AbMole荧光染料的详细讲解

AbMole|关于荧光染料的详细讲解在这个充满探索与发现的科研时代，每一个细微的细胞活动都蕴藏着生命的奥秘，荧光染料可以标记微观世界中的精细细胞结构和生物大小分子，使生命科学研究变得绚烂多彩，为我们开启了探索之门。AbMole为您介绍荧光染料的发光原理、主要种类和一些热门染料的应用。荧光染料的发光原理图1荧光染料的发光原理荧光染料是指吸收某一波长的光波后能发射出另一波长大于吸收光光波的物质，它们一般含有若干个芳香族基团，这些基团具有较强的光吸收能力，在吸收激发光能量后，染料分子的内部能量状态显著提升，跃迁至一个不稳定的激发态（S1’）。由于激发态具有较高的能量水平，它倾向于寻求向更稳定的状态转变。一般有机分子会通过化学键的旋转或振动等机械运动来逐步释放能量，但经过设计的荧光分子会先通过震动进入S1状态随后直接以光子的形式释放剩余的能量，即发出荧光。荧光分子的主要种类荧光分子主要有香豆素类、花菁类染料、BODIPY类、荧光素和罗丹明类等几种类型。香豆素荧光染料分子量很小，可紫外激发，一般发蓝色荧光，常常作为多色荧光检测实验中的蓝光染料。花菁染料(Cyanine，简写Cy)是另一类常见的荧光染料，例如Cy3。花菁的核心结构是两个含氮杂环通过奇数的次甲基连接形成，每增加一个乙烯基团，会使得光谱红移约100nm。荧光素和罗丹明都属于氧杂蒽染料，它们具有极高的亮度，并且其激发和发射波长都位于可见光谱范围内，但是荧光素的pKa值为6.4，因此其光谱特性在很大程度上受环境pH值的影响，这一类荧光分子种类较多，最常见的包括异硫氰酸荧光素（FITC）、羧基荧光素、罗丹明，罗丹明6G、110、123等。二吡咯烷硼化合物，又名BODIPY，因其卓越的光物理特性而备受欢迎。它们具有高量子产率、出色的亮度、窄半峰宽的吸收和发射光谱等优点。BODIPY的各种衍生物覆盖了从绿色（BODIPYFL）到红色（BODIPY650/665）的大部分可见光谱范围，基于BODIPY的荧光探针目前广泛应用于生物医学和环境科学领域。图2常见荧光染料的化学结构科研常用荧光染料荧光染料在生命科学和基础医学研究中起到了重要的作用，它们可以染色细胞核、细胞膜和膜性结构、线粒体、溶酶体等，也可以对细胞的状态例如凋亡、活死等进行染色以便于大家分析，下面简单介绍一些科研中常用的荧光染料。细胞核染色细胞核染料主要有DAPI和Hoechst系列产品。DAPI的最大激发和发射波长分别为350和460nm，发蓝色荧光。DAPI无法活染，一般DAPI染色前需要对细胞进行多聚甲醛的固定。Hoechst则可以对活细胞进行染色，一般在延时成像等持续性的荧光观察实验中会用到该产品，其最大激发和发射波长与DAPI相接近。图3Hoechst33342染色效果图细胞线粒体染色和线粒体膜电位检测MitoTracker系列染料可以选择性地积聚在线粒体基质中，通过与半胱氨酸残基的游离硫醇基反应来共价结合线粒体蛋白，从而可以对线粒体进行染色。线粒体膜电位对于细胞的正常能量代谢和功能维持至关重要，JC-1是一种广泛用于检测线粒体膜电位△Ψm的理想荧光探针。在线粒体膜电位较高时，JC-1聚集在线粒体的基质中，形成聚合物，可以产生红色荧光；在线粒体膜电位较低时，JC-1则不能聚集在线粒体的基质中，此时JC-1为单体，可以产生绿色荧光，通过流式细胞术、激光扫描共聚焦显微镜等即可对细胞的膜电位进行量化或者定性分析。图4JC-1染色效果图活死细胞染色试剂盒：CalceinAM/PI当需要对细胞的存活和死亡进行分析时，可以使用CalceinAM/PI双重染色法。Calcein-AM可透过细胞膜但其自身并不是荧光分子，通过活细胞内的酯酶作用，Calcein-AM能脱去AM基，产生的Calcein能发出强绿色荧光

(激发:490nm，发射:515nm)。因此Calcein-AM仅对活细胞染色；而PI无法染色活细胞，只能穿过死细胞膜的无序区域而到达细胞核，并嵌入细胞的DNA双螺旋从而产生红色荧光

(激发:535nm，发射:617nm)。通过上述两种荧光染料的双重染色即可分辨出细胞群体中死亡和存活的细胞。图5活死细胞染色效果图凋亡检测试剂盒：AnnexinV-FITC/PI细胞在凋亡的早期会发生磷脂酰丝氨酸（PS）的外翻，而AnnexinV是一种磷脂结合蛋白，与PS有高度亲和力，利用FITC标记AnnexinV孵育细胞即可以检测出早期凋亡的细胞，而用PI则可以检测出已经死亡的细胞。通常该试剂盒被用于凋亡细胞的流式定量。图6AnnexinV-FITC/PI凋亡检测活性氧探针DCFH-DA活性氧（ReactiveOxygenSpecies，ROS）是机体进行正常有氧代谢的产物，含氧并且性质活泼的一类物质的总称。包含超氧阴离子（O2-）、过氧化氢（H2O2）、羟自由基（OH-）、臭氧（O3）和单线态氧（1O2）等，由于它们含有不成对的电子，因此具有很高的化学反应活性。DCFH-DA具有较强的非极性可以自由进出细胞膜，但当它被胞内的酯酶水解后则无法透过细胞膜，并且在被ROS氧化成DCF后具有荧光发光的能力。图7DCFH-DA检测ROS脂质过氧化物探针BODIPYC11581/591可用于检测细胞的脂质过氧化情况。该染料可以插入细胞膜中，如果在细胞膜中发生氧化，则该染