脂质体脂膜结构的测定 x射线小角散射检测法编制说明

《脂质体脂膜结构的测定X射线小角散射检测法》（征求意见稿）编制说明标准起草工作简况任务来源根据《上海市标准化协会关于下达2023年度第二批团体标准制修订项目计划的通知》（沪标协〔2023〕9号），上海市标准化协会下达了编制“脂质体脂膜结构的测定X射线小角散射检测法”的项目计划，由中国科学院上海高等研究院承担该标准的制定工作。目的与意义脂质体是由磷脂或类磷脂分子自组装形成的、具有双分子层结构的纳米囊泡。因其具有体内可降解、低免疫原性以及增加难溶性药物溶解度等优越性能，脂质体在药物递送、基因治疗、功效性护肤品等方面有着广泛的应用。我国对脂质体递送体系的研究起步相对较晚，但发展迅速，已有越来越多的企业及研发单位致力于脂质体纳米制剂的研究及工业化生产。对于脂质体药物，理解其处方和工艺制备方法所形成的特定结构，以及结构与药物疗效之间的构效关系是脂质体药物研发及产品质量控制的关键问题。例如，脂质膜结构的差异会影响药物的装载率、体内滞留时间以及药物释放速率。因此，在脂质体药物的特性分析和质量研究中，除了常规的检验分析方法外，还需要结合先进的分析技术，对脂质体药物的微观结构及其稳定性进行深入探究。X射线小角散射（SAXS）技术是一种表征物质微观结构的有效手段，可从纳米到微米尺度范围内获取样品全局结构参数和形状信息。利用SAXS技术可以定量表征脂质体的脂膜结构，得到脂质双分子层及其修饰磷脂层的厚度与分布。虽然SAXS技术暂未收载入各国药典中，但近年来随着新型纳米药物特性分析研究的不断深入，在国家药品监督管理局药品评审中心发布的多个纳米药物产品研究技术指南中，均推荐及鼓励生产企业采用SAXS方法进行产品相关理化性质表征及质量控制研究。应用SAXS技术可以获得样品体系内结构特征的统计平均值，测量结果具有相当的准确性、可靠性及稳定性。在研究和工业应用方面，国际标准化组织已发布了多个SAXS相关国际标准，内容涉及粒度分布与浓度检测等，但仍缺乏基于SAXS技术的脂质纳米药物结构检测方面的标准。国内外针对脂质体脂膜结构测定的标准化的X射线小角散射检测方法仍未建立，因此，亟需将该测试方法形成标准化的规范性文件，以确保检测结果的可重复性和再现性。这对于脂质体产品，特别是脂质体药物的研发与质量标准的建立，具有十分重要的意义。起草单位、起草人起草单位和参与单位本标准起草单位为中国科学院上海高等研究院。本标准协作单位包括：上海交通大学、中国科学院长春应用化学研究所、上海师范大学、西南科技大学、中石化（北京）化工研究院有限公司、国家药品监督管理局疫苗及生物制品质量监测与评价重点实验室、上海药品评审核查中心、赛诺普（苏州）科学仪器有限公司、安徽国科仪器科技有限公司、花安堂生物科技集团有限公司。主要起草人及其所作工作如下：主要起草人有李怡雯、李娜、刘广峰、宋攀奇、张建桥、李秀宏、滑文强、魏晓慧、门永锋、邹爱华、田强、唐毓婧、陆家海、叶宇翔、周一萌、宋良益、程薇、卢永杰。起草人员负责方法制定工作的组织、协调，相关资料的查询、收集，试验方法的确定、验证，标准文本及编制说明的撰写、修改。表1主要工作成员所负责的工作情况起草人工作职责李怡雯负责标准的编写、检测方法技术方案确定李娜负责标准的工作指导、组织协调刘广峰、宋攀奇、张建桥负责技术方案优化、验证数据的收集魏晓慧、卢永杰负责样品前处理条件的优化李秀宏、门永锋、邹爱华、田强、唐毓婧、陆家海、叶宇翔、周一萌负责标准的工作指导、标准规范化把关滑文强、宋良益、程薇负责方法验证主要工作过程（1）标准编制项目于2023年8月获得立项，成立标准编制工作组。（2）2023年9月至2023年10月，根据标准的立项建议，标准编制工作组查阅相关标准、文献等资料，在深入讨论基础上，形成了该标准检测方法技术方案。（3）2023年11月至2024年3月，标准编制工作组按照项目拟定的技术方案，对样品的前处理条件、检测系统条件等进行了优化试验工作。在国家蛋白科学研究（上海）设施BL19U2生物X射线小角散射线站上，使用符合本标准的技术方法，实现了脂质体脂膜结构的检测。（4）2024年4月至2024年6月，开展了检测方法的实验室间协同验证试验，由国家蛋白质科学研究（上海）设施BL19U2生物X射线小角散射光束线站、上海光源BL16B1X射线小角散射光束线站、赛诺普（苏州）科学仪器有限公司、安徽国科仪器科技有限公司4家单位/实验装置对该方法进行了验证。根据验证结果和建议，对本标准检测方法进行完善。（5）2024年7月至2024年8月，标准编制工作组完成标准的征求意见稿和编制说明，并提交给上海市标准化协会。标准编制原则和确定标准主要内容的依据标准的编制原则本标准按照GB/T1.1-2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起草，主要遵循以下原则：（1）建立的标准分析方法具有科学性、先进性和可操作性，易于推广使用；（2）标准内容符合国家法律、法规的有关要求，未与已有标准冲突。确定标准主要内容的依据本标准规定了利用X射线小角散射技术测定脂质体的脂膜结构，包括脂质双分子层及其修饰层的厚度与分布。在按照GB/T1.1-2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》要求的基础上，同时参考GB/T20001.4-2015《标准编写规则第4部分：试验方法标准》的有关要求，确定了本标准的主要内容应包括以下11个部分：范围、规范性引用文件、术语和定义、符号、方法原理、试样的制备和要求、检测系统和装置、检测步骤、检测数据分析、检测数据分析结果、检测报告。方法的验证情况基本情况为确保本标准的适用性、一致性、规范性和可操作性，标准起草工作小组组织了4个实验室/单位，包括国家蛋白质科学研究（上海）设施、上海光源、赛诺普（苏州）科学仪器有限公司、安徽国科仪器科技有限公司，利用多台同步辐射X射线小角散射装置和实验室X射线小角散射仪对脂质体样品进行了方法验证。验证情况-1：国家蛋白质科学研究（上海）设施BL19U2生物X射线小角散射线站基本情况国家蛋白质科学研究（上海）设施BL19U2生物X射线小角散射线站完成本标准中检测系统条件的优化、分析方法的实现和检测方法的验证,所使用的样品及检测系统信息如下：测试样品包括：盐酸多柔比星脂质体上市药物Caelyx（产品批号：KHZUQ01）;相匹配的缓冲溶剂（含10%蔗糖与组氨酸）;与Caelyx成膜配方及制备方法相一致的空白脂质体；山嵛酸银粉末（校准样品）。光源类型：同步辐射X射线光源实验选取X射线波长：0.103nmX射线通量：1.0×1012photon∙s-1样品到探测器距离：2667mm探测器型号：Pilatus2M(Dectris)样品池：石英玻璃毛细管，外径1.0mm，壁厚0.01mm曝光时间：1s曝光次数：20验证过程及结果根据标准文件描述的试样制备的浓度要求，对Caelyx测试样品进行浓度梯度检测后，排除了该样品原始浓度下粒子间的相互作用影响。根据标准文件描述的辅助性测试要求，采用动态光散射方法表征了Caelyx测试样品的粒径大小为90.3±1.5nm,多分散性指数为0.05±0.02。结合冷冻透射电镜技术表征了Caelyx测试样品的形貌，具体为单层脂质体，其内水相包封了药物晶体。根据标准文件描述检测系统与装置要求，完成了X射线散射的光路优化以及散射矢量的校准。根据标准文件描述检测步骤，完成测试样品的散射数据采集。图1检测步骤流程图（左）和测试样品散射图像（右）根据标准文件描述检测数据分析步骤，完成测试样品散射图像中无效像素单元的剔除、一维散射强度数据转化、散射本底扣减等，得到脂质体粒子的散射强度曲线。参考标准文件附录A，选择一种脂膜多层结构模型，其电子密度分布函数为高斯函数表示。根据样品结构特点，构建的多层结构依次为偶联于脂质体脂质双分子层内表面的PEG修饰层、脂质体脂质双分子层的内层亲水头部、脂质体脂质双分子层的疏水尾部、脂质体脂质双分子层的外层亲水头部、偶联于脂质体脂质双分子层外表面的PEG修饰层。冷冻透射电镜的表征结果显示，该脂质体内水相所包封的药物以束状结构的纳米晶体沉淀形式存在。因此，可在脂膜多层结构模型基础上，另外构建圆柱体形貌的药物模型，根据标准文件描述的检测数据分析步骤五，进行拟合优化求解，使得脂质体粒子的实测散射强度与利用模型计算的理论散射强度之差总和最小。通过此优化求解后的脂膜电子密度分布情况，参考现有技术，定义不同膜层的边界位置为该层电子密度衰减至最大值的10%位置处，得到测试样品的脂质双分子及其PEG修饰层的厚度与分布特征。图2测试样品的实验散射强度及模型拟合散射强度曲线图表2测试样品结构参数3.3验证情况-2：上海光源BL16B1X射线小角散射光束线站3.3.1基本情况上海光源BL16B1X射线小角散射线站完成本标准中检测方法的验证,所使用的样品及检测系统信息如下：测试样品包括：盐酸多柔比星脂质体上市药物Caelyx（产品批号：KHZUQ01）;相匹配的缓冲溶剂（含10%蔗糖与组氨酸）;与Caelyx成膜配方及制备方法相一致的空白脂质体；山嵛酸银粉末（校准样品）。光源类型：同步辐射X射线光源实验选取X射线波长：0.124nmX射线通量：2.0×1011photon∙s-1样品到探测器距离：1900mm探测器型号：Pilatus2M(Dectris)样品池：石英玻璃毛细管，外径1.5mm，壁厚0.01mm曝光时间：60s曝光次数：33.3.2验证过程及结果根据标准文件描述检测系统与装置要求，完成了X射线散射的光路优化以及散射矢量的校准。根据标准文件描述检测步骤，完成测试样品的散射数据采集。根据标准文件描述检测数据分析步骤，完成测试样品散射图像中无效像素单元的剔除、一维散射强度数据转化、散射本底扣减等，得到脂质体粒子的散射强度曲线。参考标准文件附录A，选择一种脂膜多层结构模型，并构建圆柱体形貌的内部包载药物模型，根据标准文件描述的检测数据分析步骤五，进行拟合优化求解，使得脂质体粒子的实测散射强度与利用模型计算的理论散射强度之差总和最小。通过此优化求解后的脂膜电子密度分布情况，参考现有技术，定义不同膜层的边界位置为该层电子密度衰减至最大值的10%位置处，得到测试样品的脂质双分子及其PEG修饰层的厚度与分布特征。图3测试样品的实验散射强度及模型拟合散射强度曲线图表3测试样品结构参数3.4验证情况-3：赛诺普（苏州）科学仪器有限公司3.4.1基本情况赛诺普（苏州）科学仪器有限公司完成本标准中检测方法的验证,所使用的样品及检测系统信息如下：测试样品包括：盐酸多柔比星脂质体上市药物Caelyx（产品批号：KHZUQ01）;相匹配的缓冲溶剂（含10%蔗糖与组氨酸）;与Caelyx成膜配方及制备方法相一致的空白脂质体；山嵛酸银粉末（校准样品）。光源类型：铜靶实验选取X射线波长：0.154nmX射线通量：2.0×107photon∙s-1样品到探测器距离：600mm探测器型号：Eiger2R1M(Dectris)样品池：石英玻璃毛细管，外径1.5mm，壁厚0.01mm曝光时间：60min曝光次数：33.4.2验证过程及结果根据标准文件描述检测系统与装置要求，完成了X射线散射的光路优化以及散射矢量的校准。根据标准文件描述检测步骤，完成测试样品的散射数据采集。根据标准文件描述检测数据分析步骤，完成测试样品散射图像中无效像素单元的剔除、一维散射强度数据转化、散射本底扣减等，得到脂质体粒子的散射强度曲线。参考标准文件附录A，选择一种脂膜多层结构模型，并构建圆柱体形貌的内部包载药物模型，根据标准文件描述的检测数据分析步骤五，进行拟合优化求解，使得脂质体粒子的实测散射强度与利用模型计算的理论散射强度之差总和最小。通过此优化求解后的脂膜电子密度分布情况，参考现有技术，定义不同膜层的边界位置为该层电子密度衰减至最大值的10%位置处，得到测试样品的脂质双分子及其PEG修饰层的厚度与分布特征。图4测试样品的实验散射强度及模型拟合散射强度曲线图

表4测试样品结构参数3.5验证情况-4：安徽国科仪器科技有限公司3.5.1基本情况安徽国科仪器科技有限公司完成本标准中检测方法的验证,所使用的样品及检测系统信息如下：测试样品包括：盐酸多柔比星脂质体上市药物Caelyx（产品批号：KHZUQ01）;相匹配的缓冲溶剂（含10%蔗糖与组氨酸）;与Caelyx成膜配方及制备方法相一致的空白脂质体；山嵛酸银粉末（校准样品）。光源类型：铜靶实验选取X射线波长：0.154nmX射线通量：2.0×107photon∙s-1样品到探测器距离：600mm探测器型号：Eiger2R1M(Dectris)样品池：石英玻璃毛细管，外径1.5mm，壁厚0.01mm曝光时间：60min曝光次数：33.5.2验证过程及结果根据标准文件描述检测系统与装置要求，完成了X射线散射的光路优化以及散射矢量的校准。根据标准文件描述检测步骤，完成测试样品的散射数据采集。根据标准文件描述检测数据分析步骤，完成测试样品散射图像中无效像素单元的剔除、一维散射强度数据转化、散射本底扣减等，得到脂质体粒子的散射强度曲线。参考标准文件附录A，选择一种脂膜多层结构模型，并构建圆柱体形貌的内部包载药物模型，根据标准文件描述的检测数据分析步骤五，进行拟合优化求解，使得脂质体粒子的实测散射强度与利用模型计算的理论散射强度之差总和最小。通过此优化求解后的脂膜电子密度分布情况，参考现有技术，定义不同膜层的边界位置为该层电子密度衰减至最大值的10%位置处，得到测试样品的脂质双分子及其PEG修饰层的厚度与分布特征。图5测试样品的