第11章 遗传工程课件

第十一章遗传工程

利用转基因手段对生物进行人为改造的技术第11章遗传工程什么是遗传工程？

体外DNA重组技术：利用工具酶将外源片段和载体连接，导入生物体并使其稳定复制和传代的技术目的研究工作生物产品(生物反应器)改良物种(提高品质)基因治疗第11章遗传工程工具酶A.剪切酶类有目的有选择的把目的片段切开B.连接酶类将目的片段和载体相连C.其他工具酶修饰,加工等作用第11章遗传工程限制性内切酶II及其产生的3种不同末端5'突出的粘性末端3'突出的粘性末端平末端EcoRIEcoRVPstIPPPPPP第11章遗传工程同切酶和同粘酶同切酶:

识别相同的位点,但生成不同的末端.同粘酶:

识别不同的位点,但产生相同的粘性末端第11章遗传工程SmaI

5´...CCC^GGG...3´3´...GGG^CCC...5´XmaI

5´...C^CCGGG...3´3´...GGGCC^C...5´同切酶BamHI

5´...G^GATCC...3´3´...CCTAG^G...5´BglII5´...A^GATCT...3´3´...TCTAG^A...5´同粘酶Sau3A5´...^GATC...3´3´...CTAG^...5´第11章遗传工程连接酶及其对底物的要求:T4Ligase,EcoliLigase底物:自由5’末端和自由3’末端,5’末端带磷酸基团反应条件：Mg++，ATP存在第11章遗传工程聚合酶(polymerase):DNA聚合酶I,klenow片段,Taq,Pfu,末端转移酶外切核酸酶(exonuclease):exoIII,S1核酸酶,DNaseI脱磷酸酶(dephosphatase):碱性磷酸酯酶CIP磷酸化酶,激酶(kinase)逆转录酶(reversetranscriptase)RNaseH,RNaseA甲基化酶(methylase)其它工具酶第11章遗传工程载体及其构成基本要素能独立复制并稳定传代:复制起始点ori或自主复制序列ARS和着丝粒,端粒方便插入外源片段:单酶切位点选择标记:药物抗性报告基因:插入筛选标记易分离提取高产率（多拷贝）强启动子多宿主第11章遗传工程常用载体质粒(plasmid)，粘粒(cosmid)，噬菌体，噬粒(phagemid),病毒，PAC，YAC，BAC特殊用途的载体表达型载体，分泌型载体，穿梭载体第11章遗传工程宿主繁殖快,易于培养,能够快速得到产物对所携带基因的表达产物具有较高耐受性,具有克隆最多种基因的可能突变率低,能够稳定忠实的保存被克隆基因第11章遗传工程常用宿主大肠杆菌:繁殖快,易培养,易分离产物噬菌体:转化效率高,易于保存酵母:繁殖最快的真核生物,适于有蛋白质加工的基因表达第11章遗传工程lacZ第11章遗传工程

第11章遗传工程第11章遗传工程

第11章遗传工程第11章遗传工程第11章遗传工程如何提高克隆效率?提高插入片段和载体的比例尽可能采用粘端连接*载体脱磷以降低载体自连插入片段磷酸化改进转化条件第11章遗传工程问题:

有一外源片段用某种酶切,生成了5´突出粘性末端5´-GATC,但是载体上的单酶切位点只能生成下面这几种粘性末端:5´-CTAG5´-TCGA5´-TTAA应当采用怎样的策略来提高连接效率?第11章遗传工程不依赖于内切酶和连接酶的体外重组

位点专一性重组（依赖于短片段同源序列的重组）cosN,LoxP第11章遗传工程LoxPLoxPcreLoxPLoxP第11章遗传工程Transform+reportgenesubstrates第11章遗传工程第11章遗传工程第11章遗传工程新鲜组织研磨或匀浆RNA提取液总RNA过oligo(dU)柱洗脱mRNAAAAAAAAATTTTTTTTTAAAAAAAAAAAAAAAArRNAtRNAmRNA第11章遗传工程第11章遗传工程第11章遗传工程筛选DNA文库用标记的核酸作为探针用诱饵质粒筛选表达cDNA文库第11章遗传工程探针标记标记物：同位素标记：32P非放射性标记：荧光标记，生物素，dig(地高辛）等第11章遗传工程变性模板DNA随机6核苷酸引物，dNTP,某种标记dNTPDNAPolI5‘随机引物标记的DNA片段第11章遗传工程SynthesizeRadioactivePROBEPurifiedtempleteKlenow,randomprimerprobe第11章遗传工程第11章遗传工程第11章遗传工程第11章遗传工程REMOVEREMOVEInsertedDNAcodingProteinfordetectionGAL4-ADlacZbaitDNA第11章遗传工程InsertedDNAcodingProteinfordetectionGAL4-ADlacZbaitDNABaitDNABaitDNA第11章遗传工程PCR技术及其应用应用范围：检测和诊断（高灵敏度）基因克隆（eg:通过部分已知序列扩增未知目标片段第11章遗传工程第11章遗传工程第11章遗传工程第11章遗传工程第11章遗传工程第11章遗传工程其他常用分子生物学技术丙烯酰氨凝胶电泳（PAGE）脉冲电泳双向电泳Southern杂交northern杂交western杂交第11章遗传工程转基因动植物和基因治疗转基因动物：医学研究，生物制药转基因植物：改良品质，提高抗逆能力基因治疗：治疗药物无法根治的遗传性疾病第11章遗传工程iRNA作用原理第11章遗传工程

第11章遗传工程5´

CAUG

3´

mRNA

3´

GUAC

5´

AntisenseRNA反义RNA作用原理第11章遗传工程转基因植物实例转入成熟酶atRNA后,西红柿保存期延长至1个月第11章遗传工程基因治疗

利用人工载体携带基因转化人体细胞,植入遗传病患者体内后,外源基因表达产生活性产物,代偿先天缺失或损坏基因的功能,使得遗传病患者可以脱离日常药物治疗,健康生活.1990年美国首次对一名4岁的先天免疫缺陷患者进行基因治疗,获得成功第11章遗传工程血友病B