2040-

2300）cm−1范围内的拉曼光谱强度；C-H键的光谱强度是指在拉曼位移波数范围（2800-3100）cm−1范

围内的拉曼光谱强度。

6试剂和材料

1

DB42/T××××—××××

除非另有说明，本方法所用试剂均为分析纯，水为GB/T6682规定的三级水。

6.1基础试剂

生理盐水（0.85%NaCl，无菌），重水（D2O）（纯度99.9%），三级水[GB/T6682，4.3]。

6.2培养基

按照菌种类型配制，或选用相应商品化培养基。

MRS培养基粉末。

6.3芯片

氟化钙（CaF2）芯片（26mm×76mm），用于人工检测。

微流控计数芯片，带有高度为100μm的腔室。用于自动化检测的细菌计数。

微流控洗脱芯片，芯片由带有微结构的PDMS层与石英玻璃层组成，其中PDMS层的主要功能结构包

括：>1000个约0.3nL的微腔室，以及与其相连接的微通道。该芯片用于益生菌悬液的洗脱（主要指

去除悬液中的培养基、D2O等物质），及用于拉曼检测的样品干燥制片（主要指将洗脱后的益生菌单细

胞干燥于石英玻璃基底表面，用于后续拉曼成像）。用于自动化检测的样品洗脱和检测。

7仪器设备

7.1显微拉曼光谱仪：光谱分辨率不低于5cm-1，拉曼位移波数范围至少包含400cm-1-3200cm-1。需

配备50倍物镜、100倍物镜。

7.2恒温培养箱：温控范围包含36℃，波动<±1℃；

7.3振荡重悬器：转速覆盖1000-2800r/min；

7.4分析天平：感量0.1mg和0.01g；

7.5离心机：最大转速不低于5000r/min，有2-8℃制冷功能；

7.6显微镜：数值孔径（50倍物镜为0.5、100倍物镜为0.9），视场数26.5；

7.7真空进样装置（适用于自动化检测法）：真空度50mbar；

7.8注射泵（适用于自动化检测法）：流速范围包含2μL/min；

8检测要求和方法

8.1检测要求

8.1.1应选择同一批次三个独立包装的样品进行益生菌活菌计数及代谢活力检测，样品应按包装

标识要求的贮存条件进行贮存。

8.1.2益生菌活菌计数及代谢活力检测应在5小时内完成。

8.2检测步骤

8.2.1样品前处理

1制备样品孵育液：按照培养基产品说明书称取适量的MRS培养基粉末，加入相应量的

D2O充分振荡，待完全溶解后，再用0.22μm的针头过滤器过滤除菌，避光保存待用。

2固体样品：准确称取1g益生菌产品（要求益生菌总菌数≥108个/g）溶于0.85%无菌生理

盐水中，至终体积为10mL，振荡（3-5）min，制成样品匀液；

液体样品：将液体样品充分摇匀后用无菌枪头吸取1mL（要求益生菌总菌数≥108个/mL）置

于0.85%无菌生理盐水中，至终体积为10mL，振荡（3-5）min，700r/min离心5min取上清液，

制成样品匀液；

3将10μL样品匀液滴在血球计数板上进行样品浓度初步确认。

4若样品匀液浓度在108个/mL数量级范围，则为适宜浓度样品，可跳至步骤⑤；

2

T/xx001—2023

若样品匀液浓度≥109个/mL，吸取样品匀液1mL至装有9mL无菌生理盐水的试管中，制备1

：10样品匀液。按照此法依次制备10倍递增样品匀液，直至出现108个/mL数量级范围的样品匀

液作为适宜浓度样品。每次递增稀释一次，需更换无菌吸管或吸头；

若样品匀液浓度<108个/mL，应参考浓缩倍数取一份或多份样品匀液，通过离心进行富集（

5000r/min，4℃离心5min，去上清液，吸取2mL无菌生理盐水重悬菌体），保证得到的样品匀

液浓度在108个/mL数量级范围；

5分别取2份1mL的适宜浓度样品，1份为待测样品，1份为背景样品。将待测样品和背景样

品5000r/min离心5min，丢弃上清液；

6吸取1mL100%D2OMRS孵育液重悬待测样品菌体，厌氧孵育3h；背景样品无需添加

D2OMRS孵育液和厌氧孵育，直接进行下一步骤；

7用灭菌三级水洗涤（5000r/min，4℃离心5min，去上清液，吸取1mL灭菌三级水重悬，

5000r/min离心5min。重复三次），吸取适量三级水（0.1-1）mL重悬洗涤后的菌体，检测待用

；

8取1μL菌悬液滴在CaF2芯片上，风干10min，待样品干后进行检测；

9另取步骤④中适宜浓度样品10μL滴在血球计数板上待进行总菌计数。

8.2.2样品检测

通过显微镜50倍镜下对血球计数板上的菌悬液进行总菌计数，得到样品菌悬液的总菌数N。

通过显微拉曼光谱仪100倍物镜下分别采集待测样品和背景样品的单细胞拉曼光谱（去除异常光谱

后，拉曼光谱数量>200条），激光功率为（40-100）mw，曝光时间为（1-3）s，并采集背景拉曼光谱

扣除背景信号干扰。

8.2.3数据处理

1使用RStudio或Python软件去除异常光谱，包括信噪比差、基线不平以及C-D和C-H区域

有尖峰的拉曼光谱；

2使用RStudio或Python软件计算拉曼光谱的CDR；

3将待测样品和背景样品CDR由高到低进行排序；

4背景样品选取第2.5百分位数的数据定义为CDR_背景，计算第2.5百分数所在位置k的公式为

：k=2.5（n-1）/100，其中n为数据数量。如果k为整数，则第2.5百分位数就是数据中第k个数；

如果k不是整数，则第2.5百分位数为数据中第k+1个数；

5计算待测样品MAL值：MAL=CDR_样品-CDR_背景。

8.2.4结果计算

活菌密度的计算公式为：C=N×d×f

式中：

C—样品的活菌密度（个/g（mL））；

N—菌悬液的总菌密度（个/g（mL））；

d—活菌率；

3

DB42/T××××—××××

f—稀释/浓缩倍数；

푐

其中活菌率计算公式为：d=×100%

푛

式中：

d—活菌率；

n—采集视野中的总菌数；

c—采集视野中的活菌数；

其中，菌的死活情况根据MAL判定，公式为：MAL=CDR_样品-CDR_背景，MAL>0，认为是活菌，

MAL<0，认为是死菌。

式中：

MAL—细胞代谢活力水平。

益生菌活菌数计算结果以同一批次三个不同样品的益生菌活菌数平均值计算。

8.3自动化检测步骤

8.3.1细菌计数

1样品孵育液、适宜浓度样品匀液制备方法见8.2.1；

2移液枪取待测样品匀液10μL，注入微流控计数芯片进样口；

3将芯片放置于自动化显微拉曼光谱仪50倍物镜视野下，进行自动计数。

8.3.2样品洗脱制片

1分别取2份0.1mL适宜浓度样品匀液，1份为待测样品，1份为背景样品，进行5000r/min

离心5min，弃上清液；

2将待测样品用0.1mL100%D2OMRS培养基孵育液重悬菌体，厌氧孵育3h；背景样品无

需添加D2OMRS培养基孵育液和厌氧孵育，直接进行下一步骤；

3分别取待测样品和背景样品5μL加入微流控洗脱芯片的待测样品和背景样品点样口，之后

将芯片放入真空进样装置，抽真空2分钟，保证样品填充至芯片微腔室中；

4将连通有纯水相的导管连接芯片进样口，将连通有注射泵一端的导管连接芯片出口，注射

泵调节至抽取模式，速度2μL/min（同时处理多块芯片时可按比例增加），抽取10分钟；

5将芯片进样口处的导管由纯水相切换至乙醇相，继续开启注射泵抽取2分钟；

6揭下芯片上层PDMS结构，进行检测。

8.3.3样品检测

使用自动化显微拉曼光谱仪配套的检测软件，通过显微拉曼光谱仪的自动化分别采集待测样品和背景样

品的单细胞拉曼光谱（去除异常光谱后，拉曼光谱数量>200条），激光功率为40-100mw，曝光时

间为（1-3）s，并采集背景拉曼光谱扣除背景信号干扰。

8.3.4数据处理和结果计算

使用自动化显微拉曼光谱仪配套的分析软件，打开待测和背景样品采集的所有的单细胞拉曼光谱数据，

点击运行程序，得到活菌数和MAL以及生成相对应的图片。

8.4益生菌产品评价方法

8.4.1益生菌产品的菌原位活力评价

4

T/xx001—2023

以MAL值作为评价益生菌产品的原位活力的指标，MAL=CDR_样品-CDR_背景，MAL值越高，则活力

越高。

将采集的待测样品和背景样品的单细胞拉曼光谱，计算CDR值和MAL值。将背景样品的CDR值由

高到低进行排序，选取第2.5百分位数的数据定义为CDR_背景；用CDR_样品-CDR_背景得到每个细胞

的MAL值，并计算平均值。

M

代谢活力计算公式：MAL

n

式中：

∑푀—采集所有单细胞代谢活力之和；

n—单细胞个数；

8.4.2益生菌产品的菌代谢活力异质性评价

基于MAL值完成MAL-HI（MetabolicActivityLevelHeterogeneityIndex）值的计算；通过计算采集

的单细胞的MAL值的方差，取其平均值得到MAL-HI值，MAL-HI值越高，益生菌产品中的细胞异质

性越高，表明益生菌产品中的细胞代谢活性分布不均匀；MAL-HI值越低，益生菌产品中的细胞异质

性越低，表明益生菌产品中的细胞代谢活性分布均匀。

2

(푀‒푀퐴퐿)

细胞异质性计算公式：퐻퐼=푖

푛

式中：

푀푖—每个细胞MAL的值；

푀퐴퐿—MAL的平均值；

n—单细胞个数。

5

DB42/T××××—××××

附录A

（资料性）

检测方法的典型图谱示例

A.1样本

以市售的畜牧业用固体益生菌产品A和人用胶囊益生菌产品B为例进行实验。以上两种产品均为同一

批次三个独立包装的样品。

A.2样品前处理

1制备样品孵育液：按照产品说明书称取0.5224gMRS培养基粉末，加入10mLD2O，充分

震荡1-2min，用0.22μm的针头过滤器过滤除菌，避光保存待用。

2产品A和B分别称取0.1g，补加0.85%无菌生理盐水中至终体积为1mL，振荡3-5min，

制成1：10样品匀液；

3吸取1：10样品匀液0.1mL至装有0.9mL无菌生理盐水的试管中，制备1：100样品匀液。

按照此法依次制备10倍递增样品匀液；

4产品A和B分别分别取2份0.1mL适宜浓度样品，1份为待测样品，1份为背景样品，5000

r/min离心5min，丢弃上清液；

5将待测样品用0.1mL100%D2OMRS孵育液重悬菌体，厌氧孵育3h；背景样品无需添加

D2OMRS孵育液和厌氧孵育，直接进行下一步骤；

6用灭菌三级水洗涤（5000r/min离心5min，去上清液，加1mL灭菌三级水重悬，5000

r/min离心5min，重复三次），用0.1mL三级水重悬；

7取1μL菌悬液滴在氟化钙（CaF2）芯片上，风干10min，待样品干后进行检测。

A.3样品检测

A.3.1仪器检测条件

益生菌活菌计数及代谢活力检测拉曼光谱法仪器检测参考条件见表A.1。

表A.1益生菌活菌计数及代谢活力检测拉曼光谱法仪器检测参考条件

激光功率曝光时间针孔光栅

mwsμmmm

902125600

A.3.2样品拉曼光谱

待测样品和背景样品拉曼光谱见图A.2。

6

T/xx001—2023

图A.2待测样品和背景样品平均拉曼光谱

A.4数据处理

1使用RStudio或Python软件打开CDR脚本，在testpath<-''#opts$test_data#的单引号中输

入待测和背景样品的文件夹路径，全选后点击Run运行脚本（例如：testpath<-

'H:\\YL\\20230810-YL'#opts$test_data#）；

2在SNR_Result文件夹中打开CD_ratioTXT格式文件，选择待测和背景样品所有的细胞的

CDR值复制到excel表格中,并按大小进行排序；

3将背景样品的CDR值由高到低进行排序，选取第2.5百分位数的数据定义为CDR_背景，样品

A的CDR_背景=0.23，样品B的CDR_背景=0.21。

A.5结果计算

样品A和样品B益生菌活菌计数及代谢活力检测拉曼光谱法计算结果见表A.3。

表A.3样品A和样品B拉曼光谱法和传统方法计算结果

活菌血球板计拉曼光谱拉曼光谱法-活平板计数法-平板计数法-活

样品总细活细

样品率数-总菌数法-活菌数菌数均值活菌数菌数均值p值

平行胞数胞数

(%)（个/g）（个/g）（个/g）（CFU/g）（CFU/g）

平行

7068.578.30×1097.11×1086.50×108

1

平行

A7045.719.85×1098.44×1087.00±1.23×1087.40×1085.90±1.53×1080.47

2

平行

7456.766.35×1095.44×1083.80×108

3

平行

772127.271.30×1093.55×1081.65×108

1

平行

B691623.191.08×1092.50×1083.00±0.43×1083.53×1083.26±1.22×1080.79

2

平行

701622.861.29×1092.94×1084.61×108

3

7

DB42/T××××—××××

A.6益生菌代谢活力评价结果

按照8.4中益生菌代谢活力评价方法所述，根据代谢活力和细胞异质性计算公式计算产品A和产品B

的代谢活力和细胞异质性，结果见表A.4与图A.5。

表A.4样品A和样品B代谢活力和细胞异质性计算结果

样品样品平行代谢活力代谢活力均值细胞异质性细胞异质性均值

平行1-9.56×10-39.02×10-3

A平行2-1.02×10-2-9.60×10-36.20×10-34.53×10-3

平行3-9.05×10-35.68×10-2

平行1-1.80×10-37.96×10-3

B平行2-2.44×10-3-2.45×10-37.65×10-38.53×10-3

平行3-3.10×10-39.99×10-3

图A.5产品A和产品B代谢活力和细胞异质性示意图

8

《益生菌活菌计数及活性检测拉曼光谱法》

标准编制说明

一、制定标准的背景介绍

2001年联合国粮食及农业组织和世界卫生组织（FAO/WHO）提出，当摄入足够

数量时，对宿主产生健康益处的活性微生物称之为益生菌[1]。国际益生菌和益生元科

学协会（ISAPP）2021年对发酵食品定义为：通过所需的微生物生长和食品成分的酶

转化而制成的食品。其中特别指出，当发酵食品中含有确切的活益生菌时，才能标注

“含有益生菌”，并认为改善食品营养、调节人体免疫和肠道菌群、含有影响肠道和机

体功能的生物活性物质等，是其促进健康的潜在机制[2]。近年来，随着益生菌概念的

流行，益生菌的产品线已经从饮食补充剂扩展到临床治疗[3-6]。对于益生菌，不同菌

株的活细胞数是否符合标准是公众主要关心的问题。但是，由于国内益生菌行业长期

缺乏产品标准规范，导致益生菌产品质量良莠不齐，许多商品的说明书上并未标注关

于所含益生菌菌株的功效和产品中实际存在的活细胞数量(菌落形成单位[CFU/毫升])[7,

8]。因此，为规范愈发庞大的益生菌市场，避免益生菌产品市场规模不断扩大而出现

的虚假夸大宣传等乱象，对商业益生菌产品进行包括快速活菌计数、原位活力测试在

内的定性和定量评价的检测方法迫在眉睫。

然而，目前行业中广泛应用的方法有很大的局限性。对于益生菌产品的活菌计

数、活性检测等质检工作存在检测周期长、成本昂贵、混合益生菌产品检测效果差等

问题[9,10]。为提高益生菌产品的质量检测能力，本标准提出了拉曼光谱检测方法，

对益生菌产品的活细胞数和原位活力进行测定。该方法能够准确测定益生菌产品中的

活菌数和活性指标。该方法的建立为今后丰富我国益生菌产品的质控工作打下了一个

良好的基础，并为制定中国自己的益生菌标签法律法规以及检测方法提供可靠的数据

保障。

二、标准制定原则和依据

我国目前对益生菌活菌计数及活性检测方法研究还处于初级阶段，有很大的局限

性，有关测定方法的文献报道比较少，主要是色谱法和微生物法。

参考文献Mondol等人研究表明可以基于拉曼检测细胞活力，成功预测混合样品

1

中活菌占比，采用拉曼光谱法，经过大量的实验，建立了《益生菌活菌计数及活性检

测拉曼光谱法》[11]。

本标准的建立不仅弥补了我国益生菌行业质控方法的空白，同时对益生菌活菌计

数及活性检测的标准检测方法进行了补充，很好的解决了益生菌行业长期缺乏产品标

准规范，导致益生菌产品质量良莠不齐的问题。

三、起草过程

1.2021年10月，青岛生物能源与过程研究所单细胞中心承担的国家重大科学仪器研

制、国家重点研发计划等项目中，计划基于单细胞拉曼技术建立益生菌产品质检方

法。

2.2022年3月对方法标准申请立项，同月成立标准起草工作组，主要由青岛生物能源

与过程研究所单细胞中心、中国计量科学研究院、中国食品发酵工业研究院、青岛东

海药业和青岛星赛生物组成。

3.2022年6月标准起草工作小组召开第一次工作组会议并共同制定工作计划，包括分

工、调研相关资料、安排试验内容，确定了起草原则、标准适用范围、试验方案以及

验证方法准确性等标准所要求的试验内容。标准主要是益生菌活菌数和原位活力测定

方法研究，以益生菌固体饮料等常见保健食品为主要目标。

4.2023年6月，成立“益生菌单细胞技术联盟（A-STEP）”，由青岛能源所、中国食品

发酵工业研究院、热心肠研究院、星赛生物等联合发起，联盟成员单位有中国计量学

会生物计量专委会、江南大学、内蒙古农业大学、伊利集团、蒙牛集团、中粮营养健

康研究院有限公司、东海药业、青岛啤酒、国际香精香料公司IFF、诺维信

OneHealth、帝斯曼康萃乐、科拓生物、锦旗生物、恒天然、华大基因等。

5.2023年10月，工作小组计划组织标准全国范围内的征求意见。总计向包括省、自

治区、直辖市质量技术监督局，科研院所，益生菌产业领军企业的等20家以上单位征

询意见。

四、标准主要条款的说明

1.本标准分为6个部分：范围、规范性引用文件、术语和定义、试剂或材料、仪器设

备、检验要求和方法。

2

2.针对我国益生菌产品中添加各菌种的活菌数量情况，本文件适用于添加以下一种或

多种菌种的益生菌产品活菌计数及代谢活力检测，包括植物乳杆菌、嗜酸乳杆菌、鼠

李糖乳杆菌、副干酪乳杆菌、罗伊氏乳杆菌、格氏乳杆菌、卷曲乳杆菌、乳双歧杆菌

和长双歧杆菌。

五、工作内容及主要试验

本方法分样品预处理、样品重水（D2O）孵育、自动化采集单细胞拉曼图谱三大

步骤。进行了方法的准确度、方法的应用实例和方法的适用性等实验。

1.样品预处理

分别用单一菌株益生菌产品MPP-A作为测试样品。依据GB4789.35-2016益生菌

产品样品制备流程，在无菌环境下称取益生菌产品，溶于0.85%的生理盐水中，充分

振荡使其彻底溶解，制成1：10倍样品稀释液。将制备的悬浮液进行适当稀释以备待

用。孵育液制备流程为：按照产品说明书称取适量的MRS（ManRogosaSharpe）培养

基粉末，并取适量的D2O加入培养基中进行溶解，待溶解完全后，用0.22um的针头

过滤器过滤除菌，避光保存待用。

2.样品D2O孵育条件的确定

为使样品中的活细胞与D2O结合完全，对不同浓度的D2O和不同孵育时间条件进

行实验，当利用D2O同位素标记时，并考察孵育前后的细胞数，验证D2O孵育过程可

以标记样品中所有的活细胞且不会影响计数结果。

2.1D2O浓度的确定

用0%，25%，50%，75%和100%D2OMRS孵育液重悬菌体，厌氧孵育0，1，

2，2.5，3，3.5和4h。实验结果表明100%D2OMRS孵育3小时后，具有代谢活性细

胞与D2O的结合比例不再显著增加。此外，D2O浓度等于或小于75%时，需要更长的

孵育时间（4小时）才能达到饱和，而且低浓度D2O导致孵育时间延长，既降低了检

测效率，又会导致细胞有繁殖从而影响计数结果（表1）。

表1不同浓度D2O中不同孵育时间活菌标记率

/平均值

75%D2

时间0%D2O25%D2O50%D2O100%D2O

O

0h00000

1h00.11150.16570.2170.2289

2h00.26130.44870.58670.7776

3

2.5h00.34730.71730.81230.8745

3h00.39030.7450.88730.9388

3.5h00.39370.73530.8960.9536

4h00.45570.90370.93170.961

2.2孵育时间的确定

将结果较为接近的75%D2O和100%D2O孵育3小时，分别进行平板计数，由经

过统计学分析可以看出75%的D2O孵育0小时和3小时后平板计数，二者之间P值小

于0.05，即存在显著差异，所以75%D2O孵育3小时会影响计数结果。当D2O浓度为

100%，D2O孵育0小时和3小时后平板计数，二者之间P值大于0.05，即不存在显著

差异，后续实验均采用100%D2O孵育3h的条件。

表275%D2O和100%D2O孵育3小时的平板计数结果

浓度(CFU/g)P值

0h3h

1010

75%D2O1.27±0.10×102.81±0.09×10p<0.05

1010

100%D2O1.26±0.03×101.31±0.05×10p>0.05

3.基于单细胞拉曼技术对益生菌产品快速计数和原位活力检测

取3-10ul待测样品和背景样品分别加入到微流控芯片进样口，真空进样2min。然

后取100ulddH2O滴加到进样口，利用水的扩散除去培养基和细胞表面的D2O，得到

的样品进行拉曼检测；通过显微拉曼光谱仪自动化采集背景样品多个视野中的所有单

细胞（100-200个细胞），并采集背景拉曼光谱扣除背景信号干扰，获得的CDR（C-D

ratios）值用于拉曼光谱重水峰的归零，即为CDR_背景。通过显微拉曼光谱仪自动化采

集待测样品多个视野中的所有单细胞（100-200个细胞），并采集背景拉曼光谱扣除背

景信号干扰，自动化获得总菌数、活菌数、活菌率等指标。

设定MAL值作为评价益生菌产品的原位活力的指标，MAL=CDR_样品-CDR_背景，

MAL值越高，则活力越高。如果细胞的MAL≤0，被认为是死细胞;如果细胞的

MAL>0,则被认为是活细胞。

在三个平行样品的15个视野分别收集了129、70、73、63、78、54、49、70、

82、61、58、102、96、93和52个SCRS（Single-cellRamanspectrum）值。而

MAL>0的细胞分别有87、47、34、40、49、41、30、49、61、50、43、77、66、61

和33个（MAL>0被判为活菌）。另外，通过MAL计算，MPP-A的MAL平均值为

4

0.0266±0.0019。因此，基于单细胞拉曼技术，可检测出益生菌产品的“活菌率”

（67.84%）和“原位活力”（各细胞MAL值和MAL平均值），该“原位活力”可以通过

MAL值量化每个单细胞的代谢活力和产品整体活力。

图1自动化计数益生菌产品的显微镜视图

4.方法的准确度实验：

分别用单一菌株益生菌产品MPP-A和复合型益生菌产品CPP-A进行准确度实

验。

4.1细胞总数准确度验证

4.1.1MPP-A细胞总数

细胞总数准确度采用传统方法neubauer血球计数板进行验证，分别对计数室的

左上，右上，左下，右下和中间方格的细胞数进行统计，传统方法细胞总数的结果

为1.84±0.17×1010CFU/g，基于单细胞拉曼技术计算出的细胞总数为1.99±0.28×1010

CFU/g，与血球计数板结果接近（p>0.05）。结果见表3。

4.1.2CPP-A细胞总数

细胞总数准确度采用传统方法neubauer血球计数板进行验证，分别对计数室的

左上，右上，左下，右下和中间方格的细胞数进行统计，传统方法细胞总数的结果

为4.13±0.03×1011CFU/g，基于单细胞拉曼技术计算出的细胞总数为

5

4.09±0.07×1011CFU/g，与血球计数板结果接近（p>0.05）。结果见表3。

4.2活细胞数准确度验证

4.2.1MPP-A活细胞数

活细胞数准确度采用GB4789.35-2016中6.2.3乳酸菌计数中要求的平板计数法

进行验证，记录平板上的菌落数，乘以稀释因子，获得样品中的活细胞数。实验结果

表明平板计数法的活菌数结果为1.25±0.45×1010CFU/g，基于单细胞拉曼技术计算出

的活细胞的数量为1.35±0.13×1010CFU/g，与平板计数法结果接近（p>0.05）。结果

见表3。

4.2.2CPP-A活细胞数

活细胞数准确度采用GB4789.35-2016中6.2.3乳酸菌计数中要求的平板计数法

进行验证，记录平板上的菌落数，乘以稀释因子，获得样品中的活细胞数。实验结果

表明平板计数法的活菌数结果为3.84±0.02×1011CFU/g，基于单细胞拉曼技术计算出的

活细胞的数量为3.72±0.35×1011CFU/g，与平板计数法结果接近（p>0.05）。结果见表

3。

表3传统方法和基于单细胞拉曼技术细胞计数结果

传统方法（CFU/g）拉曼方法（CFU/g）p值

细胞总数1.84±0.17×10101.99±0.28×1010p>0.05

MPP-A

活细胞数1.25±0.45×10101.35±0.13×1010p>0.05

细胞总数4.13±0.03×10114.09±0.07×1011p>0.05

CPP-A

活细胞数3.84±0.02×10113.72±0.35×1011p>0.05

5.单细胞拉曼技术原位活力指标应用实例

产品X和产品Y是同一种婴儿双歧杆菌菌株，分别采用没有微胶囊化包被和微胶

囊化包被生产工艺进行加工。使用传统方法平板计数法分别计算产品X和产品Y的活

细胞数，工艺1为3.40±0.36×109CFU/g，工艺2为2.51±0.06×109CFU/g。为了测试产

品的稳定性，将不同工艺生产的婴儿双歧杆菌产品进行加速实验（37℃下储存10

天），然后再次基于传统方法计算出活细胞数，工艺1为3.57±0.25×107CFU/g，工艺

2为2.08±0.14×109CFU/g；根据加速实验前后的活细胞数计算产品X和产品Y的存活

率，分别为1.05%和82.76%（表3）。根据传统方法10天的加速实验表明，产品Y的

存活率要高于产品X。

6

表3平板计数法计算工艺1或工艺2生产益生菌产品的活细胞数

工艺加速前（CFU/g）加速后（CFU/g）存活率

产品X3.40±0.36×1093.57±0.25×1071.05%

产品Y2.51±0.06×1092.08±0.14×10982.76%

使用单细胞拉曼技术对益生菌产品X和产品Y进行原位活力检测。采集两种工艺

生产的益生菌产品的拉曼光谱后，得出产品X和产品Y的平均MAL值分别为0.0056

（MAL工艺1=0.0140-0.0084）和0.0172（MAL工艺2=0.0247-0.0075）（图2）。根据单

细胞拉曼技术原位活力结果表明，产品Y的原位活力高于产品X，与传统方法加速实

验结果一致，以上全部实验过程在5小时内完成，充分体现了该方法具有不依赖于培

养，活力检测迅速等优势。

图2基于单细胞拉曼技术产品X和产品Y原位活力检测

6.方法的适用性实验

以含益生菌的不同类型的产品为例进行实验，其中饮乐多为液体饮料，蒙牛酸奶

为半固体饮料，Lifespace胶囊益生菌产品为药品，宠儿香为畜牧业产品。活细胞数准

确度采用GB4789.35-2016中6.2.3乳酸菌计数中要求的平板计数法进行验证，记录

平板上的菌落数，乘以稀释因子，获得样品中的活细胞数。实验结果表明饮乐多平板

计数法的活菌数结果为7.50±0.15×108CFU/mL，基于单细胞拉曼技术计算出的活细胞

7

的数量为6.42±1.40×108CFU/mL，与平板计数法结果接近（p>0.05）；蒙牛酸奶平板

计数法的活菌数结果为4.87±0.69×108CFU/mL，基于单细胞拉曼技术计算出的活细胞

的数量为4.46±0.48×108CFU/mL，与平板计数法结果接近（p>0.05）。Lifespace胶

囊益生菌产品平板计数法的活菌数结果为1.83±1.24×108CFU/g，基于单细胞拉曼技术

计算出的活细胞的数量为2.04±1.01×108CFU/g，与平板计数法结果接近（p>0.05）；

宠儿香益生菌产品平板计数法的活菌数结果为5.90±1.53×108CFU/g，基于单细胞拉曼

技术计算出的活细胞的数量为5.75±1.01×108CFU/g，与平板计数法结果接近

（p>0.05）。结果见表4。因此该方法适用于液体饮料、半固体饮料、药品和畜牧业

益生菌产品的检测。

表4传统方法和基于单细胞拉曼技术活细胞计数结果

传统方法拉曼方法

p值

（CFU/g或CFU/mL）（CFU/g或CFU/mL）

饮乐多7.50±0.15×1086.42±1.40×108p>0.05

蒙牛酸奶4.87±0.69×1084.46±0.48×108p>0.05

Lifespace药丸1.83±1.24×1082.04±1.01×108p>0.05

宠儿香5.90±1.53×1085.75±1.01×108p>0.05

7.其他拉曼光谱仪器测试结果

以上所述检测实验结果均由星赛生物出品的自动化显微拉曼光谱仪检测得出，为

测试不同仪器检测结果的准确性，用日本HORIBA显微拉曼光谱仪（型号HR800）对

君小宝益生菌粉进行了测试。君小宝益生菌粉平板计数法的活菌数结果为

6.25±0.35×108CFU/g，基于单细胞拉曼技术计算出的活细胞的数量为6.79±0.77×108

CFU/g，与平板计数法结果接近（p>0.05）。因此该方法适用于其他满足性能要求的

显微拉曼光谱仪器进行检测。

六、实施标准建议说明

标准起草小组在本标准的制定过程中做了大量的工作，在标准的建立伊始就本着

边制定边应用的原则，自2015年建立本标准起中科院青能所单细胞中心已经与多家益

8

生菌企业建立合作关系，提供显微拉曼光谱仪和检测方法进行验证，并得到了客户的

广泛认同。通过客户的反馈，进一步印证了方法的可行性。

七、采用国际标准、国家标准、行业标准的程度及水平的简要说明

本标准参考国家标准GB4789.34、GB4789.35给出的规则起草。

本标准起草参考国际标准联合国粮农组织/世界卫生组织（FAO/WHO）《食品中

益生菌的评价指南》（GuidelinesfortheevaluationofProbioticsinFood：2002）、加拿

大《益生菌在食品中的使用》（TheUseofProbioticMicroorganismsinFood：2009）、

世界胃肠病学组织（WGO）《益生菌与益生元》的全球指南（Probioticsand

prebiotics：2023）。

八、与现行法律法规和标准的协调性

本标准为推荐性标准，与国家标准GB4789.34、GB4789.35相协调，不与现行法

律、法规和其他相关标准冲突。本标准适应了GB4789.34、GB4789.35含益生菌产品

的活菌总数的要求，但现行的行业标准缺乏对益生菌代谢活力指标的评价方法。因

此，本标准可为评价益生菌代谢活力提供强有力的方法支撑。

九、标准涉及的知识产权说明

本标准涉及专利为：一种基于单细胞拉曼技术的一体化益生菌质检方法（申请

号：202211426753.X），专利权人为：中国科学院青岛生物能源与过程研究所，专利

申请人为：中国科学院青岛生物能源与过程研究所，目前专利状态为：专利受理。专

利权人将作出专利实施许可声明，同意在公平、合理、无歧视基础上，免费许可任何

组织或者个人在实施该国家标准时实施其专利。

9

十、参考文献

1.FAO/WHO(FoodandAgricultureOrganizationoftheUnitedNations/WorldHealthOrganization)).,

ProbioticsinFood.Healthandnutritionalpropertiesandguidelinesforevaluation,2006.

2.Hill,C.,etal.,Expertconsensusdocument.TheInternationalScientificAssociationforProbioticsand

Prebioticsconsensusstatementonthescopeandappropriateuseofthetermprobiotic.NatRev

GastroenterolHepatol,2014.11(8):p.506-14.

3.Maladkar,M.,A.Yadav,andN.Save,LGGTM-Apromisingtherapyingastro-intestinalinfections.

IndianJournalofMicrobiologyResearch,2020.7(4):p.302-312.

4.Radulović,Z.,JelenaMiočinović,TanjaPetrović,SuzanaDimitrijević‐Branković,andViktorNedović,

TraditionalandEmergingTechnologiesforAutochthonousLacticAcidBacteriaApplication.In

EmergingandTraditionalTechnologiesforSafe,HealthyandQualityFood,2016.

5.Sniffen,J.C.,etal.,Choosinganappropriateprobioticproductforyourpatient:Anevidence-based

practicalguide.PLoSOne,2018.13(12):p.e0209205.

6.Floch,M.H.,Recommendationsforprobioticuseinhumans-a2014update.Pharmaceuticals(Basel),

2014.7(10):p.999-1007.

7.Ullah,M.,etal.,ViabilityandCompositionValidationofCommercialProbioticProductsbySelective

CulturingCombinedwithNext-GenerationSequencing.Microorganisms,2019.7(7).

8.Hathi,Z.,etal.,Methodologicaladvancesandchallengesinprobioticbacteriaproduction:Ongoing

strategiesandfutureperspectives.BiochemicalEngineeringJournal,2021.176.

9.Chen,T.,etal.,MicrobiologicalqualityandcharacteristicsofprobioticproductsinChina.JSciFood

Agric,2014.94(1):p.131-8.

10.Warzee,J.P.,etal.,SupranationalAssessmentoftheQualityofProbiotics:CollaborativeInitiative

betweenIndependentAccreditedTestingLaboratories.Microorganisms,2021.9(7).

11.Mondol,A.S.,etal.,Newperspectivesforviabilitystudieswithhigh-contentanalysisRaman

spectroscopy(HCA-RS).SciRep,2019.9(1):p.12653.

10

ICS11.040.70

Y89T/CSMT

团体标准

T/CSMT-00*—20xx

益生菌活菌计数及代谢活力检测拉曼光谱法

Detectionofviablecountsandmetabolicactivityofprobiotics

Ramanspectroscopymethod

（征求意见稿）

XXXX-XX-XX发布XXXX-XX-XX实施

中国计量测试学会发布

T/xx001—2023

益生菌活菌计数及代谢活力检测拉曼光谱法

1范围

本文件规定了益生菌产品活菌计数及