PCR法获取目的基因

第五章PCR法获取目的基因

ChapterVObtainingTargetGenesbyPCRTechnology

授课教师：王斌

职称：副教授2024/10/21PCR法获取目的基因1授课内容PCR技术的创建PCR技术的原理PCR的反应体系和程序PCR的类型和应用PCR法克隆目的基因PCR引物设计：PrimerpremierPCR产物的凝胶电泳结果处理：Quantityone2024/10/21PCR法获取目的基因2授课目标了解PCR技术史理解PCR技术原理重点：在实际研究工作中利用PCR技术熟练设计引物、PCR体系和程序，准确扩增目的基因片段，为目的基因的克隆、表达服务。DNA——生命的蓝图2024/10/21PCR法获取目的基因3Thetwostrandsoftheparentaldoublehelixunwind,andeachspecifiesanewdaughterstrandbybase-pairingrules.Semi-conservativereplication2024/10/21PCR法获取目的基因4PCR技术聚合酶链式反应PolymeraseChainReaction一、PCR技术的创建——KaryB.MullisKhorana等1971年提出在体外经DNA变性、与适当引物杂交、再用DNA聚合酶延伸等循环过程，克隆DNA的设想。2024/10/21PCR法获取目的基因5DNA聚合酶引物引物Sanger：1977年，DNA测序M13噬菌体引物DNA聚合酶2024/10/21PCR法获取目的基因61983年，Mullis发明了PCR技术，使Khorana的设想得到实现。1983年Mullis的构思2024/10/21PCR法获取目的基因71983年春夏之交的一个晚上，Mullis开车去乡下别墅的路上萌发了用两个引物去扩增模板DNA的想法。他开车时,感觉两排路灯就是DNA的两条链，自己的车和对面开来的车象是DNA聚合酶，面对面地合成DNA。问题：DNA聚合酶不能耐受高温，每个循环需额外添加DNA聚合酶。2024/10/21PCR法获取目的基因8KaryB.Mullis（1944－）两篇重要论文SpecificSynthesisofDNAInVitroviaaPolymeraseCatalyzedChainReaction(MethodsinEnzymology,1987,155:335-50)被引用次数：5869

TheUnusualOriginofthePolymeraseChainReaction(ScientificAmerican,1990,262(4):56-61,64-5)1993年因发明聚合酶链锁反应，与迈克尔·史密斯分享诺贝尔化学奖。Taq

DNA聚合酶（来自于Thermusaquaticus，水生栖热菌)Saiki：1988年，发现耐热的DNA聚合酶（Taq）2024/10/21PCR法获取目的基因9Primer-directedEnzymaticAmplificationofDNAwithaThermostableDNAPolymerase(Science,1988,239(4839):487-91)‎被引用次数：171611988年，第一台PCR仪问世。1989年美国《Science》杂志比喻1989年为PCR爆炸年，Mullis荣获1993年度诺贝尔化学奖。1991年，Hoffman-LaRoche以3亿美元的代价从Cetus公司获得全权开发权。二、PCR技术的原理1.PCR技术的原理2024/10/21PCR法获取目的基因10在微量离心管中,加入适量的缓冲液、微量的模板DNA、四种脱氧核苷酸、耐热性DNA聚合酶、一对合成DNA的引物;通过高温变性、低温退火和中温延伸三个阶段的循环合成DNA;每一次循环使特异区段的基因拷贝数放大一倍。一般样品经过30次循环,可使基因的拷贝数达到数百万。类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于寡核苷酸引物。PCR过程：由变性--退火--延伸三个基本步骤构成变性：94℃左右，使双链DNA模板解离成为单链；复性：55℃左右，引物与模板DNA互补配对结合；延伸：72℃左右，“模板-引物结合物”在DNA聚合酶作用下，以dNTP为原料，以靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成新的DNA链。重复“变性--退火--延伸”的循环，可获得大量的新DNA分子。而且，新的DNA分子又可作为下次循环的模板，从而指数级地获得大量DNA产物，数小时内可使目的基因的数量扩增百万倍。2024/10/21PCR法获取目的基因11加热变性复性复温2.PCR技术依赖于DNA的变性和复性DNA的变性：加热、强酸、碱性作用可以使DNA双螺旋的氢键断裂，双链解离，形成单链DNA。DNA的复性（退火）：解除变性的条件后，变性的单链DNA可以重新结合起来，形成双链，其原有的特性和活性可以恢复。2024/10/21PCR法获取目的基因123.PCR技术的特点1）速度快，灵敏度高：经过30轮循环，理论上目的产物的扩增量达230个拷贝（109拷贝）。2）特异性：引物的序列及其与模板结合的特异性是决定PCR反应结果的关键；引物设计的原则是最大限度地提高扩增效率和特异性，尽可能减少非特异性扩增。3）操作简便易行：只需要数小时就可以用电泳法检出1μg基因组DNA中仅含数个拷贝的基因序列。4）用途广泛：生命学科、医学工程、遗传工程、疾病诊断、法医学、考古学。2024/10/21PCR法获取目的基因13三、PCR技术的反应体系和条件H2O

35

μL10×PCR反应缓冲液

5

μL25mmol/LMgCl2

4

μL4种dNTP

4

μL上游引物（引物１）

0.5

μL下游引物（引物２）

0.5

μL模板DNA

(约1ng)

0.5

μLTaq酶0.5

μL

1.反应体系（总体积：50L）2024/10/21PCR法获取目的基因14PCR技术的基本过程(1)模板DNAdNTP引物BufferH2OMg2+预变性TaqDNA聚合酶94℃,5min2.基本程序2024/10/21PCR法获取目的基因15模板DNAdNTP引物BufferH2OMg2+PCR技术的基本过程(2)PCR仪94℃55℃72℃72℃5～7min循环25～35次2024/10/21PCR法获取目的基因16Taq酶模板DNAdNTP引物BufferH2OMg2+PCR产物Taq酶模板DNAdNTP引物BufferH2OMg2+2024/10/21PCR法获取目的基因17PCR技术的基本过程(3)琼脂糖凝胶电泳2024/10/21PCR法获取目的基因18（1）PCR反应体系成分模板（Template）DNA模板浓度：一般为1

g/mL左右；单、双链DNA；线状DNA分子、环状DNA分子均可；DNA模板不能混有蛋白酶、核酸酶、DNA聚合酶抑制剂等；模板的浓度和纯度是影响PCR的重要因素：模板过多可能增加非特异性产物；纯度不高会影响PCR的效率，甚至得不到产物。3.PCR反应条件2024/10/21PCR法获取目的基因19引物（Primer）浓度：0.1-0.5mol/L，浓度过高易导致模板与引物错配,反应特异性下降。PCR反应产物的特异性由一对上下游引物所决定。引物的好坏往往是PCR成败的关键。引物设计可遵循下列原则：长度：约16-30bp，太短影响引物与模板的配对；四种碱基随机分布，在3’端不存在连续3个G或C，这样易导致错误引发（falsepriming）；G+C含量：通常为40-60%，可按下式粗略估计引物的解链温度——Tm＝4(G+C)+2(A+T)；引物3’端：关键碱基，必须与模板完全配对，最好对应密码子的第一或第二位核苷酸，以减少由于密码子摆动产生的不配对。2024/10/21PCR法获取目的基因20引物内部：尤其在3’端，不存在发夹结构（Hairpin）、二聚体（Dimer）；引物之间：尤其在3’端，不能互补以防出现引物二聚体（crossdimer），减少产量；两引物间最好不存在4个连续碱基的同源性或互补性；引物5’端：对扩增特异性影响不大，可在引物设计时加上限制酶位点、核糖体结合位点、起始密码子、缺失或插入突变位点以及标记生物素、荧光素、地高辛等。通常应在5’端限制酶位点外再加3-4个保护碱基；引物不产生falsepriming：不与模板结合位点以外的序列互补，避免错误引发PCR扩增。2024/10/21PCR法获取目的基因213’5’3’5’限制性内切酶的识别序列、启动子序列、定点突变、探针标记TaqDNA聚合酶（Thermusaquaticus)浓度：0.5-2.5U/50L体系，所用的酶量可根据DNA、引物及其它因素的变化进行适当的增减，酶量增加使反应特异性下降，酶量过少影响反应产量；TaqDNA聚合酶活性的半衰期：92.5℃130min；95℃40min；97℃5min；TaqDNA聚合酶的酶活性单位定义：74℃下，30min，掺入10nmol/LdNTP到核酸中所需的酶量；TaqDNA聚合酶的出错率：一般，PCR产物中碱基出错率为1×10-5/bp，在利用PCR克隆和进行序列分析时应注意。类型：TaqDNA聚合酶——普通型，PCR产物末端为A；

PfuDNA聚合酶(Pyrococcusfuriosus)——高保真，出

错率为1×10-6/bp，PCR产物为平末端。2024/10/21PCR法获取目的基因22反应缓冲液（PCRbuffer）组分：一般含10-50mmol/LTris·Cl(20℃下pH8.3-8.8)、50mmol/LKCl和适当浓度的Mg2+；Tris·Cl：在20℃时pH为8.3-8.8，但在实际PCR反应中,pH为6.8-7.8；50mmol/L的KCl：有利于引物的退火；Buffer中加入5mmol/L的二硫苏糖醇(DDT)或100μg/mL的牛血清白蛋白(BSA)，可稳定酶活性；加入T4噬菌体的基因32蛋白对扩增较长的DNA片段有利；各种TaqDNA聚合酶商品都有自己特定的一些缓冲液。2024/10/21PCR法获取目的基因23Mg2+Mg2+的作用：DNA聚合酶的激活剂，可影响酶的活性和真实性,还影响引物退火和解链温度，影响产物的特异性以及引物二聚体的形成等。在PCR反应混合物中，应尽量减少有高浓度的带负电荷的基团（如磷酸基团、EDTA等可能影响Mg2+离子浓度的物质），以保证最适Mg2+浓度；浓度：0.5mmol/L-2mmol/L，Mg2+浓度过低会降低Taq酶活性；Mg2+浓度过高影响反应特异性。对于一种新的PCR反应，可以用0.1-5mmol/L的梯度进行Mg2+预备实验,选出最适的浓度；dNTP可与Mg2+结合：使游离的Mg2+浓度下降,影响DNA聚合酶的活性。2024/10/21PCR法获取目的基因24dNTP（4种三磷酸脱氧核苷酸）浓度：20-200μmol/L，dNTP浓度取决于扩增片段的长度，浓度过高易产生错误碱基的掺入,浓度过低则降低反应产量；理论上4种dNTP各20μmol/L,就足以在100μL反应中合成2.6μg的DNA。当dNTP终浓度大于50mmol/L时可抑制TaqDNA聚合酶的活性；四种dNTP浓度应相等，以减少合成中由于某种dNTP不足而导致的掺入错误；dNTP可与Mg2+结合,使游离的Mg2+浓度下降,影响DNA聚合酶的活性。dNTP制备：应用NaOH将dNTP溶液的pH调至7.0，并用分光光度计测定其准确浓度。dNTP原液可配成5-10mmol/L并分装，-20℃贮存。2024/10/21PCR法获取目的基因252024/10/21PCR法获取目的基因26（2）PCR循环参数预变性：94℃，5min变性：94℃，20s-45s（使双链DNA解链为单链）退火：温度由引物的解链温度Tm决定，时间为45s左右。提高温度能减少引物与模板的非特异性结合降低温度可增加反应的灵敏性。延伸：一般为72℃，时间由扩增片段长度决定。循环次数：主要取决于模板DNA的浓度，一般为25-35次。次数过多，导致扩增效率降低，错误掺入率增加。到达平台期(Plateau)所需循环次数取决于样品中模板的拷贝数。延伸补齐：72℃，5min—10min2024/10/21PCR法获取目的基因274.注意事项PCR实验应该在一个没有核酸和核酸酶污染的环境中进行。操作过程中均应戴手套。最好设立一个专用的PCR实验空间。PCR试剂配制应使用最高质量的新鲜双蒸水，采用0.22μm滤膜过滤除菌或高压灭菌。试剂都应该以大体积配制，试验一下是否满意，然后分装成仅够一次使用的量储存，从而确保实验与实验之间的连续性。试剂或样品准备过程中都要使用一次性灭菌的塑料瓶和管子，玻璃器皿应洗涤干净并高压灭菌。PCR的样品应在冰上融解，并且要充分混匀。2024/10/21PCR法获取目的基因28EB是强诱变剂并有中等毒性，配制和使用时都应戴手套,并且不要把EB洒到桌面或地面上。凡是沾污了EB的容器或物品必须经专门处理后才能清洗。沾染了EB的实验垃圾需专门回收处理。观察DNA离不开紫外透射仪，可是紫外光对DNA分子有切割作用。从胶上回收DNA时，应尽量缩短光照时间并采用长波长紫外灯(300-360nm），以减少紫外光切割DNA。制备PCR反应体系时，每加完一个组分，要更换tip头，以防止互相污染。电泳加样时，也要每个样品更换tip头，并要小心操作，避免损坏凝胶或将样品槽凝胶刺穿。2024/10/21PCR法获取目的基因29阳性对照:选择扩增度中等、重复性好，经各种鉴定是该目的产物的标本作为阳性对照样品，如以重组质粒为阳性对照，其含量宜低不宜高(100个拷贝以下)。但阳性对照尤其是重组质粒及高浓度阳性标本，对检测或扩增样品污染的可能性很大。因而当某一PCR试剂经自己使用稳定，检验人员心中有数时，在以后的实验中可免设阳性对照。2024/10/21PCR法获取目的基因30阴性对照:每次PCR实验务必安排阴性对照，包括标本对照:经确认的阴性标本试剂对照:在PCR反应混合物中不加模板，进行PCR扩增，以监测试剂是否受到污染（能控制贮存试剂可能出现的污染或加样器被DNA模板的气溶胶污染）。5.防止污染的方法合理分隔实验室:将样品的处理、配制PCR反应液、PCR循环扩增及PCR产物的鉴定等步骤分区或分室进行。最好能划分标本处理区、PCR反应液制备区、PCR循环扩增区、PCR产物鉴定区等。实验用品及吸样枪应专用。吸样枪污染：实验操作时不慎将样品或模板吸入枪内或粘上枪头是一个严重的污染源，因而加样或吸取模板时要十分小心。吸样要慢，吸样时尽量一次性完成，忌多次抽吸，以免交叉污染或产生气溶胶污染。2024/10/21PCR法获取目的基因31预混和分装PCR试剂:所有的PCR试剂都应小量分装，如有可能，PCR反应液应预先配制好，然后小量分装，-20℃保存。以减少重复加样次数，避免污染机会。另外，PCR试剂，PCR反应液应与样品及PCR产物分开保存，不应放于同一冰盒或同一冰箱。防止操作人员污染，使用一次性手套、吸头，小离心管应一次性使用。设立适当的阳性对照和阴性对照。2024/10/21PCR法获取目的基因32减少PCR循环次数，只要PCR产物达到检测水平就适可而止。选择质量好的Eppendorf管，以避免样本外溢及外来核酸的进入，打开离心管前应先离心，将管壁及管盖上的液体甩至管底部。开管动作要轻，以防管内液体溅出。6.实验举例本实验以含有小鼠基因T10的质粒pCMV-Myc-T10为模板，扩增长约800bp的T10基因的PCR产物。2024/10/21PCR法获取目的基因33InsertEcoRIXhoIpCMV-Myc-T102024/10/21PCR法获取目的基因34PCR仪、台式离心机、灭菌的微量离心管、凝胶电泳系统等TaKaRaTaq(5U/µl)10×PCR缓冲器(含Mg2+)dNTP混合(各2.5mmol/L)模板(10ng，质粒)引物（P1和P2,10mmol/L)实验仪器及材料10×PCR缓冲液：(100mmol/LTris-HCl,pH8.3,500mmol/LKCl,15mmol/LMgCl2)2024/10/21PCR法获取目的基因35P1:5’TTCCAAGCTTCACCATGGCATCAATGCAGAAGC保护性碱基HindIIITm=4（G＋C）＋2（A＋T）＝4×12＋2×11＝70℃.P2:5’TCGCGGATCCAGTGGCAGCTTGCTAATCTCATTG保护性碱基BamHITm=4（G＋C）＋2（A＋T）＝4×11＋2×13＝70℃.引物设计2024/10/21PCR法获取目的基因36模板:1µl(10ng)P1:1µl(0.5μmol/L)P2:1µl(0.5μmol/L)dNTPs:4µl(0.3mmol/L)Taqpolymerase:0.5µl(2.0U/µl)10×缓冲液（Mg2+）:5µlddH2O:37.5µlPCR反应体系（50μl）2024/10/21PCR法获取目的基因3794℃变性5min后开始以下循环94℃变性反应45sec65℃退火反应45sec72℃延伸反应1min进行30个循环最后，72℃反应7min；4℃冷却，保存。PCR反应条件2024/10/21PCR法获取目的基因38取3-5µlPCR产物，采用1.2％琼脂糖凝胶电泳分析PCR产物的量，检测引物扩增的特异性，并可根据标准脱氧核糖核酸（marker）的量粗略计算PCR产物的总量。学生实验结果(4µl)PCR产物检测1.0kbMarker目的产物2024/10/21PCR法获取目的基因39

四、PCR的类型1.不对称PCR目的：扩增产生特异长度的单链DNA。方法：采用两种不同浓度的引物，分别称为限制性引物和非限制性引物,其最佳比例一般是0.01μmol/L：0.5μmol/L，关键是限制性引物的绝对量。用途：制备核酸序列测定的模板制备杂交探针2024/10/21PCR法获取目的基因40

高浓度引物低浓度引物2024/10/21PCR法获取目的基因412.降落PCR(touch-downPCR)

在多个PCR循环中，退火温度逐步降低。开始的退火温度选择为高于Tm值，随着循环进行，退火温度逐渐降低到Tm值，并最终低于这个水平。选择初始复性温度的原则：起始复性温度应该比引物的Tm值高出5-10度，然后每个循环递减1-2度。原理：随着退火温度的降低，特异性逐步降低，但特异性条带在温度较高时已经扩增出来，其浓度远远超过非特异性条带，随着退火温度的降低，特异性条带优先被扩增。2024/10/21PCR法获取目的基因423.热起动PCR(hotstartPCR)热起动PCR是除了设计好的引物之外，提高PCR特异性最重要的方法之一。尽管TaqDNA聚合酶的最佳延伸温度在72℃，但聚合酶在室温仍然有活性。因此，在进行PCR反应配制过程中，以及在热循环刚开始时，保温温度低于退火温度时会产生非特异性产物。这些非特异性产物一旦形成，就会被有效扩增。进行反应之前，先不加Taq酶，等温度上升到72℃后再加入Taq酶。PlatinumDNA聚合酶用于自动热起动PCR。常温时活性被封闭，94—95℃加热几分钟后才激活其活性。2024/10/21PCR法获取目的基因432024/10/21PCR法获取目的基因444.嵌套PCR(nestedprimerPCR)采用两对引物进行PCR，其中第二对引物位于第一对引物内P1上P1下P2上P2下用途：验证第一次PCR产物的特异性；合成探针模板。5.反向PCR(reversePCR)目的：是用反向的互补引物来扩增两引物以外的DNA片段，对某个已知DNA片段两侧的未知序列进行扩增。用途：探索邻接已知DNA片段的序列；用于仅知部分序列的全长cDNA的克隆；建立基因组步移文库。已知序列未知序列未知序列2024/10/21PCR法获取目的基因45PCR法获取目的基因6.多重PCR（复合PCR）目的：用于检测特定基因序列的存在或缺失。电泳引物123412342024/10/21467.LP-PCR（Labelledprimers)目的：利用同位素、荧光素等对PCR引物进行标记，用以直观检测目的基因。用途：特别适合大量临床标本的基因诊断；可同时检测多种基因成分。病毒1病毒2病毒3病毒42024/10/21PCR法获取目的基因47标记引物ＰＣＲ观察PCR产物2024/10/21PCR法获取目的基因488.锚定PCR（anchoredPCR,A-PCR）PCR技术需了解靶基因片段两个末端的序列对于未知序列怎么办？2024/10/21PCR法获取目的基因49cDNA末端核酸转移酶3’GG…GG5’CC…CC锚定引物3’GG…GG5’CC…CC3’GG…GGCC…CC锚定PCR首先合成第一链cDNA，然后再添加一同聚物尾巴（polydG)，利用与同聚物尾巴配对的3’锚定引物（带有限制性内切位点的polydC)一起作PCR扩增。2024/10/21PCR法获取目的基因509.PCR固相分析法模板生物素化引物PCR扩增探针亲和固相介质检测探针信号可用于基因芯片的制作2024/10/21PCR法获取目的基因5110.原位PCR（1）原位PCR的概念原位聚合酶链式反应（

insituPCR，ISPCR）：由Haase等于1990年建立。它利用完整的细胞作为一个微小的反应体系来扩增细胞内的目的片段。在不破坏细胞的前提下，利用一些特定的检测手段来检测细胞内的扩增产物。直接用细胞涂片或石蜡包埋组织切片在单个细胞中进行PCR扩增，可进行基因表达的细胞定位，适用于检测病理切片中含量较少的靶序列。2024/10/21PCR法获取目的基因52

（2）原位PCR的作用鉴定细胞内特异序列一般采用原位杂交（ISH），但在每个细胞中目的片段的拷贝数少于10的情况下，该方法的敏感度就明显下降。而标准的PCR则可扩增出细胞内单拷贝的序列，敏感度很高，但却未能与细胞形态学研究相结合。ISPCR则可把这两者结合起来，成为细胞学诊断中一种有效的检测技术。利用该方法可检测细胞内病毒感染、细胞内基因重排以及分析细胞内RNA的表达产物。2024/10/21PCR法获取目的基因53（3）操作步骤细胞或组织固定：细胞经固定和乙醇通透化处理后使得一般PCR试剂（包括引物和Taq酶）能够进入细胞PCR扩增细胞内目的片段原位杂交检测扩增产物A.阳性对照B.阴性对照C.原位检测mRNA表达2024/10/21PCR法获取目的基因5411.反转录PCR（RT-PCR)逆转录酶DNA聚合酶mRNAcDNADNA-RNA杂合双链PCR扩增2024/10/21PCR法获取目的基因552024/10/21PCR法获取目的基因5612.荧光定量PCR（real-timePCR)

原理：通过荧光染料或荧光标记的特异性探针，对PCR产物进行标记跟踪，实时在线监控PCR反应过程，结合相应的软件可以对结果进行分析，计算待测样品的初始模板量。2024/10/21PCR法获取目的基因57（1）荧光定量PCR标记方法内掺式染料：SYBRGreenI序列特异性探针TaqmanMolecularBeacons（分子信标）：DualProbes(FRET)荧光共振能量转移Amplifluor(Intergen)2024/10/21PCR法获取目的基因58（2）荧光定量实时PCR与普通PCR的比较实时在线监控：对样品扩增的整个过程进行实时监控，能够实时地观察到产物的增加，直观地看到反应的对数期。降低反应的非特异性：使用引物和荧光探针同时与模板特异性结合，提高了PCR反应的特异性。增加定量的精确性：全程监控，利用准确的算法进行定量。结果分析更加快捷方便，无需电泳检测

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