分子生物学方式检测结核杆菌对利福平耐药性研究进展

分子生物学方式检测结核杆菌对利福平耐药性研究进展摘要:最近几年对结核杆菌耐药机制的研究说明，rpoB基因是利福平耐药相关基因，耐药株通常发生特定位点基因突变，因此能够通过鉴定突变有无而评估其利福平耐药性，本文对这方面研究做一简要综述。结核病至今仍是世界上一个严峻的公共卫生问题，估量目前全世界每一年有800万新病例发生，290万人死于结核病，是现今单一致病菌致死的最要紧死因。近十几年来结核病疫情呈现全世界性明显上升趋势，产生缘故之一是耐药菌株的产生和播散。1990年我国结核病流行调查结果说明，我国临床分离株耐药率达％，初始耐药率％，复治继发耐药率％。利福平是一种要紧的抗结核药物，对利福平耐药常常致使化疗失败，且被以为是多耐药菌株的标志之一。因此初期迅速对结核患者利福平耐药性进行鉴定十分重要。现将有关研究进展做进一简要综述。传统方式依托直接或间接含药培育进行结核分支杆菌利福平耐药性鉴定，这是体外结核杆菌耐药性的直接证据，而且能够了解其对利福平耐药程度。但各实验室间所用培育基不同，检测方式不同，结果判定标准不一，致使结果报告不同，而且由于结核分支杆菌本身属于缓慢生长菌，使得耐药培育耗时长，通常需8～12周，不能知足现代短程化疗需要。最近几年进展起来的应用BACTEC460TB系统进行结核杆菌快速培育及药敏测定能够大大缩短结果回报时刻，但此法成立在培育方式基础上仍需数天出结果，加上仪器试剂昂贵，有放射性污染等，限制了临床普遍应用。1利福平耐药基因的研究关于结核杆菌利福平耐药机制一直存在三种假设，膜通透性改变、耐药质粒介导及染色体组基因突变（耐药性有关基因），其中已证明耐药基因突变与利福平耐药有紧密关系。关于细菌利福平耐药基因研究第一在大肠杆菌取得重要冲破。第一发觉利福平耐药的大肠杆菌其RNA聚合酶有突变而且只发生在β亚单位上，并推知产生这种β亚单位突变的基因位点相接，进一步对基因研究取得了大肠杆菌野生株编码RNA聚合酶β亚单位基因（rpoB）序列，并发觉耐利福平的大肠杆菌有rpoB基因突变。由于编码RNA聚合酶基因在细菌进化中呈高度序列保守性，依照对大肠杆菌利福平耐药基因的研究资料，Telenti[1]第一对结核分支杆菌利福平耐药基因突变进行了全面研究，发此刻与大肠杆菌rpoB基因突变多发区（Ⅰ区）相应位点（511～533aa）的长69bp片段内，64/66耐药株有突变发生，而未见于56株利福平灵敏结核菌株。尔后许多研究都证明这一结果，并发觉发生于此区城内新的突变位点[2～5]。而Miller[6]做了如此一项研究，他应用致点突变技术造成编码rpoB基因531号氨基酸（参考大肠杆菌基因位点）碱基突变并将其导入利福平灵敏的耻垢分支杆菌株LRZZZ中，使之发生了表型改变，即由原先的利福平灵敏株转为利福平耐药，也证明rpoB基因突变是致使利福平耐药的唯一缘故。Williams[4]对一患者感染的结核杆菌株发生利福平耐药表型转换前后做了rpoB基因序列分析研究，证明表型发生改变后其耐药基因发生了改变。但ropB基因突变致利福平耐药详细机制目前还未十分明了。2分子生物学检测方式上述对结核杆菌利福平耐药机制研究取得的重要功效为运用分子生物学方式进行耐药性评估提供了坚实的理论依据，其技术线路大体上是在用PCR方式对rpoB基因突变集中区域扩增基础上，对扩增产物进行突变鉴定，归纳如下：直接顺序法对突变多发区城序列分析是鉴定突变的最直观靠得住的方式，能够准确判定突变的有无及突变性质，也是其它快速间接辨别方式的金标准。应用放射性同位素或荧光标记测序法，已发觉许多突变位点及不同的氨基酸置换。突变在511-533这一区域内发生率达95％以上，其中以531，526，533，516四个位点最为常见[1～5]。Williams研究了流行病学特点和结核杆菌利福平耐药突变性质之间的内在联系，以为突变位点及性质与耐药模式及程度，IS6110图谱及地位来源等无明显相关关系。但Taniguechi[5]有不同意见，他研究结果说明513，526，531位点的突变致使对利福平高度耐药而其他位点那么明显低度耐药或全然无耐药性。总之直接测序能够取得突变详细资料，还能够对新发觉突变进行鉴定，不足的地方是仪器试剂昂贵，操作复杂，本钱高，有放射性污染，不适于普遍推行应用。多聚酶链式反映-单链构象多态性分析法（PCR-SSCP）其原理为依照在非变性聚丙烯酰胺凝胶中相同长度单链DNA片段泳动距离的改变判定单个碱基变异。由于利福平耐药突变只在特定区域内发生，而通过PCR方式扩增这段基因，直接电泳判定突变有无，大大简化了突变分析操作。Telenti[1]最先评估了放射性同位素标记PCR-SSCP方式的结核杆菌rpoB突变中的应用价值。所有利福平耐药菌株均成功地被检测出来，证明此方式特异准确。它能够同时进行大量临床标本挑选，使结果回报时刻缩至48～72小时。目前国内外本方式的研究较多，并已有成功用于临床痰标本及脑脊液标本检测的报导[2,7,8]。SSCP方式为临床快速简便鉴定结核杆菌ropB基因突变开辟了新领域，尽管存在必然不足，如每次电泳均需有标准结核杆菌株对照及有时不同不易区分、不能辨别沉默突变[9]等，但仍不失为一种有普遍应用前景的方式。双脱氧指纹图法（dideoxyfingerprinting,ddF）在对PCR产和的进行ropB基因突变检测方式的研究中，Felmee应用了ddF法[9]，这种方式结合运用了双脱氧结尾终止法及SSCP法的原理，它将ropB基因片段复制产物做模板直接加入用于产生类似DNA测序产物的有放射性标记的不同长度的双脱氧结尾片段，再行SSCP，经放射自显影后得出针对不同突变的特异的ddF。如此，若是有ropB基因突变，在SSCP电泳中不仅能够从因单链构象改变产生的泳动距离不同在SSCP中得以辨别，同时由于其双脱氧结尾终止位点不同于标准株，双脱氧末段片段数量也不同而得以区分。Felmee检测出了有不同突变（其中包括了80％已报导的ropB突变）的所有多耐药菌株，每一突变均有特异的ddF。在与SSCP分析法的对照研究中，以为ddF方式能够克服SSCP结果受电泳条件、电泳时刻阻碍大，受突变性质（位点及突变碱基）阻碍大及不能区分出，在时刻和本钱上都有优越性，但未见有进一步临床应用情形的报导。异源双链形成法（heteroduplexformation,HDF）HDF可用于检测DNA单个碱基突变或缺失，原理为突变基因与无突变基因PCR扩增产物混合，变性后使其温度缓慢下降，部份可形成别离来源于突变与灵敏株基因的异源双链，同时有部份形成同源双链，电泳后可将二者区分开来，而且突变不同（如单碱基突变，插入、或缺失），形成的异源双链迁移距离也不同。Williams[4]用HDF法进行了结核杆菌利福平ropB突变检测的尝试，110株RFP耐药株经HDF检测取得多条带形，证明有异源双链形成，而灵敏株那么只形成一条同源双链，HDF法与DNA测序法符合率达100％。这种方式操作简便，判定容易，不需放射性标记，适合应用于临床，但有关报导较少。反向系列探针杂交法（Innolineprobeassay,LiPA）LiPA方式基于探针杂交原理，先设计合成一系列探针，覆盖整个ropB突变多发区，其中S系列探针针对野毒株序列，R系列探针含数个有常见突变序列的探针，还能够设计一个有种属特异性的探针，将这一系列探针按序固定于同一杂交膜上，在严格条件下与亲和素标记的PCR产物杂交，检测杂交信号，依照不同杂交带谱判定出突变有无及大致位置。这种杂交方式能够同时进行种属鉴定，检测试剂盒已有厂家生产，结果判定容易，特异性高，易于标准化。如Beenhouwer[10]应用此法对临床痰标本的检测中与药敏结果对照有97％（65/67）的符合率。最近有学者[11]应用此法同时对结核分支杆菌进行种属鉴定及PCR灵敏性测定，特异性达100％，对107株已知序列的结核杆菌临床分离株测定中，61株灵敏株全数显示灵敏型杂交带谱，203株耐药株除4株外均检测到突变带谱，误诊率下降到％。不足的地方是操作复杂，本钱较高。以上分子生物学方式对结核杆菌RFP耐药性检测应用中均有快速、准确，特异等优势，可在72h内报告结果，能够知足初期临床诊治需要，是结核杆菌RFP耐药性测定进展必然趋势。下一步研究重点是提高临床标本ropB基因扩增特异性（因其单拷贝存在于基因组中），技术条件标准化、标准化，和将耐药性诊断及种属鉴定同时进行的方式，使其能够成为直接应用于临床的有效方式。参考文献1Telenti,ImbodenP,MarchesiF,etal.Lancet,1993；341:647-6502TeletiA,ImbodenP,MarchesiF,etal.AntimicroAgentsChemother,1993；37:2045-20583KapurV,LiLL,IordanescuS,etal.JClinMicrobiol,1994；32:1095-10984WilliamsDL,WaguespackC,EisenachK,etal.1994；35:2380-23865TaniguichiH,AramakiH,NikadoY,etal.FEBS-microbiolLett,1996；144:103-1086MillerLP,CrawfordJJ,ShinnickTM.AntimicroAgentsChemother,1994；38:805-8117ScarpelliniP,BragliaS,BrambillaAM,etal.JClinMicrobiol,1997；5:2802-28068程绍基，严碧涯，马屿，等。中华结核和呼吸杂志，1996；19：333-3379FelmeeTA,LiuQ,Wh