蛋白质含量测定蔗糖酶活力测定及纯化方案的评价

专业：园艺姓名：尚静专业：园艺姓名：尚静学号：3140100506日期：2015年10月26日地点：生物实验中心装订线课程名称：生物化学实验（甲）指导老师：方祥年成绩：__________________实验名称：蛋白质含量测定、蔗糖酶活力测定及纯化方案的评价实验类型：同组学生姓名：沈杭宁、董文婷、蒋天佑一、实验目的和要求（必填） 二、实验内容和原理（必填）三、实验材料与试剂（必填）四、实验器材与仪器（必填） 五、操作方法和实验步骤（必填）六、实验数据记录和处理 七、实验结果与分析（必填）八、讨论、心得一、实验目的和要求1、学习Folin-酚法测定蛋白质含量的原理和方法2、掌握分光光度法制作标准曲线，准确测定未知样品的蛋白质含量3、掌握分光光度计的使用方法4、掌握酶活力测定的基本原理和方法5、学习酶的比活力的计算二、实验内容和原理1.Folin-酚法测定蛋白质含量Folin-酚测定法是在双缩脲反应的基础上发展起来的，Folin-酚试剂是由甲、乙两种试剂组成的。甲试剂由碳酸钠、氢氧化钠、硫酸铜和酒石酸钾钠组成，在碱性条件下蛋白质中的肽键与酒石酸钾钠铜盐起作用，生成紫红色络合物；乙试剂是由磷钼酸和磷钨酸、硫酸、溴等组成，在碱性条件下，铜-蛋白质络合物以及蛋白质中的酪氨酸残基（酚基）和色氨酸还原磷钼酸-磷钨酸试剂（乙试剂）产生深蓝色（钼蓝和钨蓝的混合物），其色泽深浅与蛋白质含量成正比。可用500nm波长比色测定，适于测定蛋白质含量0.05～0.5g/L.2、3,5-二硝基水杨酸比色法蔗糖酶（β-D-呋喃型果糖苷-果糖水解酶EC3.2.1.26），是一种水解酶。它能催化非还原性双糖（蔗糖）的1,2－糖苷键裂解，将蔗糖水解为等量的葡萄糖和果糖（还原糖）。因此，每水解1mol蔗糖，就能生成2mol还原糖。还原糖的测定有多种方法，例如：纳尔逊－索模吉（Nelson-Smogyi）试剂比色法，斐林试剂法等。本实验采用3.5－二硝基水杨酸法测定还原糖的含量。其原理是3.5－二硝基水杨酸与还原糖共热被还原成棕红色的氨基化合物，在一定范围内还原糖的量和反应液的颜色深度成正比。因此可利用分光光度计在520nm进行比色测定，求得样品中的含糖量。蔗糖酶活力单位(u)：蔗糖酶在室温(25℃）,pH4.5的条件下，每分钟水解产生1μmol葡萄糖所需的酶量(ml)。蔗糖酶比活力的计算：酶的比活力——为每毫克蛋白质所具有的酶活力单位数，一般用酶活力单位/mg蛋白质表示（比活力＝活力单位/mg蛋白）。酶的比活力在酶学研究中用来衡量酶的纯度，对于同一种酶来说，比活力越大，酶的纯度越高。利用比活力的大小可以用来比较酶制剂中单位质量蛋白质的催化能力，是表示酶的纯度高低的一个重要指标。注：*葡萄糖（分子量：180.1572）和果糖（分子量：180.16）为同分异构体。三、实验材料与试剂1、实验材料蔗糖酶提取的各步分离纯化样品Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ。可根据样品溶液的蛋白质含量高低作适当的稀释。2、实验试剂(1)Folin-酚测定法： ①标准蛋白质溶液：0.5g/L牛血清白蛋白 ②Folin-酚试剂（甲试剂、乙试剂）(2)3,5-二硝基水杨酸比色法： ①1g/L葡萄糖标准溶液(葡萄糖相对分子量198.17） ②5％蔗糖溶液 ③0.2mol/L乙酸缓冲液，pH4.5 ④3,5－二硝基水杨酸试剂（DNS）四、实验器材与仪器（1）恒温水浴（50℃、100℃）（2）可见光分光光度计、1cm玻璃比色皿（3）试管、试管架（4）移液管（5）微量移液器：200μl、1000μl五、操作方法和实验步骤1.Folin-酚测定法：（1）制备Folin-酚法蛋白质标准曲线取6支试管，编号1－6，按表1顺序依次加入各种试剂，并在分光光度计于500nm处测定光吸收值（A500nm值）。（2）各步分离纯化的蔗糖酶蛋白测定由于蔗糖酶提取、分离纯化的各个样品的蔗糖酶蛋白质含量较高，因此在测蔗糖酶提取分离纯化样品Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ的蔗糖酶蛋白质含量以前，可根据各样品溶液的蔗糖酶蛋白质含量高低不同作适当的稀释，以测定蔗糖酶蛋白质含量A500nm值在蛋白质含量标准曲线范围以内为宜。取13支试管，编号1～13，按表2依次加入各种试剂，并在分光光度计于500nm处测定光吸收值（A500nm值）。（3）绘制标准曲线并计算绘制标准曲线：以光吸收值（A500nm）为纵坐标，标准蛋白质含量（mg/L）为横坐标，在坐标纸上绘制蛋白质标准曲线。计算：蔗糖酶提取分离纯化的样品Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ稀释溶液的光吸收值（A500nm），查蛋白质标准曲线得蔗糖酶蛋白含量，再进行样品Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ溶液的最终蔗糖酶蛋白含量的计算。2.3,5-二硝基水杨酸比色法：（1）标准曲线的制作表31234567葡萄糖含量(umol)01.01.52.02.53.03.51g/L葡萄糖标准溶液（ml）00.20.30.40.50.60.7H2O（ml）21.81.71.61.51.41.33.5－二硝基水杨酸(ml)1.01.01.01.01.01.01.0将各管溶液混匀后，在100℃恒温水浴加热5min，取出立即用冷水冷却至室温蒸馏水（ml）7777777将各管溶液混匀A520nm按照表3加样，以葡萄糖含量（umol）为横坐标，A520值为纵坐标，制作葡萄糖浓度－吸光值标准曲线。（2）蔗糖酶的酶活力测定表4样品空白I(200倍稀释)Ⅱ(200倍稀释)Ⅲ(200倍稀释)Ⅳ(100倍稀释)编号123456789101112130.2mol/L乙酸缓冲液(ml)0.50.50.50.50.50.50.50.50.50.50.50.50.5蒸馏水(ml)1.00.950.80.50.950.80.50.950.80.50.950.80.5蔗糖酶液(ml)0.00.050.20.50.050.20.50.050.20.50.050.20.55％蔗糖溶液(ml)0.50.50.50.50.50.50.50.50.50.50.50.50.5保温时间立即混匀后，50℃保温10min3.5－二硝基水杨酸试剂(ml)1111111111111在100℃恒温水浴中加热5min蒸馏水7777777777777混匀A520根据测得的光吸收值（A520），查标准曲线得蔗糖酶活力，再进行样品Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ溶液的最终蔗糖酶活力的计算。六、实验数据记录和处理1.Folin-酚测定法：制备Folin-酚法蛋白质标准曲线表5Folin-酚法蛋白质标准曲线数据记录试管号123456A500nm00.1650.2700.4190.5130.639Folin-酚法蛋白质标准曲线（2）各步分离纯化的样品蛋白含量测定表6各步分离纯化的蔗糖酶蛋白测定样品空白I(1:20稀释)Ⅱ(1:10稀释)Ⅲ(1:5稀释)Ⅳ(1:1稀释)编号12345678910111213A500nm00.1100.2740.6240.2650.4280.9130.1820.6661.0390.3010.7631.492蔗糖酶蛋白含量（mg）00.07110.20190.48110.19470.32470.71160.12850.5146—0.22340.5919—每ml稀释液蛋白含量(mg)01.42201.00950.96223.89401.62351.42322.57002.5730—4.46802.9595—每ml稀释液蛋白含量平均值(mg)01.13102.31362.57153.71382.3,5-二硝基水杨酸比色法：（1）制备3,5-二硝基水杨酸法标准曲线表73,5-二硝基水杨酸法标准曲线数据记录试管号1234567葡萄糖含量(umol)01.01.52.02.53.03.5A520nm00.2450.3990.5180.8771.095数值过大舍去3,5-二硝基水杨酸法标准曲线蔗糖酶的酶活力测定表8蔗糖酶酶活力测定数据记录样品空白I(200倍稀释)Ⅱ(200倍稀释)Ⅲ(200倍稀释)Ⅳ(100倍稀释)编号12345678910111213A520nm00.3181.4951.6680.2361.3391.6840.3761.5621.7300.6431.7091.793葡萄糖含量（umol）01.1080——0.8838——1.2665——1.9964——蔗糖酶活力单位(u)00.1108——0.0884——0.1267——0.1996——稀释液中蔗糖酶活力(u/ml)02.216——1.768——2.534——3.992——稀释液中蔗糖酶活力平均值(u/ml)02.2161.7682.5343.992七、实验结果与分析结果：表9蔗糖酶各步纯化样品的纯度与酶活力比较体积(ml)蛋白浓度(mg/ml)总蛋白(mg)活力(u/ml)总活力u比活力u/mg样品Ⅰ20.022.620452.400443.28864.019.6样品Ⅱ16.523.136381.744353.65834.415.3样品Ⅲ9.512.858122.151506.84814.639.4样品Ⅳ16.13.713859.792399.26427.12107.5分析：由实验结果可得，随着逐渐的分离提纯，样品Ⅰ到样品Ⅳ的蛋白浓度降低，总蛋白含量也在降低，总活力也有所降低，而比活力则在逐步提高，表明蔗糖酶浓度在逐步提高，基本达到将蔗糖酶粗提纯的目的。样品Ⅱ的数据不是很符合上述结论，猜测与以下因素有关：每次实验间隔时间较长，酶活性及蛋白质有所损失，致使样品Ⅱ的数据存在问题。样品Ⅳ的比活力较高，表明蔗糖酶纯度较高，可能与做离子分析柱层析分离纯化蔗糖酶这一步时，装得的层析