医学教案γ-氨基丁酸及其A型受体在胃癌SGC-7901细胞的表达及对细

*该课题受到安徽省卫生厅医学科研课题资助（09C236）**通讯联系人Tel(023)89011172,E-mail:zhangyu0323@21ThisworkwassupportedbygrantsfromAnhuiProvinceHealthOfficeMedicalR**Correspondingauthor.Tel(023)89011172,E-mail:zhangyu0323@21γ-氨基丁酸及其A型受体在胃癌SGC-7901细胞的表达及对细胞增殖的影响史良会1,2张才全1*(400016重庆，重庆医科大学附属第一医院胃肠外科1，241001安徽芜湖，皖南医学院弋矶山医院普外科2)【摘要】：目的观察GABA，GAD65，GABRP在胃癌SGC-7901细胞中的表达及对细胞增殖、周期分布的影响。方法RT-PCR、IF及WesternBlot检测胃癌细胞SGC-7901中GABA、GAD65及GABRPmRNA及蛋白表达；1μM，10μM，100μMGABA，0.5μM,5μM,50μMMuscimol，0.5μM,5μM,50μMBicucullin分别作用于胃癌细胞SGC-790148h后，新型四唑氮盐（MTS）比色法检测细胞增殖情况，流式细胞仪检测细胞周期分布情况。结果GAD65，GABRPmRNA及蛋白表达均于SGC-7901细胞中；GABA，GABRP及GAD65蛋白定位于SGC-7901细胞胞膜胞浆；与空白组比较，1μMGABA，5μM及50μMMuscimol作用SGC-7901细胞48h后，细胞生长的增殖率上升，5μM，50μMBicucullin作用SGC-7901细胞48h后，细胞生长抑制率上升；1μMGABA可导致细胞G0/G1数量的减少，G2/M期数量的增加；3个浓度的Muscimol可导致G0/G1期数量的减少，5μM、50μMMuscimol可导致细胞G2/M期数量增加；5μM，50μMBicucullin可导致G2/M期数量的减少，（P＜0.05）。结论GABA及其A受体在SGC-7901细胞中的表达可能促进细胞增殖，扰乱细胞周期进程，促使细胞分裂。【关键词】：胃癌；γ-氨基丁酸；增殖；细胞周期InfluenceoftheexpressionofGABAandGABRPingastriccancerSGC-7901cellsoncellmigrationabilityShiLianghui1,2ZhangCaiquan1(1DepartmentofGastrointestinalSurgery,theFirstAffiliatedHospital,ChongqingMedicalUniversity,Chongqing400016,China;2YijishanHospitalofWannanMedicalCollege,Wuhu241000,china)[Abstract]:ObjectiveToinvestigatetheexpressionofGABA,GAD65andGABRPinSGC-7901cellsandtheeffectsofcellproliferation,cellcycle.MethodsRT-PCR,WesternBlotandIFwereusedtodetecttheexpressionGABA,GAD65andGABRPingastriccancercellsSGC-7901.SGC-7901cellswereculturedfor48hwith1μM，10μM，100μMGABA，0.5μM,5μM,50μMMuscimol，0.5μM,5μM,50μMBicucullinconcentrationsofGABA,MuscimolandBicucullin.MTSassaywasusedtoexaminecellproliferation.Flowcytometrywasusedtoanalysescellcycledistribution.ResultsThemRNAandproteinofGABA,GAD65andGABRPwereallexpressedinSGC-7901cells.GABA,GAD65andGABRPproteinlevelwerepredominantlylocalizedonthecellcytoplasmofSGC-7901.Comparedwithblankgroup,thecellsproliferationwereobviouslystimulatedin1μMGABA,5μMand50μMMuscimolgroups,butsignificantlyinhibitedin5μM，50μMBicucullingroups.FlowcytometryanalysisshowedthatthepercentageofcellsinG0/G1phasedecreasedwhilethenumberofcellsinG2/Mphaseincreasedin1μMGABAgroup.DifferentconcentrationsofMuscimolreducedG0/G1phasecellpercentage,butbothof5μMand50μMconcentrationsofMuscimolelevatedG2/Mphasecellpercentage.In5μM，50μMBicucullingroups,thepercentageofG2/Mphasecellwerereduced,(P＜0.05).ConclusionHigherexpressionofGABAandGABRPinSGC-7901cellsmaypromotecellproliferation,disturbcellcycleproceeding,andacceleratecelldivision.[Keywords]：gastriccancer；γ-aminobutyricacid；Proliferation；Cellcycle中图分类号：R753.2文献标识码：A前言γ-氨基丁酸（γ-aminobutyricacid,GABA）是哺乳动物中枢神经系统最重要的抑制性神经递质，它主要由谷氨酸经L-谷氨酸脱羧酶（L-glutamatedecarboxylase,GAD）的脱羧作用生成。GAD65和GAD67是合成GABA的主要限速酶。现已明确，GABA存在于哺乳动物多种外周组织，并扮演了除了神经传导及神经调节外的多种功能[1]。近年来的研究表明，GABA与GABA受体（GABAreceptor,GABAR）还高表达于多种肿瘤组织，通过MAPKs等信号转导途径调控肿瘤增殖及侵袭转移，从而参与肿瘤的发生发展[2]。文献报道[3]，在胃癌组织中，GABA的表达及其合成酶GAD的活性均明显高于正常组织。因此本文探讨在胃癌细胞中，GABA及其A受体（GABAAR）的表达是否参与了胃癌细胞的增殖及细胞周期的调控。1材料与方法1.1主要材料和试剂1.1.1菌株人胃腺癌细胞株SGC-7901购自中科院上海细胞库。1.1.2正常脑组织正常脑组织取自脑外伤后早期清创，并获得患者知情同意书，整个实验过程遵循医学伦理学的原则。1.1.3主要试剂RT-PCR试剂盒，MTS购于Promega公司，兔多抗GABA，GAD65抗体购自武汉博士德生物工程有限公司，兔多抗π-GABAAR抗体购自SantaCruze，FITC兔抗羊二抗购自北京中山生物技术有限公司，GABA、GABAA R激动剂Muscimol、GABAAR拮抗剂Bicucullin均购自Sigma，WesternB1.1.4引物设计与合成根据GenBank发布的GABRP[Gamma-aminobutyricacid（GABA）Areceptor,pi]，GAD65[glutamatedecarboxylase2(brain,65kDa)，（GAD65）]，GAPDH编码区序列，采用PrimerPremier5.0设计引物，送于上海生工合成。GABRP，NM_014211.2，上游引物：5'GAGGGAACGACTCTGTGCG3'，下游引物：5'CTGCCATCTGCTGTAAGGA3'，扩增产物为429bp；GAD65，M81882.1，上游引物：5'CCTCCTACCTCTTTCAGCA3'，下游引物：5'TTCCCATCAAACACCATCT3'，扩增产物为226bp；GAPDH，NM_002046.3，上游引物：5'TGAAGGTCGGAGTCAACGG1.2实验方法1.2.1细胞培养胃腺癌细胞株SGC-7901细胞培养于含10％小牛血清的1640培养基，于37℃1.2.2免疫荧光检测将细胞种植于无菌盖玻片，待生长至80﹪左右，取出玻片，按免疫荧光常规步骤操作。一抗以1:200稀释，阴性对照以采用正常兔血清IgG代替一抗。激光共聚焦显微镜扫描呈像。1.2.3RT-PCR检测待细胞生长密度为90%时，倒掉培养基，用PBS清洗细胞2次，随后于冰上加入预冷Trizo1，提取总RNA，按试剂盒说明进行两步法RT-PCR。PCR反应条件为：94℃2min预变性，然后94℃30sec，53℃～55.5℃30sec，72℃1min，30个循环，最后72℃延伸10min。所得产物经20g1.2.4WesternBlot检测待细胞生长至90%以上密度时，刮取细胞，以细胞裂解液充分裂解细胞；收集正常胃组织，匀浆后，加入裂解液充分裂解。随后均于4℃12000r/min离心5min，吸取上清液，测定蛋白浓度后，行SDS。将凝胶半干转于PVDF膜，5%的TBST脱脂奶粉室温封闭1h，一抗41.2.5MTS检测取对数生长期细胞，96孔细胞培养板每孔接种5×103个细胞中，每孔体积100μl，置于37℃、5%CO2培养箱中孵育24h，然后分别加入含不同干预浓度的GABA（0μM，1μM，10μM，100μM），GABAAR激动剂（0.5μM，5μM，50μM）、GABAAR拮抗剂（1μM，10μM，100μM），每个浓度重复8孔，设置空白组，在48h后，每孔加入MTS液10μl，继续培养48h，用全自动酶标仪于492nm波长检测各孔吸光度（A）值，空白对照调零并计算增殖率或抑制率，实验重复3次。以抑制率或增殖率为纵轴，以浓度为横轴绘制折线图。按下列公式计算细胞增长率：增殖率=（药物组A值／对照组A值）×100%；抑制率=（1-1.2.6流式细胞仪检测收集经上述处理后的各组细胞，消化后，1000r/min离心5min，PBS清洗2次，每次10分钟，随后用70%冰乙醇固定过夜，离心后每样品管中加1ml碘化丙啶（PI）染液，4℃避光染色30min，流式细胞仪检测细胞周期1.3统计学分析试验数据利用SPSS16.0统计软件中One-WayANOVA模块分析，多组间数据先经LSD转换后进行单因素方差分析，统计数据以x±s表示，P<0.05为差异有统计学意义。2结果2.1RT-PCR检测GAD65、GABRPmRNA在SGC-7901细胞中的表达（见图1）电泳结果显示，分别在429bp，226bp及223bp处可见清楚条带，说明GABRP，GAD65mRNA表达于胃癌细胞SGC-7901细胞中,其中脑组织结果为阳性对照。图1RT-PCR检测脑组织及SGC-7901细胞中GABRP，GAD65mRNA的表达2.2免疫荧光定性检测GABRP、GABA、GAD65蛋白在SGC-7901细胞中表达（见图2）激光共聚焦结果显示，GABRP，GABA，GAD65表达于SGC-7901细胞胞膜胞浆，激发出绿色荧光，红色为PI染核。阴性对照未见阳性表达。图2免疫荧光检测GABA，GAD65，GABRP在SGC-7901细胞中的表达（×200）2.3Westernblot定量检测GAD65、GABRP蛋白在SGC-7901细胞中表达（见图3）Westernblot结果显示，GABRP及GAD65蛋白表达于在SGC-7901细胞中，脑组织结果为阳性对照。图3Westernblot检测SGC-7901细胞及脑组织中GAD65，GABRP蛋白的表达2.4MTS检测不同浓度的GABA及GABAAR激动剂、拮抗剂对SGC-7901细胞增殖的影响（见图4）1μM，10μM，100μMGABA作用SGC-7901细胞48h后，细胞的增殖率分别为11.4%，7.9%，6.4%，与空白对照相比，1μMGABA对细胞的增殖率显著升高（P<0.05）。0.5μM，5μM，50μMMuscimol作用SGC-7901细胞48h后，细胞的增殖率分别为9%，31.1%，26%，可见5μM，50μMMuscimol可显著提高细胞的增殖率（P<0.01）。0.5μM，5μM，50μMBicucullin作用SGC-7901细胞48h后，细胞的抑制率分别为6.58%，10.9%，16%。可见5μM，50μMBicucullin可显著抑制细胞增殖（P<0.05）。2.5流式细胞仪检测不同浓度的GABA及GABAAR激动剂和拮抗剂对SGC-7901细胞周期的影响（见图5）与空白组比较，1μM、10μMGABA可显著降低细胞G0/G1期细胞数量，并且1μMGABA可显著增加细胞G2/M期数量（P<0.05），见表1。提示对于SGC-7901细胞，1μMGABA可能通过减少G0/G1期细胞数量、增加G2/M期细胞数量，促使更多的细胞进入分裂期。100μMGABA却显著增加细胞G0/G1期数量的增加，提示高浓度的GABA可能将细胞阻滞于G0/G1期，不利于细胞增殖。外源性给予不同浓度的GABAAR激动剂Muscimol均可导致G0/G1期细胞数量的减少，并随着浓度的增加，G2/M期细胞数量逐渐上升，与空白组比较，5μM、50μMMuscimol呈现显著差异（P＜0.05），见表2。提示了5μMMuscimol可有效促进SGC-7901细胞增殖。（P＜0.05）。不同浓度的GABAAR拮抗剂对细胞各期的阻滞效果不一。0.5μMBicucullin可显著减少G0/G1数量、但显著增加S期细胞数量；5μMBicucullin可显著减少G2/M期的细胞数量；50μMBicucullin可显著增加G0/G1的细胞数量，并显著减少G2/M期的细胞数量，（P＜0.05），见表3。提示了低浓度的Bicucullin可能通过升高S期细胞数量，而高浓度的Bicucullin则可能通过显著降低G2/M期细胞数量，亦（或）提高G0/G1细胞数量，以达到抑制细胞增殖效果。表1.不同浓度GABA对细胞周期变化的影响（x±s）组别nG0/G1SG2/M空白组364.35±1.0627.67±1.817.99±0.77GABA1μM组353.48±2.20*31.51±1.2414.93±1.73*GABA10μM组354.52±3.73*33.73±2.8711.75±1.07GABA100μM组372.67±2.38*18.38±0.17*9.05±2.16*：与空白组织比较：P<0.05表2.不同浓度Muscimol对细胞周期变化的影响（x±s）组别nG0/G1SG2/M空白组364.35±1.0627.67±1.817.99±0.77Muscimol0.5μM组353.20±0.70*38.21±1.24*8.65±1.14Muscimol5μM组353.39±1.13*31.80±1.5214.81±0.65*Muscimol50μM组355.77±0.72*30.00±2.1314.24±1.41**：与空白组织比较：P<0.05表3.不同浓度Bicucullin对细胞周期变化的影响（x±s）组别nG0/G1SG2/M空白组364.35±1.0627.67±1.817.99±0.77Bicucullin0.5μM组353.11±2.65*40.74±4.52*6.16±1.80Bicucullin5μM组369.58±1.1325.64±3.184.71±2.40*Bicucullin50μM组370.99±1.62*26.02±3.123.23±1.78**：与空白组织比较：P<0.053讨论早期被鉴定为抑制性神经递质的GABA，随后发现其具有可以调节脑及外周细胞增殖，分化的功能。在结肠癌、前列腺癌、胃癌、腮腺瘤，甲状腺癌组织中，研究发现GABA显著高表达，GAD的活性也明显增加，而且在肝癌、乳腺癌等癌组织，GABAAR表达也显著增强。因此，外周组织中GABA及GABAAR的异常表达可能与肿瘤的发生相关[4-7]。朱人敏等[8-9]人提出，在正常胃粘膜中，没有GAD65表达，仅有GAD67mRNA的表达，且在胃癌中表达下调，并推测有其他酶参与胃癌中GABA合成。KentaroMaemura等[10]人指出，在印戒癌细胞株KATIII细胞中，可检测到GAD65mRNA及蛋白的表达，而GAD67的表达几乎检测不到。本实验结果显示，在SGC-7901细胞中同样检测不到GAD67的表达，仅可见GAD65mRNA及蛋白较低水平的表达。免疫荧光结果提示，GABA定位于细胞的胞膜胞浆，进而发现，外源性给予1μMGABA可显著促进细胞增殖，影响细胞周期进程。因此我们推测，在胃癌中，GABA亦或存在旁分泌来源形式参与了细胞的增殖等作用。GABA受体根据其不同的药理特征分成A、B、C三种类型。GABAA型受体（GABAAR）是由5个亚单位组成离子门控的氯化物通道。迄今已发现至少21个不同的亚基：6种α亚基、4种β亚基、4种γ亚基、3种δ亚基、1种ε亚基和π亚基等，不同亚基组成的受体产生不同的生理效应[11]。在直肠结肠癌中，GABAA型受体相关蛋白高表达，为一个判断预后的独立指标并可与患者存活时间减少相关[12]。体外研究证实，GABAA型受体的激动剂异丙酚诱导结肠癌细胞LOVO的侵袭能力下降[13]。本文采GABAAR拮抗剂及激动剂干预SGC-7901细胞后，并没有检测到细胞侵袭能力的变化，而且KentaroMaemura等人在表达A受体的胃癌细胞KATIII中，同样没有发现A型受体参与细胞侵袭功能的现象。与此同时，在肝癌细胞中，研究发现GABA能促进肝癌细胞株HepG-2细胞增殖，并引起细胞恶化改变[14]。A受体的π亚基在中枢神经系统中仅定位于海马及颞皮质两个大脑区域，但分布于多种外周组织，不表达于胃组织，并推测π亚基对于GABAAR在外周组织中的作用扮演着非常关键的角色。研究发现，在胰腺癌组织中存在过度表达π亚基现象，且采用GABAAR拮抗剂处理胰腺癌细胞，可显著抑制细胞的生长发育[15]。且因此本文选择GABAA受体π亚基为研究对象，检测在胃癌细胞中是否存在其异常表达。本文结果表明，SGC-7901细胞中均能检测到GABAARπ亚基mRNA及蛋白表达。随后，我们采用不同浓度的GABAAR激动剂Muscimol，GABAAR拮抗剂Bicucullin处理细胞，MTS检测结果表明了，5μMMuscimol均可显著提高SGC-7901细胞增殖率，50μMBicucullin可显著抑制细胞增殖。提示了GABRP在SGC-7901细胞中的表达促进了SGC-7901增殖。在低分化的胃癌细胞KATIII细胞中发现，GABA及GABAAR激动剂促进细胞增殖，上调细胞周期蛋白CyclinD1，促使细胞从G1期进入S期。而本文中流式细胞仪结果提示了，GABA，及GABAAR激动剂、拮抗剂主要干预了细胞G0/G1期及G2/M期，从而影响细胞周期进程。因此，可能在SGC-7901细胞中存在不同于KATIII细胞的细胞周期蛋白的调控。4结论本研究结果表明，GABA、GAD65及GABRP表达于人胃癌细胞株SGC-7901细胞，提示GABA可能以旁分泌或自分泌方式促进SGC-7901细胞增殖，扰乱细胞周期分布，加快细胞周期进程。参考文献[1]WatanabeM.,MaemuraK,KanbaraK,etal.GABAandGABAreceptorsinthecentralnervoussystemandotherorgans[J].Int.Rev.Cytol,2002,213:1-47[2]WatanabeM,MaemuraK,KanbaraK,etal.GABAandGABAreceptorsinthecentralnervoussystemandotherorgans[J].IntRevCytol.,2002,213:1–47[3]MatuszekM,JesipowiczM,KleinrokZ.GABAcontentandGADactivityingastriccancer[J].Int.Med.J.Exp.Clin.Res,2001,7(3):377-381[4]LiY,LiuY,WangJ,etal.Effectofgamma-aminobutyricacidonmalignantphenotypesofhepatocellularcarcinomacelllineHepG-2[J].ZhongNanDaXueXueBaoYiXueBan.2009,34(8):752-6.[5]SchullerHM,Al-WadeiHA,MajidiM,etal.GABA(B)receptorisanoveldrugtargetforpancreaticcancer[J].Cancer,2008,112(4):767-778[6]JezewskaE,ScinskaA,KukwaW,etal.Gamma-aminobutyricacidconcentrationsinbenignparotidtumoursandunstimulatedparotidsaliva[J].JLaryngolOtol.2011,125(5):492-6.[7]RobertsSS,Mendonca-TorresMC,JensenK,et,al.GABAreceptorexpressioninbenignandmalignantthyroidtumors[J].PatholOncolRes.2009,15(4):645-50.[8]朱人敏，秦苏堤，汪芳裕，等．人胃癌组织中γ-氨基丁酸含量及其受体和谷氨酸脱羧酶的表达[J]．中华消化杂志，2005，25(11):684-685[9]朱人敏，秦苏堤，汪芳裕，等．高效液相色谱法测定人胃粘膜中γ-氨基丁酸和谷氨酸含量的[J]．世界华人消化杂志，2005，12(5):1210-1212[10]KentaroMaemura,Nanak