32基因工程的基本操作程序-2021-2022学年高二下学期生物考点（人教版2019选择性必修3）

3.2基因工程的基本操作程序考点精讲考点1：第一步：目的基因的筛选与获取1.在基因工程的设计和操作中，用于改变受体细胞性状或获得预期表达产物等的基因就是目的基因。根据不同的需要，目的基因是不同的，它主要是指编码蛋白质的基因，如与生物抗逆性、生产药物、毒物降解、工业用酶等相关的基因。培养转基因抗虫棉用到的目的基因是Bt抗虫蛋白基因。从相关的已知结构和功能清晰的基因中进行筛选是较为有效的方法之一。在培育转基因抗虫棉之前，用苏云金杆菌制成的生物杀虫剂广泛用于防治棉花虫害已有多年历史。研究表明，苏云金杆菌的杀虫作用与Bt基因有关。科学家不仅掌握了Bt基因的序列信息，也对Bt基因的表达产物——Bt抗虫蛋白有了较为深入的了解。因此Bt基因是培育转基因抗虫棉较为合适的目的基因。2.获取目的基因的方法有多种。常用PCR特异性地快速扩增目的基因。PCR是聚合酶链式反应的缩写，它是一项根据DNA半保留复制的原理，在体外提供参与DNA复制的各种组分与反应条件，对目的基因的核苷酸序列进行大量复制的技术。DNA模板、分别与两条模板链结合的2种引物、四种脱氧核苷酸、耐高温的DNA聚合酶。3.PCR反应的过程（如下图）【例1】下列不属于获得目的基因方法的是(

)A．从基因文库中获取B．利用人工合成法获得C．利用PCR技术大量获得D．利用农杆菌转化法获得【答案】D【详解】A、获取目的基因的方法之一是从基因文库中获取，A错误；B、获取目的基因的方法之一是利用人工合成法获得，B错误；C、获取目的基因的方法之一是利用PCR技术大量获得，C错误；D、农杆菌转化法是目的基因导入植物细胞的方法，而不是获得目的基因的方法，D正确。【例2】聚合酶链式反应（PCR）是一种体外迅速扩增DNA片段的技术。PCR过程一般经历下述若干次循环：90℃以上使模板DNA解聚为单链→50℃左右下复性（引物与DNA模板链结合）→72℃下引物链延伸（形成新的脱氧核苷酸链）。下列有关PCR反应过程的叙述中，不正确的是（

）A．变性过程中破坏的是DNA分子内碱基对之间的氢键，也可利用解旋酶实现B．复性过程中引物与DNA模板链的结合依靠碱基互补配对原则完成C．延伸过程中需要DNA聚合酶、ATP、四种核糖核苷酸D．PCR技术与细胞内DNA复制相比，所需要酶的最适温度较高【答案】C【详解】A、变性过程中破坏的是DNA分子内碱基对之间的氢键，使DNA双链得以打开，体内DNA复制利用解旋酶打开氢键，A正确；B、复性过程中引物与DNA模板链的结合是依靠碱基互补配对原则完成的，B正确；C、聚合酶链式反应（PCR）是一种体外迅速扩增DNA片段的技术，相当于DNA的大量复制。所以在形成新的DNA过程中，所需要的原料是四种脱氧核苷酸，C错误；D、PCR技术与细胞内DNA复制相比，所需要酶的最适温度较高，D正确。故选C。考点2：第二步：基因表达载体的构建1．构建基因表达载体的目的。(1)使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传给下一代。(2)使目的基因能够表达和发挥作用。2．基因表达载体的组成3．基因表达载体的构建的过程【例3】下图为基因表达载体的模式图，下列有关基因工程中载体的说法，错误的是（）A．基因工程的核心步骤是基因表达载体的构建B．基因表达载体的构建并不一定相同C．图中启动子位于目的基因的首端，是核糖体识别和结合的部位D．抗生素抗性基因的作用是作为标记基因，用于鉴别受体细胞中是否导入了目的基因【答案】C【详解】A、基因工程的核心步骤是基因表达载体的构建，A正确；B、不同基因表达载体的构建过程不一定相同，B正确；C、启动子位于基因编码区的上游，不是核糖体而是RNA聚合酶识别和结合的部位，C错误；D、抗生素抗性基因作为标记基因，用于鉴别受体细胞中是否导入了目的基因，D正确。故选C。【例4】下图为培育某种转基因抗虫植物的过程示意图。请回答下列问题：（1）实施基因工程的核心操作是_____________________________________________________，目的是___________________________________________________________________________。（2）图中将含抗虫基因的质粒导入农杆菌前，常用________处理农杆菌。一般情况下，不能用未处理的农杆菌作为受体细胞，原因是______________________________________________。（3）重组Ti质粒上的青霉素抗性基因是作为________________。含有重组质粒的农杆菌与愈伤组织在培养基2上共同培养的目的是_______________________________________________。由植物未成熟的胚获得愈伤组织的过程称为____________________。（4）培养基2与培养基3中所添加物质的主要区别是除了特定的、起筛选作用的物质外，还有____________________________________________________的不同。【答案】基因表达载体的构建

使目的基因在受体细胞内稳定表达并能遗传给子代Ca2+

未处理的农杆菌吸收质粒的能力极弱

标记基因

筛选得到含有重组质粒的愈伤组织

脱分化

生长素和细胞分裂素的浓度及比例【详解】（1）基因工程的核心操作时基因表达载体的构建；目的是使目的基因在受体细胞内稳定表达并能遗传给子代；（2）含抗虫基因的质粒导入农杆菌之前，常用Ca2+处理农杆菌获得感受态细胞；未处理的农杆菌由于吸收质粒的能力极弱，一般不用作受体细胞；（3）重组Ti质粒上的青霉素抗性基因是作为标记基因；含有重组质粒的农杆菌与愈伤组织在培养基2上共同培养的目的是筛选得到含有重组质粒的愈伤组织；由植物未成熟的胚获得愈伤组织的过程称为脱分化；（4）培养基2与培养基3分别用于筛选愈伤组织与培养愈伤组织，所以添加物质中，还有生长素与细胞分裂素的浓度比例不同。考点3：第三步：将目的基因导入受体细胞1．转化：目的基因进入受体细胞内，并在受体细胞内维持稳定和表达的过程。2．目的基因导入受体细胞的方法受体细胞类型方法说明特点植物细胞农杆菌转化法将目的基因插入农杆菌Ti质粒的T­DNA上→转入农杆菌→用农杆菌侵染植物细胞→将目的基因整合到植物细胞染色体的DNA上→目的基因表达经济、有效，适用于双子叶植物和裸子植物，尤其适用于双子叶植物花粉管通道法在植物受粉后，花粉形成的花粉管还未愈合前，剪去柱头→滴加DNA(含目的基因)，使目的基因借助花粉管通道进入受体细胞→目的基因表达简便、经济，我国科学家独创的一种方法动物细胞显微注射技术将含有目的基因的表达载体提纯→取卵(受精卵)→显微注射→注射了目的基因的受精卵，经胚胎早期培养后，移植到雌性动物的输卵管或子宫内→获得具有新性状的动物将目的基因导入动物细胞最为有效的方法微生物细胞Ca2＋处理法(感受态细胞法)用Ca2＋处理微生物细胞→感受态细胞→将基因表达载体与感受态细胞混合→在一定温度下促进感受态细胞吸收DNA分子简便、经济、有效【例5】下列有关将目的基因导入受体细胞的叙述，正确的是（

）A．将目的基因导入植物细胞采用最多的方法是农杆菌转化法B．原核细胞有繁殖快、遗传物质少等特点，可用于生产各种有生物活性的蛋白质C．基因枪法是将目的基因导入动物细胞中最为有效的方法D．可将含有目的基因的植物病毒作为载体导入Ca2+处理后的大肠杆菌细胞【答案】A【详解】A、将目的基因导入植物细胞采用最多的方法是农杆菌转化法，A正确；B、原核细胞没有内质网和高尔基体对蛋白质进行加工，故生产的蛋白质可能没有生物活性，B错误；C、显微注射技术是将目的基因导入动物细胞中最为有效的方法，C错误；D、植物病毒只侵染植物细胞，故可将含有目的基因的植物病毒作为载体导入植物细胞，D错误。故选A。考点4：第四步：目的基因的检测与鉴定1．分子水平检测。(1)通过PCR等技术检测受体细胞染色体DNA上是否插入了目的基因或检测目的基因是否转录出mRNA。(2)从转基因生物中提取蛋白质用相应的抗体进行抗原——抗体杂交，检测目的基因是否翻译成了蛋白质。2．个体水平鉴定。包括抗虫、抗病的接种实验，以确定是否有抗性及抗性程度。基因工程产品需要与天然产品活性进行比较等。【例6】科学家从某细菌中提取抗盐基因，转入烟草井培有成转基因抗盐烟本，培育过程如图1所示，表格所示为相关限制酶识别序列及切制位点。回答下列问题:限制酶BamHⅠBclⅠSau3AⅠHindⅢ识别序列及切割位点G↓GATCCCCTAG↑GT↓GATCAACTAG↑T↓GATCCTAG↑A↓AGCTTTTCGA↑A(1)表中Sau3AI酶切的DNA末端与BamHI酶切的DNA末端连接，该连接序列______________(填“能”、“不能“或“不一定能")被BamHI酶识别。质粒和目的基因构建重组质粒时，应选用图1中_______________________两种限制酶切割。(2)若通过PCR技术扩增抗盐基因，除了模板外还需提供__________________________________________________________________________________________________________等物质。(3)步骤①构建的基因表达载体，除图I中质粒所示结构外，还需具有____________________________________________及目的基因:步骤②中需先用______________处理农杆菌以便将重组质粒导入农杆菌细胞:步骤③中通常需要添加酚类物质，其目的是___________________________________________________________________________________。(4)基因工程中的检测筛选是一个重要的步骤。为筛选出导入了重组质粒的农杆菌，上图2表示运用影印培养法(使一系列培养皿的相同位置上能出现相同菌落的一种接种培养方法)检测基因表达载体是否导入了农杆菌。培养基B除了含有农杆菌生长繁殖必需的成分外，还必须加入_________________________________________________。从检测筛选的结果分析，不含目的基因的是菌落_________________(填数字)中的细菌。【答案】(1)不一定能

BamHI和HindⅢ(2)两种引物、酶（耐热的DNA聚合或热稳定性的DNA聚合酶）、原料（4种脱氧核苷酸）(3)启动子、终止子

Ca2+

吸引农杆菌移向烟草细胞，有利于目的基因成果转化(4)氨苄青霉素(或氨苄青霉素和四环素)

4和6【分析】图1所示为转基因抗盐烟草的培育过程，其中①表示重组质粒的构建过程；②表示重组质粒导入农杆菌；③表示采用农杆菌转化法将目的基因导入受体细胞；④表示植物组织培养。图2是筛选含有重组质粒的农杆菌的过程，培养基A和B中应该分别加入氨苄青霉素、四环素。表格中BamHI、Bcll和Sau3A三种切割位点有共同的序号GATC，Sau3Al酶能能切割BamHl、Bcll和Sau3AI三种切割位点。(1)若Sau3AI酶切的DNA末端，产生的末端是和，BamHI酶切的DNA末端，产生的末端是和，末端连接后为或者序列可能是GGATCC，也可能不是，不一定能被BamHI酶识别。为了防止目的基因的外源DNA片段和质粒自身环化，应选用BamHI和HindⅢ酶对外源DNA和质粒进行切割，这样使目的基因两端的黏性末端不同，可以防止自身环化。(2)在植物基因工程操作过程中，研究人员首先获取了抗盐基因（目的基因），并可以采用PCR（聚合酶链式反应）技术对目的基因进行扩增，该技术需要的条件有：两种引物、酶（耐热的DNA聚合或热稳定性的DNA聚合酶）、原料（4种脱氧核苷酸）、模板（目的基因的两条脱氧核苷酸链）。(3)基因表达载体的组成包括目的基因、标记基因、启动子、终止子和复制原点，步骤所使用的运载体中未标出的必需元件有启动子、终止子；步骤②中需先用Ca2+处理农杆菌，让细胞壁通过性增加，以便将重组质粒导入农杆菌细胞；为吸引农杆菌移向烟草细胞，有利于目的基因成果转化，通常在步骤③中通常需要添加酚类物质。(4)基因工程中的检测筛选是一个重要的步骤。常根据标记基因设计培养基，最终筛选出导入了重组质粒的农杆菌。图2表示影印培养法，分析可知，培养基B除了含有细菌生长繁殖必需的成分外，还含有氨苄青霉素(或氨苄青霉素和四环素)，能在此培养基上生长的农杆菌含有非重组质粒(有氨苄青霉素抗性基因)，不能在此培养基上生长的农杆菌只含有重组质粒(重组质粒构建破坏了氨苄青霉素抗性基因，农杆菌失去相应抗性)，与培养基A作对比可知，含有目的基因(重组质粒)的是4和6菌落中的细菌。考点5：实验：DNA片段的扩增及电泳鉴定（一）实验原理1．DNA片段的扩增。2．琼脂糖凝胶电泳（二）方法步骤2．混合。3．离心。4．反应。5．根据待分离的DNA片段的大小，用电泳缓冲液配制合适的琼脂糖凝胶，一般配制质量体积比为0.8%～1.2%的琼脂糖溶液，并加入适量的核酸染料混匀。6．将扩增得到的PCR产物与凝胶载样缓冲液(内含指示剂)混合，再用微量移液器将混合液缓慢注入加样孔。7．接通电源，根据电泳槽阳极至阴极之间的距离来设定电压，一般为1～5_V/cm。待指示剂前沿迁移接近凝胶边缘时，停止电泳。8．电泳结束后，取出凝胶置于紫外灯下观察和照相。（三）操作提示1．为避免外源DNA等因素的污染，PCR实验中使用的微量离心管、枪头和蒸馏水等在使用前必须进行高压灭菌处理。2．在向微量离心管中添加反应组分时，每吸取一种试剂后，移液器上的枪头都必须更换。【例7】进行PCR反应的具体实验操作顺序应为（）①离心使反应液集中的离心管底部②用微量移液器在微量离心管中依次加入各组分③按配方准备好各组分④进行PCR反应⑤设计好PCR仪的循环程序A．②③⑤④① B．①⑤③②④C．④②⑤③① D．③②①⑤④【答案】D【详解】使用PCR技术的具体操作顺序是：按配方准备好各组分→用微量移液器将各组分依次加入微量离心管中→离心使反应液集中在离心管底部→设计好PCR仪的循环程序→进行PCR反应。故选D。【例8】PCR技术是把某一DNA片段在酶的作用下，在体外合成许多相同片段的一种方法，利用它能快速而特异的扩增任何要求的目的基因或DNA分子片段；电泳技术则是在外电场作用下，利用分子携带的净电荷不同，把待测分子的混合物放在一定的介质(如琼脂糖凝胶)中进行分离和分析的实验技术，利用它可分离氨基酸、多肽、蛋白质、核苷酸、核酸等物质作亲子鉴定。图中是电泳装置及相应电泳结果。（1）电泳和叶绿体色素分离采用的纸层析法比较，后者使用