AbMole-抑制剂、细胞因子、人源单抗在肿瘤类器官中的极致应用

AbMole——抑制剂、细胞因子、人源单抗在肿瘤类器官中的极致应用恶性肿瘤作为一种复杂且多变的疾病，一直是科学家们热衷研究和极力想攻克的重大难题。近年来，肿瘤类器官技术的出现，为癌症的研究开辟了一条全新的道路，让我们能够更深入地了解肿瘤的生长机制，并为个性化治疗提供了可能。肿瘤类器官技术简介癌症并不是一种单因素的疾病，在不同个体之间（瘤间）甚至同一个体内部（瘤内）都存在异质性。通过实验测试肿瘤对抗癌化合物的敏感性，以寻求适合每个个体的疗法就成为了目前肿瘤研究的热点之一。已有的一些技术，例如肿瘤细胞系的二维培养、来自患者肿瘤的异种移植等方法，但往往由于造模效率不高、难以复制体内异质性、基因组欠稳定、培养周期较长等原因，导致临床转化率较低。肿瘤类器官是一种从肿瘤组织中提取的癌细胞三维培养物，在基因组和功能方面与原始细胞相似，是在器官水平上对原代组织的病理特征进行模拟，可用于肿瘤生物学的研究和药物敏感性筛选。肿瘤类器官的培养肿瘤类器官的一般培养流程如图1所示，首先是获得肿瘤组织。随后用胰酶、胶原酶和DNA酶消化并用培养基重悬以获得单细胞悬液，不同肿瘤的消化时间长短是不同的。为去除未消化的细胞，还需要用特定孔径的细胞筛过滤悬液。接着转移至预冷的基底膜提取物（BME）中，随后将BME与肿瘤细胞的混合物滴在预热的悬浮细胞培养板底部，将培养板置于37℃培养箱中使BME凝固。在培养过程中常采用DMEM/F12作为基础培养基，因其含有较为丰富的营养因子，广泛用于增殖培养。除了基础培养基之外，还需随着肿瘤类型的不同而额外加入不同的细胞因子，但基本上都包括以下四种：生长因子主要是酪氨酸受体激酶的配体，包括表皮生长因子（Epidermalgrowthfactor，EGF）、成纤维细胞生长因子（Fibroblastgrowthfactor，FGF、神经生长因子（nervegrowthfactor，NGF）等，上述的三种生长因子可刺激上皮细胞增殖，促进肿瘤生长。图1肿瘤类器官的培养流程和药物敏感性筛选Wnt信号通路激活剂Wnt信号通路是一个复杂的蛋白质作用网络，在胚胎发育、癌症以及成年动物的正常生理过程中均发挥着重要作用。类器官领域中的Wnt激活剂主要是R-spondin1（RSPO1），RSPO1可以促进细胞的增殖与分化，从而支持类器官中多种细胞类型的形成和维持。TGF-β超家族抑制剂最常使用的TGF-β抑制剂是Noggin和A83-01，A83-01是一种有效的TGF-β的I型受体ALK5、ALK4和ALK7的抑制剂，A83-01可以抑制肿瘤类器官的增殖，有助于维持肿瘤类器官的稳定性和长期增殖能力，这对于研究肿瘤生长机制、评估药物疗效等具有重要意义。骨形态发生蛋白（BMP）是TGF-β超家族的一个重要亚类，Noggin通过抑制BMP信号通路的活性来维持肿瘤类器官中细胞的正常增殖和分化状态。ROCK抑制剂Y27632是类器官领域中使用最为普遍的Rho相关蛋白激酶（ROCK）的抑制剂，Y27632可以直接结合ROCK的催化位点以抑制其激酶活性，因此Y-27632可以间接抑制Rho介导的应力纤维的形成，因此Y-27632可以避免细胞因过度收缩而导致的死亡。Y27632还可以保持干细胞的干性，对于一些离体的组织，例如肿瘤组织可以通过保存在含有Y27632的溶液中以延长保存时间。在肿瘤类器官培养完成后还需要进行鉴定，可通过组织切片、HE染色、测序分析、免疫荧光等方法去验证肿瘤类器官与体内肿瘤的一致性以便于开展后续的药物筛选。肿瘤类器官的药物敏感性筛选肿瘤类器官因其与患者肿瘤组织具有高度相似性，所以它可作为一种模型来测试抗癌化合物的效果。通过将高通量与自动化等技术相结合，可以在相对短的时间内筛选出潜在的更有效力的药物，一定程度上也可以降低耐药性的出现（图2）。图2肿瘤类器官药物敏感性筛选的一般流程肿瘤类器官的药物敏感性筛选的总体流程是首选将要筛选的药物构成文库，一般是先配制特定浓度的药物母液，然后按照梯度稀释至96或者384孔板中。随后构建肿瘤类器官并将类器官转入孔板中，待其培养完成后按照设计好的布局加入药物，最后分析对应孔板中的细胞活力以采集不同药物的IC50、肿瘤生长抑制率等数据。药物文库的组成用于肿瘤类器官药物敏感性筛选的药物一般是一些常见的抗肿瘤抑制剂或者人源化单抗，并且还可以按照设计好的方案进行联合药敏测试。这里需注意的是由于类器官不具有完整的机体代谢能力和环境，因此待测药物一般选择其活性形式而非前体药物。常见的抗肿瘤抑制剂包括：Afatinib、Cisplatin、Dabrafenib、LY2157299、Selumetinib等，它们可以抑制DNA合成和特定的细胞生长信号通路如EGF、TGF-β等，进而促进肿瘤细胞的凋亡。人源化单抗是近些年关注度极高的肿瘤靶向产品，这种特殊设计的单克隆抗体可结合肿瘤细胞并通过多种方式发挥作用：阻断细胞生长相关信号通路、通过抗体依赖的细胞介导的细胞毒性（ADCC）、阻止肿瘤细胞的免疫逃逸、抑制血管生成等。在结合基因工程手段对抗体进行人源化后进一步降低了单抗的免疫原性，其治疗效果和副作用得到了进一步的改善，目前常见用于肿瘤药物敏感性筛选的人源化单抗主要有：用于免疫检查点抑制的纳武利尤单（Nivolumab，抗PD-1）、帕博利珠单抗（Pembrolizumab，抗PD-1）和曲美木单抗（Tremelimumab，抗CTLA-4），用于血管生成抑制的贝伐珠单抗（Bevacizumab），以及靶向治疗单抗如帕尼单抗（Panitumumab，靶向EGFR）、 帕妥珠单抗（Pertuzumab，靶向HER2）等。细胞活力检测以往对二维培养的细胞进行活力检测时常用的方法是MTT，但是对于三维体系细胞的检测而言上述方法由于渗透不佳、分布不均等问题导致准确度较差。增强型ATP细胞活力检测试剂盒采用生物发光法，即利用荧光素酶与其底物荧光素之间的反应产生荧光，该反应需要消耗ATP并且发光信号的强度与ATP的量呈正比（图3），由于ATP存在于所有代谢活跃的细胞中，而在死细胞中几乎不存在，因此是鉴定活细胞最合适的标志物之一。增强型ATP细胞活力检测试剂盒具有多种优点，包括：超高信号稳定性、超高灵敏度、超宽线性范围，目前已成肿瘤类器官研究领域细胞活力检测的最佳方案。图3增