食品生物技术重点

第二章基因工程与食品产业基因工程：用人工的方法把不同的生物的遗传物质（基因）分离出来，在体外进行剪切、拼接、重组，形成基因重组体，然后再将重组体引入宿主细胞或个体中以得到高速表达，最终获得人们所需要的基因产物。基因工程操作的四个步骤：一.在供体细胞中用限制性内切酶切割基因，以分离出含有特定的基因片段或人工合成目的基因并制备运载体（质粒、病毒或噬菌体）二.把获得的目的基因与制备好的运载体用DNA连接酶连接成重组体三．把重组体引入宿主细胞四.筛选、鉴定出含外源目的基因的菌体或个体基因工程载体：这种在细胞内具有自我复制能力的运载目的基因进入宿主细胞的运载体。限制性内切酶：能在特定部位限制性地切割DNA分子的酶。在DNA重组技术中，限制性内切酶的主要用途：在特异位点上切割DNA，产生特异的限制性内切酶切割的DNA片段建立DNA分子的限制性内切酶物理图谱构建基因文库用限制性内切酶切出相同的黏性末端，以便重组DNA耐热DNA聚合酶：它具有依赖于聚合物5’-3’外切核酸酶活性，可用于：1.DNA测序2.聚合酶链式反映（PCR）对DNA片段进行体外扩增。末端转移酶：催化作用不需要模板，可以给一些DNA分子的3’-OH末端接上dA或dG，另些DNA分子的3’-OH末端接上dC或Dt,混合这些分子，可使同聚物尾部退火形成环状分子。其主要作用：1.给载体或cDNA加上互补的同聚尾2.DNA片段3’末端的放射同位素标记。碱性磷酸酯酶的主要作用：1.去除DNA和RNA的5’-磷酸基，然后在T4多聚核苷酸激酶催化下，用[ａ-32P]ATP进行末端标记，继而进行序列分析2.去除载体DNA的5’磷酸基，防止自我环化，降低本底，提高重组DNA检出率。理想基因工程载体的特征：1．能在宿主细胞内进行独立和稳定的DNA自我复制。在外源DNA插入其DNA之后，仍保持稳定的复制状态和遗传特性。2.易于从宿主细胞中分离，进行纯化。3.在其DNA序列中有适当的限制性内切酶单一酶切位点。4.具有能够直接观察的表型特征（有报告基因），在插入外源DNA后，这些特征可以作为重组DNA选择的标志。目前常见的基因载体有细菌质粒载体、农杆菌质粒载体、入噬菌体载体、柯氏质粒载体和病毒载体等质粒载体pBR322其大小为4363bp，含有两个抗生素基因（抗氨苄青霉素和抗四环素）；还有单一的BamHI、HindIII和SalI的识别位点，这三个位点都在四环素抗性基因内。pBR322可以保证这个质粒只在大肠杆菌中行使复制功能。PCR扩增法(利用多聚酶链式反应)反应过程：1.变性：将模板DNA至于95摄氏度高温下，使双链DNA的双链解开变成单链DNA2.退火：使反应体系的温度降低至55摄氏度左右，使得一对引物能分别与变性后的两条模板链相配对3.延伸：将反应体系温度升高到TaqDNA聚合酶作用的最适温度72摄氏度，然后以目的基因为模板，合成新的DNA链。一些改进的PCR扩增法：逆转录PCR：以RNA为模板，经逆转录获得与RNA互补的DNA链即cDNA，然后以cDNA链为模板进行的PCR反应。（构建CDNA的基础保证）锚定PCR：特别适合于扩增那些只知道一段序列的DNA.克服序列未知或未全知的障碍（该法适用于mRNA扩增，而不适用于基因组DNA的扩增，此法可以克服序列未知或未全带来的障碍）反向PCR:特别适合用于扩增已知序列两端的未知序列（用到2种酶）核苷酸序列测定的方法：化学降解法、酶促法（双脱氧终止法）、自动测序法、PCR测序新方法等酶促法：先将DNA分子用限制性内切酶切割成片段，然后用电泳依其长短不同分离，钝化单股片段，以32P标记其5’末端，并用以作为复制其互补片段的模板，在复制的过程中，利用从大肠杆菌提取的DNA聚合酶经过枯草杆菌蛋白酶处理而得的大片段，以复制互补单股DNA，从而求得其序列。目的基因与载体的连接（重组与克隆）黏性末端连接：共2种情况1、同一限制酶切位点连接2、不同限制酶切位点连接平端连接人工接头连接同聚物加尾连接重组体的筛选与外源基因的鉴定重组体的鉴定报告基因的检测法目的基因分子的杂交检测方法分子杂交技术：为了从分子水平鉴定目的基因是否已经整合到受体细胞中，是否转录，是否表达，经常用到基因探针杂交技术，即用已知基因片段（往往是目的基因片段）制作的探针，与待测样品的基因片段进行核酸分子杂交，从而判断两者的同源程度。点杂交：将待测的DNA或RNA或细胞裂解物变性后直接点在硝酸纤维素膜上，不需限制性内切酶进行酶切，即可与探针进行杂交反应。Southernblot：目前被认为是最经典和应用最广泛的杂交方法。根据基因探针与待测DNA限制酶的酶解片段杂交带谱，可以直接确定是否已经转入受体细胞并整合到受体细胞的基因组中。Northernblot：基本原理大致与上相同，只是检测对象是RNA。Westernblot:主要用于检测外源基因在转化细胞中的表达情况，即是否进行了翻译，产生了外源基因所编码的蛋白质。反义RNA：指有义DNA转录成的，与特异的靶RNA互补结合并能抑制靶RNA表达的一段序列。转录产生反义RNA的基因成为反义基因。反义RNA技术：是把一段DNA序列以反义方向插入到合适的启动子和终止子之间，然后把此基因构建体转化到受体细胞中去（通常用农杆菌转化的方法）。通过选择培养获得转化生物体的技术。反义基因技术的原理：反义基因转录生成的mRNA可以抑制具有同源性的内源基因的表达，用这种方法可获得特定基因表达受阻而其他不相关基因的表达不受影响的转基因植株。反义基因技术的特点：1.反义RNA可以高度专一地调节某一特定基因的表达，不影响其他基因的表达。反义基因的不同区段抑制效率不同。2.转化到植物中的反义RNA的作用类似于遗传上的缺陷型，表现为显性。所以被转化的植物材料不必为纯合体就可以表现相应的性状，从而避免了二倍体内等位基因的显隐性干扰。3.反义基因整合到植物的基因组中可独立表达和稳定遗传，后代符合孟德尔遗传规律4.反义基因不必了解其目的基因所编码的蛋白质结构，可省去对基因产物的研究工作5.反义基因不改变目的基因的结构，在应用上更安全基因工程在食品产业中的应用利用基因工程改造食品微生物：1、改良微生物菌种2、改良乳酸菌遗传特性3、酶制剂的生产利用基因工程改善食品原料的品质1、改善动物食品性状2、改造植物性食品原料3、提高植物性食品氨基酸含量4、增加食品的甜味5、改造油料作物6、改良植物食品的蛋白质品质7、改善园艺产品的采后品质利用基因工程改进食品生产工艺利用DNA重组技术改进果糖和乙醇生产方法改良啤酒大麦的加工工艺改良小麦种子贮藏的烘烤特性改善牛乳加工特性利用基因工程生产食品添加剂及功能性食品生产氨基酸生产黄原胶超氧化物歧化酶的基因工程应用于生产保健食品的有效成分第三章细胞工程与食品产业细胞工程的基本操作分为：1、无菌操作技术2、细胞培养技术3、细胞融合技术培养基的种类（1）按成分不同划分①天然培养基：非化学限定培养基②合成培养基：化学限定培养基（2）根据物理状态划分：①固体培养基：理想凝固剂应具备的条件：1，不被所培养的微生物分解利用2，在微生物生长的温度范围内保持固体状态3，凝固剂凝固点温度不能太低，否则将不利与微生物的生长4，凝固剂对所培养的微生物无毒害作用5，凝固剂在灭菌过程中不会被破坏6，透明度好，粘着力强7，配制方便且价格低廉常用的凝固剂有：琼脂、明胶和硅胶②半固体培养基：凝固剂含量比较少，培养基中琼脂含量一般为0.2％～0.7％。常用来观察微生物的运动特征、分类鉴定及噬菌体效价滴定等。③液体培养基：未加任何凝固剂。常用于大规模工业生产以及在实验室进行微生物的基础理论研究和应用研究。（3）按用途划分①基础培养基：最常用的是牛肉膏蛋白胨培养基。②加富培养基也称营养培养基，即在基础培养基中加入某些特殊营养物质制成的一类营养丰富的培养基。这些特殊营养物质包括血液、血清、酵母浸膏、动植物组织液等。加富培养基一般用来培养营养要求比较苛刻的异养型微生物，还可以用来富集和分离某种微生物。③鉴别培养基：用于鉴别不同类型微生物的培养基。主要用于微生物的快速分类鉴定，以及分离和筛选产生某种代谢产物的微生物菌种。④选择培养基：是用来将某种或某类微生物从混杂的微生物群体中分离出来的培养基。根据某些微生物的特殊营养需求设计，达到分离目的。在培养基中加入某些化学物质，这种化学物质没有营养作用，对所需分离的微生物无害，但可以抑制或杀死其他微生物。⑤其他培养基：分析培养基还原性培养基组织培养物培养基培养方法（1）固体培养：在固体培养基表面的培养，多用于菌种的分离、纯化、保藏和种子的制备。缺点：①用于大规模生产的潜力小；②不便于对体系进行监测控制；③不易于保持体系内环境条件的均一。（2）液体培养：优点：①菌体在液体培养基中处于悬浮状态，采用液体培养基易于获得混合均匀的菌体悬浮液，便于对系统进行监测控制。②容易放大到工业规模。③克服了固体培养法的缺点，成为大量培养微生物的一个重要方法一般可观测到微生物在生长繁殖过程中，四个阶段：①延迟期②对数期③稳定期④衰亡期（3）连续培养：根据控制方式的不同，连续培养可分为恒浊培养和恒化培养。①恒浊培养：根据体系内微生物的生长密度，获得菌体浓度和生长速度恒定的微生物细胞的培养方式。②恒化培养：是保持培养液的流速不变，使培养罐内的营养物质浓度基本恒定，并使微生物始终在低于其最高生长速度的条件下进行繁殖。连续培养面临的主要问题：①一个生产罐污染，所有生产罐都要停止运作，必须灭菌后再启动；②收率和产物浓度相对低，不利于下游的提取操作；③营养物质利用率低，增加生产成本；④连续培养必须与整个作业的其他供需连贯进行，对设备的要求比较高，需要复杂的监测和控制系统；⑤容易受菌种退化的影响，造成减产。（4）中间补料培养：又称为半连续培养法，或流加培养、补料分批培养等优点：①可以消除底物抑制；②达到高密度细胞培养；③延长次级代谢产物的生产时间；④稀释有毒代谢产物；⑤降低染菌和避免遗传不稳定性（5）同步培养：①选择法：根据处于不同生长阶段的细胞的性质差异，将其分离出来培养。通过微孔过滤膜，将不同步生长的细胞培养物过滤，收集刚刚分裂的细胞。优点：在不影响细胞代谢的情况下得到同步培养，细胞生命活动保持正常。②诱导法：控制环境条件，使细胞生长处于相同阶段，从而得到同步培养。诱导同步的方法：温度控制、光照、限制性营养成分、生长抑制等。（6）混合培养：在混合培养条件下，微生物之间存在各种关系：①互不相干：菌类之间不存在任何作用，其限制性基质不同，终产物得到有效的稀释②互生关系：两种菌互相提供对方生长所需的营养物质或消耗其生长抑制剂。食品工业意义上的植物组织培养主要是指细胞悬浮液培养，即使游离的植物细胞或一些小的细胞团在液体培养基中增殖并分离提取细胞产生的代谢产物。一个成功的悬浮细胞培养体系必须满足三个基本条件一是悬浮培养物分散性良好、细胞团较小；二是均一性好，细胞形状和细胞团大小大致相同，三是生长迅速要建立良好的悬浮细胞系，应注意以下事项：、选择合适的外植体2）、诱导疏松易碎的愈伤组织3）、选择合适的培养基4）、培养液的灭菌5）、悬浮培养6）、悬浮细胞的继代与选择常见的固定化细胞培养系统有以下两大类：1、平床培养系统2、立柱培养系统常见的培养基：天然培养基：主要取自动物体液或从动物组织分离提取，有血清、组织浸液、凝固剂等。优点：营养丰富，培养效果良好。缺点：成分复杂，来源受限。血清：是天然培养基中最有效和最常用的培养成分，含有许多维持细胞生长繁殖和保持细胞生物学症状不可缺少的未知成分。常用的动物血清有：牛血清和马血清合成培养基：是对动物体内生存环境中各种已知物质在体外人工条件下的模拟，给细胞提供一个近似体内的生存环境，便于控制和标准化的体外生存空间。合成培养基成分已知，最简单的合成培养基是eagle基本培养基，复杂的有DMEM、RPM1640等。无血清培养基：全部采用已知营养成分，包括血清中的细胞生长有效因子，从而代替血清。培养基配制繁琐是无血清培养的最大缺点。动物细胞培养方法有两种类型：一是类似于微生物细胞的培养方法，即悬浮培养，或称之为非贴壁依赖性细胞培养；二是贴壁依赖性细胞培养，即使细胞附着在带有适量电荷的固定体或半固定体表面上进行培养的方法悬浮培养：是指动物细胞在培养器中悬浮生长的培养方法。动物细胞悬浮培养时，不能耐受剧烈的搅拌和通气等条件，细胞密度低，容易发生变异，有潜在的致癌危险，用这种方法培养病毒，容易失去病毒标记而降低免疫力。贴壁培养：指必须将细胞贴附在固体介质表面上才能进行细胞培养的方式，主要用于非淋巴组织等贴壁依赖性细胞的培养，大多数动物细胞属于贴壁依赖性细胞。固定化培养：属于一种既适用于贴壁依赖性细胞，又适用于非贴壁依赖性细胞的包埋方式。优点：细胞生长密度高、抗剪切力和抗污染能力等。一般，贴壁依赖性细胞通常采用胶原包埋培养，非贴壁依赖性细胞常采用海藻酸钙包埋培养。（4）大规模培养法：目前比较成熟且有应用价值的大规模培养方法主要有：①空心纤维法②微载体法③微囊法细胞融合的方法：（1）生物学法：采用病毒促进细胞融合，如仙台病毒、疱疹病毒、天花病毒、副流感型病毒、副黏液病毒和一些致癌病毒均能诱导细胞融合。常用的细胞融合剂是仙台病毒，毒性低、对人危害小，容易被紫外线或β-丙炔内酯所灭活（2）化学融合剂法：常采用的化学融合剂包括PEG、二甲基亚砜（DMSO)、甘油醋酸酯、油酸盐及磷脂酰丝氨酸等脂类化合物。Ca2+存在下皆可促进细胞融合；PEG（聚乙二醇）应用广泛，作为融合剂比病毒容易制备和控制；PEG和DMSO并用，融合效果更好。（3）电处理融合法：在高频电场脉冲条件下，细胞透性增加，这种效应称为可逆电降解。细胞膜两面相对电荷正负相吸，使细胞膜变薄，随着外加电场强度升高，膜电场增强，当膜电势增强到临界电势时，细胞膜处于临界膜厚度，导致细胞膜发生局部不稳定和降解，从而形成微孔。电融合法具有的优点是：①操作方便、速度快；②原生质体不受化学融合剂的毒害；③融合过程同步进行，融合条件可精确控制，重复性强，应用范围广泛等。对于微生物，鉴别分析融合子，一般通过两亲本遗传标记的互补识别，常用有：（1）直接法：较为常用的方法。①对于营养互补型的亲本，可从高渗再生基本培养基上直接筛选；②对于抗药性作为选择标记的融合，可从含药物的平板培养基上分离鉴定；③对形态特征或色素方法的标记，其融合子可根据色素、形态特征来分析鉴定。（2）间接法：是把融合液涂布在高渗再生完全培养基上，使亲本细胞和融合子都再生成菌落，然后用影印法将它们复制到选择培养基上检出融合子从实际效果来看，间接法不会因为营养关系限制某些融合子的生长，特别对于一些有表型延迟现象的遗传标记，适宜用间接法。植物细胞工程及其在食品中的应用（1）利用植物细胞工程生产香料（2）利用植物细胞工程生产调料（3）利用植物细胞培养技术生产食品添加剂①色素——甜菜苷②甜味剂——甜菊苷③鲜味剂——5′-核苷酸和有关的酶④防腐剂——没食子酸乙酯⑤增稠剂——琼胶（4）利用植物细胞培养技术生产天然食品（5）利用植物细胞培养技术生产植物药固定化细胞的生物反应器（1）间歇式反应器：在工业上应用较少；（2）连续搅拌釜式反应器（3）填充床反应器（4）流化床反应器（5）其他类型反应器：循环反应器、连续搅拌釜——超滤膜反应器、螺旋卷绕膜式反应器、中空纤维膜式反应器固定化技术的应用（1）生产抗生素；（2）生产果葡糖浆；（3）利用固定化酵母进行啤酒的后发酵生产；（4）固定化细胞应用于柠檬酸的生产。酶工程与食品产业酶工程的定义：酶工程又称为酶技术，它是指酶的大批量生产和应用技术的过程。酶工程是在发酵工程（微生物工程）基础上发展起来，它与发酵工程的联系极为密切，酶工程是生物工程的重要组成部分，与基因工程、细胞工程、发酵工程相互依存、相互促进。酶生产菌的要求：不能是致病菌。在系统发育上与病原体无关，也不产生毒素。目前经认可用于食品工业和医药工业的生产菌种有：枯草杆菌、黑曲霉、米曲霉、啤酒酵母、脆壁酵母等。不易退化，不易感染噬菌体产酶量高，而且最好产生胞外酶能利用廉价的原料，发酵周期短，易培养。常见酶制剂的菌种：大肠埃希氏杆菌,简称大肠杆菌，最为著名的原核生物，最早宿主菌醋酸杆菌含糖、乙醇和酵母膏的培养基上生产良好枯草芽孢杆菌:生产淀粉酶、果胶酶、脂肪酶、酿酒工业上根霉：能产生一些酶类，如淀粉酶、果胶酶、脂肪酶等，是生产这些酶类的菌种。曲霉：是制酱、酿酒、制醋的主要菌种。是生产酶制剂（蛋白酶、淀粉酶、果胶酶）的菌种。生产有机酸（如柠檬酸、葡萄糖酸等）。农业上用作生产糖化饲料的菌种。葡萄糖效应：当细胞在容易利用的碳源（葡萄糖）上生长时，有些酶，特别是参与分解代谢的酶类的合成受阻，这种代谢产物阻遏又称葡萄糖效应。这种阻遏和cAMP有关。cAMP可以活化降解产物基因活化蛋白（CAP）与之结合后，再进启动子的结合位点上，使DDRP方能附到启动子的相应位点上，开始转录。当有葡萄糖存在时cAMP含量下降，不能与CAP结合而促进DDRP与启动子的结合，从而出现阻遏，如果此时加入cAMP（环腺苷酸），就可以减轻或解除这种阻遏。食品酶工程的应用改进啤酒工艺，提高啤酒质量改进果酒、果汁饮料的生产工艺食品保鲜1）利用葡萄糖氧化酶保鲜2）利用溶菌酶保鲜利用固定化酶生产高果糖浆1）酶的固定化1>含酶菌体细胞固定化2>生产流程蛋白质工程在基因水平上对蛋白质进行改造，按改造的规模和程度可以分为：个别氨基酸的改变和一整段氨基酸序列的删除、置换或插入（初级改造）蛋白质分子的剪裁，如结构域的拼接（高级改造）从头设计合成新型蛋白质初级改造1、M13-DNA寡聚核苷酸介导诱变技术2、寡核苷酸介导的PCR诱变技术3、随机诱变技术4、盒式突变技术蛋白质工程在食品中的应用1、消除酶的被抑制特性2、引入二硫键，改善蛋白质的热稳定性3、转化氨基酸残基，改善蛋白质热稳定性4、改变酶的最适PH值条件5、提高酶的催化活性6、修饰酶的催化特异性7、修饰Nisin的生物防腐效应第六章发酵工程与食品工业现代发酵工程：指在最适发酵条件下发酵罐中大量培养细胞和生产代谢产物的工艺技术。工业发酵的过程：以菌体为产品以微生物的酶为产品以微生物的代谢产物为产品利用发酵作用，对某种化合物的化学结构进行改造，即产品的转化过程。转化过程：微生物细胞能将一种化合物转为成化学结构相似，但在经济上更有价值的化合物。转化反应包括催化脱氢、氧化、羟化、缩合、脱羧、氨化、脱氨化等作用。巴斯德的成就：每一种发酵都是由一种微生物产生发酵流程图（PPT上续的第11张）发酵罐设计的原则：（必考）发酵罐的主要功能是为菌体生长，或为某一特定的微生物混合发酵剂提供一个便于控制的环境，以获得人们所期望的产物：发酵器应能在无菌条件下工作数天，且应在长时间运转过程中保持稳定通气和充分搅拌，以满足微生物代谢的需要，但不应损伤菌体尽可能低的功率消耗发酵罐上应配备有温度和PH值控制系统以及采样装置发酵罐内的蒸发损失不易太多在放料、清洗和维修等操作过程中具有最低的劳动力消耗发酵罐应有较好的适应性，以满足不同生产厂家的需求发酵罐内表面应光滑，而且尽可能的采用焊接而不是用法兰来连接用于中试规模的发酵罐与用于实际生产的发酵罐应具有相同的几何形状，有利于生产使用既能满足工艺要求又比较便宜的制造材料，同时应配备完善的供给设施微生物细胞反应器机械搅拌式发酵罐主要由壳体、控温部分、搅拌部分、通气部分、进出料口、测量系统和附属系统等组成（最全面，通用型，设备投资大，）三种生物反应器的区别：机械搅拌型：有空气压缩机，有搅拌器机械搅拌自吸式：有空气压缩机，无搅拌桨气升式环流：有空气压缩机，无搅拌桨搅拌部分的作用：传质、传氧、消泡机械搅拌的控温如何实现：测温加热冷却挡板的原理：机械搅拌自吸式反应器利用搅拌器旋转时产生的抽吸力进入空气，不需要空气压缩机提供压缩空气，从而省去了空气系统，使设备成本降低。自吸式反应器的搅拌器是一个空心叶轮，利用离心力的作用。（适用于细胞耐剪切的菌种，对溶氧要求低，不需要大量氧气，无空气压缩机）气升式环流反应器借助设在环流管底部的空气喷嘴将空气以250-300米每秒的高速喷入环流管，使气泡分散在培养基中。由于环流管内部的液体溶有大量气泡，其密度明显小于反应器主体中培养液的密度，气升式环流反应器正是借助这两者之间的密度差使培养液在环流管与反应主体间作循环式流动，把反应主体中由于菌体代谢而溶氧量低的培养液送入环流管，待培养液补充氧气后再送回反应主体，从而为菌体生长提供良好充足的氧气供应。高位塔式生物反应器：罐体的高径比值较大，利用通入培养液的无菌空气泡上升来带动液体运动，产生混合效果的非机械搅拌式生物反应器，运用于培养液粘度低、固体含量少和需氧量较低的发酵培养过程。基因工程菌生物反应器：利用DNA重组技术将来源不同的基因有目的地组合在一起，获得具有全新遗传特性的重组微生物细胞，即基因工程菌。基本工艺过程微生物发酵动力学：1.分批培养：又称为分批发酵，是指在一个密闭系统内投入有限数量的营养物质后，接入少量的微生物菌种进行培养，使微生物在特定的条件下只完成一个生长周期的培养方法。Monod方程（见256页）2.连续培养：是按一定的速度向培养系统内添加新鲜的培养基，同时培养液以相同的速度流出，从而使发酵管内培养物的液量维持恒定，使微生物细胞能在相对恒定的状态下生长。(恒流，恒速)3.补料分批培养：是指在分批培养中，间歇或连续地补加新鲜培养基的培养方法，是介于分批培养与连续培养之间的一种过渡培养方式。补料分批培养方式的优点：消除培养过程中底物的抑制、产物的反馈抑制和葡萄糖的分解阻遏效应可以避免分批培养过程中因一次性碳源投放量过