DB34T4878-2024包装饮用水中铜绿假单胞菌快速检测 胶体金免疫层析法

ICS13.160.20CCSICS13.160.20CCSX04安 徽 省 地 方 标 准DB34/T4878—2024包装饮用水中铜绿假单胞菌快速检测胶体金免疫层析法RapiddetectionofPseudomonasaeruginosainpackageddrinkingRapiddetectionofPseudomonasaeruginosainpackageddrinkingwater—Colloidalgoldimmunochromatographicassay2024073020240830安徽省市场监督管理局发布.前 言本文件按照GB/T1.1-2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起草。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。本文件由安徽省产品质量监督检验研究院提出。本文件由安徽省市场监督管理局归口。包装饮用水中铜绿假单胞菌快速检测胶体金免疫层析法范围本文件规定了包装饮用水中铜绿假单胞菌的胶体金免疫层析快速检测方法。本文件适用于包装饮用水中铜绿假单胞菌的快速检测。（GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法GB8538食品安全国家标准饮用天然矿泉水检验方法本文件没有需要界定的术语和定义。原理样品中的铜绿假单胞菌经滤膜过滤富集，超声处理提取DNA，以此为模板，设计经异硫氰酸荧光素（biotin）（PCR）FITC（T线（C线除另有说明外，所用试剂均为分析纯。水：试验用水符合GB/T6682：CMCC（B）10282（Tris）。（HCl）。（NaOH）。Tris-HCl溶液：称取Tris（5.3）6.06g，加水（5.1）40mL溶解，调pH至8.0，加水（5.1）定容至50mL。EDTAED-2•2H2（5.306（5.35mLNaH（.）pH8.0（5.1）50mL。TE1mLTris-HCl（5.7）100mL0.2mLEDTA（5.8）（5.1）100mL。4PCRDNA（dNTP）（MgCl2）（ddH2O）。Tris-HCl2020000。20h～24h（5.2）培养18h～201×108CFU/mL～5×108CFU/mL时，即制得铜绿假单胞菌菌悬液。引物：上游引物 5’-Biotin-GGCATTCAGATTGCTGCTCG-3’ ，下游引物5’-FITC-ACCGCCGTCAGAATCAGTTT-3’。PCR0.01g0.001。47mm，微孔径为0.45μm5000rpmpH）。检测将250mL待检水样通过孔径0.45μm的无菌滤膜（6.7）过滤，滤膜备用。以无菌水作为空白对照，以铜绿假单胞菌菌悬液（5.14）作为阳性质控对照。DNA提取将7.11mL的TE1.5mL5000rpm5minPCR扩增取7.22PCR（5.10）12.5μmol/L各0.8μL，ddH2O（5.11）8.9μL。混匀后进行PCR扩增，扩增条件为：95℃预变性5min；94℃变性30s，61℃退火30s，72℃延伸30s，共35个循环；72℃再延伸2min，得到扩增产物，备用。测定取7.3得到的扩增产物2μL，滴加在胶体金免疫层析检测试纸条（6.11）上，再滴加48μL上样缓冲液（5.12）于样品垫上，静置3min，观察T线和C线显色情况，进行结果判定。8结果判定无效控制线（C线）不显色，或空白试验检测线（T线）显色，或阳性质控试验检测线（T线）不显色，均判定无效。示意图见图1。阴性控制线（C线）显色，检测线（T线）不显色。阳性控制线（C线）与检测线（T线）均显色。参比标准检测结果为阳性时可采用参比标准GB8538进行确认。图1目视判定示意图图1目视判定示意图9性能指标检出限检出限为1CFU/250mL。灵敏度灵敏度≥95%。特异性特异性≥95%。假阴性率假阴性率≤5%。假阳性率≤5%。见附录A。附录A（资料性）定性方法性能指标计算方法性能指标计算表见表A.1。表A.1性能指标计算表样品情况a检测结果b总数阳性阴性阳性N11N12N1.=N11+N12阴性N21N22N2.=N21+N22总数N.1=N11+N12N.2=N21+N22N=N1.+N2.或N.1+N.2显著性差异（х2）2（12-21-1）2/（1221自由度（df）=1灵敏度（p+，%）p+=N11/N1.特异性（p-，%）p-=N22/N2.假阴性率（pf-，%）pf-=N12/N1.=100-灵敏度假阳性率（pf+，%）pf+=N21/N2.=100-特异性相对准确度，%c（N11+N22）/