第八章分子生物学研究方法下模板

一、原位杂交技术

原位杂交（Insituhybridization,ISH)

是用标记的DNA或RNA为探针，经放射自显影或非放射检测体系，在组织、细胞、间期核及染色体上对核酸进行定位和相对定量研究的一种手段。通常可分为RNA原位杂交和染色体原位杂交。第八章分子生物学研究方法(下)11/2/20241RNA原位杂交：

用放射性或非放射性标记的特异性探针与被固定的组织切片反应，若细胞中存在与探针互补的mRNA分子，两者杂交产生双链RNA，就可通过检测放射性标记或经酶促免疫显色，对该基因的表达产物在细胞水平上做出定性定量分析。11/2/2024211/2/20243染色体原位杂交技术是DNA探针与染色体上的DNA杂交，并在染色体上直接进行检测的分子标记技术。目前发展最快的是荧光素标记的原位DNA杂交技术，即荧光原位杂交技术（fluorescenceinsituhybridization,简称FISH技术），是利用与荧光素分子偶联的单克隆抗体与抗原标记的探针分子特异性的结合来检测DNA序列在染色体上的位置。染色体原位杂交11/2/20244染色体专一位点探针11/2/2024511/2/202461、酵母单杂交法转录因子cDNA酵母转录激活域酵母细胞表达载体导入转录因子表达顺式作用元件启动子报告基因报告基因是否表达？二、蛋白质及RNA相互作用技术11/2/202472、酵母双杂交系统转录激活因子DNA结合结构域转录激活结构域(bindingdomain,BD)(Activationdomain,AD)11/2/20248

将编码已知蛋白的DNA序列连接到能够表达转录因子DNA结构域的载体上，使之表达融合蛋白。靶蛋白DNA结合蛋白报告基因启动子DNA结合蛋白诱饵11/2/20249编码转录激活域的DNA待筛选cDNA文库片段猎物

猎物与诱饵共同在酵母细胞中表达，假如猎物载体中表达的蛋白有与靶蛋白作用的蛋白，这时转录因子的结构域与激活域就会靠拢，激活报告基因表达。

总之，通过判断报告基因是否表达，来分离与已知蛋白作用的新基因。10三、RNA干扰技术(RNAinterference，RNAi)

RNA干扰(RNAinterference，RNAi)技术利用双链小RNA高效、特异性降解细胞内同源mRNA，从而阻断体内靶基因表达，使细胞出现靶基因缺失的表型。11/2/202411放大作用DICER：核酸酶RNA诱导的沉默复合体（RNAinduciblesilentcomplex：

RISC)阻断靶基因表达11/2/202412RNAi的生物学功能：

RNAi的本质是一种由RNA介导的序列特异性的获得性免疫反应，是一种原始的基因组对抗外来基因表达的保护机制，是生物体在基因组水平上的免疫系统。11/2/202413线虫体内的RNAi

线虫中RNAi效应的检测（左面）两条线虫表现为绿色荧光蛋白（GFP）表达类型品系，该品系含有一个普遍性表达的GFP报告基因重组质粒（带有核内定位信号位点）。（右面）喂食表达争对GFP的dsRNA的细菌后，整个虫体的GFP信号消失。11/2/202414四、

基因芯片及数据分析

DNA芯片(DNAchip)，又称DNA微列阵(DNAmicroarray)，是指通过微电子、微加工技术在平方厘米大小的固体介质表面构建的微型分析系统，以实现对组织细胞中DNA、蛋白质和其他生物成分的快速、高效、敏感的处理与分析。1、基因芯片技术原理11/2/202415基因芯片的制作原理11/2/2024162、基因芯片的主要制作过程:1、经大规模PCR扩增获得独立cDNA插入片段；2、用机械手将PCR产物点到玻璃片了，变性固定；3、分别从不同组织或器官中分离mRNA，反转录生成cDNA；4、分别用两种不同的荧光染料标记两种cDNA；5、将标记后的cDNA与点好的芯片进行杂交；6、激光扫描芯片杂交结果，计算机处理；7、分析杂交数据。11/2/202417按基因芯片点阵的制备方法，基因芯片可以分为：原位合成芯片（syntheticgenechip）适用于寡核苷酸。根据预先设计的点阵序列在每个位点通过有机合成的方式直接聚合得到所要求的探针分子。DNA微阵列芯片（DNAmicroarray）多用于大片段DNA，有时也用于寡核苷酸，甚至mRNA。将合成好的探针、cDNA、基因组通过特定的高速点样机器人直接点在芯片上。11/2/202418根据基因芯片的用途可分为:基因表达分析芯片基因多态性分析芯片疾病诊断芯片发现新基因疾病诊断11/2/2024193、基因芯片数据分析11/2/2024201、凝胶滞缓实验电泳迁移率变动实验（electrophoreticmobilityshiftassay,EMSA)又叫凝胶阻滞试验(gelretardationassay)，是在体外研究DNA与蛋白质相互作用的一种特殊的凝胶电泳技术。它具有简单、快捷等优点，也是当前被选作分离纯化特定DNA结合蛋白质的一种典型的实验方法。

原理：DNA与蛋白的结合导致了电泳时迁移率的降低。五、其他分子生物学技术11/2/202421凝胶阻滞实验的基本原理图放射性标记的DNA由于同一种细胞蛋白质B结合，于是在凝胶电泳中移动速度变慢，在放射自显影中呈现滞后的条带ACB放射自显影****凝胶电泳放射性标记的DNA细胞蛋白质提取物蛋白质与DNA结合******BDNA-蛋白质结合物电泳迁移缓慢滞后带表明DNA与蛋白质结合用来判断是否存在与该DNA结合的蛋白。222、噬菌体展示技术噬菌体展示技术的原理：将编码“诱饵”的DNA片段插入到噬菌体基因组，并使之与噬菌体外壳蛋白编码基因融合。该重组噬菌体侵染宿主细菌后，复制形成大量带有外壳蛋白的