《微生物的遗传变异与菌种选育》课件

微生物的遗传变异与菌种选育了解微生物遗传变异的物质基础。掌握基因突变的实质、类型、特点和机制。了解不同类型微生物的基因重组。学会依据微生物的遗传特性设计工业微生物菌种的筛选程序，并能合理保藏所得菌种。目的要求主要内容1、微生物遗传变异的物质基础2、微生物的基因突变3、微生物的基因重组4、微生物的菌种选育5、微生物菌种保藏及复壮遗传（heredity

）:上一代生物将自身的一整套遗传基因稳定地传递给下一代的特性。变异（variation）：

生物体在某种外因或内因的作用下，发生遗传物质结构或数量的改变，而且这种改变稳定，具有可遗传性。几个概念1.遗传与变异遗传保证了微生物种的相对稳定性、种的存在和延续，而变异则推动了种的进化和发展。2.遗传型和表型遗传型（genotype）表型(phenotype)某一生物体个体所含有的全部遗传因子，即基因的总和

，又称为基因型。某一生物体所具有的一切外表特征及内在特性的总和。

遗传型表型环境条件＋代谢、发育饰变（modification）

表型的差异只与环境有关。不涉及遗传物质结构改变而只发生在转录、转译水平上的表型改变。

谷氨酸发酵的温度敏感菌株在30℃时菌体生长而不产生氨基酸，但是当温度提高到37℃时，菌体大量合成谷氨酸。3.饰变特点：暂时性、不可遗传性、表现为全部个体的行为。比表面积大；个体易变异；便于建立纯系；作为遗传研究材料4、微生物是遗传学研究中的明星5.1微生物遗传变异的物质基础一、证明核酸是遗传物质基础的三个经典实验二、遗传物质在细胞内存在部位和方式肺炎双球菌转化实验（讲）--遗传物质是DNA噬菌体的感染实验--DNA是遗传物质，且其中含有合成蛋白质的遗传信息

病毒重建实验—遗传物质是RNA1928年F.Griffith，1944年Avery，肺炎双球菌的转化实验1）动物实验活的S菌抽心血分离证明：DNA是转化所必需的转化因子2）细菌培养实验热死S菌不生长3）S菌的无细胞抽提液实验活R菌+S菌的无细胞抽提液长出大量R菌和少量S菌Avery抽提细胞DNA、RNA、蛋白质、荚膜多糖活R菌加S菌的DNA加S菌的DNA+DNA酶以外的酶加S菌的DNA+DNA酶分别加S菌的RNA、蛋白质、荚膜多糖长出S菌只长出R菌肺炎双球菌活R菌热死S菌+活R菌长出R菌长出大量R菌+极少S菌培养培养1952年Hershey，Chase，噬菌体感染实验T2噬菌体感染试验示意图植物病毒的重建实验证明杂种病毒的蛋白质外壳来自TMV还是HRV,可用血清学反应鉴定证明核酸（RNA）是遗传的物质基础血清学反应说明病毒蛋白质的特性由核酸而定H.Fraenkel-Conrat(1956年)病斑的特性和病毒核酸一致二、遗传物质在细胞内存在的部位和方式（一）七个水平细胞水平（单核，多核）细胞核水平（真核，拟核，质粒）染色体水平核酸水平（DNA，部分病毒为RNA；双链，少数病毒为单链）基因水平（遗传功能单位）密码子水平（遗传信息单位）核苷酸水平（最低突变单位和交换单位）（一套，两套）基因（gene）是什么?

是实体，其物质基础是DNA

（或RNA）；

是一个含有特定遗传信息的DNA分子区段；

是遗传信息传递和性状分化发育的依据；

基因是可分的，根据功能不同，分为：编码蛋白质的基因结构基因（结构蛋白，酶）调节基因（阻遏蛋白或激活蛋白）无翻译产物的基因tRNA基因（简称tDNA）

rRNA基因（简称rDNA）不转录的DNA区段启动子（promotor）操纵基因（operator）

基因是一个含有特定遗传信息的核苷酸序列，它是遗传的功能单位。微生物的质粒和转座因子质粒（plasmid）：

一种独立于染色体外，能进行自主复制的细胞质遗传因子，主要存在于各种微生物细胞中。转座因子（transposableelement）：

位于染色体或质粒上的一段能改变自身位置的DNA序列，广泛分布于原核和真核细胞中。质粒分子的大小范围从1kb左右到1000kb；质粒性质：自主复制；转移性；质粒的不亲和性；质粒可消除性；包括插入序列IS、转座子Tn和某些特殊病毒Mu。效应：插入突变、染色体畸变、基因移动和重排。质粒的主要类型根据质粒所编码的功能和赋予宿主的表型效应分类:致育因子（Fertilityfactor，F因子）抗性质粒（Resistancefactor，R因子）产细菌素的质粒（Bacteriocinproductionplasmid）毒性质粒（virulenceplasmid）代谢质粒（Metabolicplasmid）隐秘质粒（crypticplasmid）2µm质粒根据拷贝数或复制特点，质粒可分为：高拷贝数(highcopynumber)质粒（每个细胞中可以有10~100个拷贝,

其复制和染色体的复制不同步）如ColE1、ColE2等

———————松弛型质粒(relaxedplasmid)低拷贝数(lowcopynumber)质粒（每个细胞中只有1~2个拷贝,

其复制行为与染色体的复制同步）如F因子，R100———————严谨型质粒(stringentplasmid)窄宿主范围质粒(narrowhostrangeplasmid)（只能在一种特定的宿主细胞中复制）广宿主范围质粒(broadhostrangeplasmid)（可以在许多种细菌中复制）5.2微生物的基因突变1、突变的类型2、突变的特点3、突变的机制野生型:

------从自然界分离到的菌株一般称野生型菌株（wildtypestrain），简称野生型。突变株:-----野生型经突变后形成的带有新性状的菌株，称为突变株（mutant）。

染色体畸变：是指染色体较大范围内结构的变化，如缺失、重复、倒位、易位等以及染色体数目的变化。1、突变的类型突变：指遗传物质突然发生稳定的可遗传的变化，影响生物正常遗传的表型和性能的现象。1）突变涉及的范围，可分为:基因(点)突变：是指一个基因内部遗传结构或DNA序列的任何改变，涉及一对或少数几对碱基的置换、缺失或插入碱基置换：各种类型的转换和颠换移码突变：碱基对的增减则造成增减变异点以后全部密码及其编码的氨基酸改变。？？1.★营养缺陷突变型：2.抗性突变型：★抗药、紫外线、噬菌体；3.★条件致死突变型：4.形态突变型：5.抗原突变型：6.产量突变型：2）突变的表型可分为：（1）营养缺陷型（auxotroph）

一种缺乏合成其生存所必须的营养物（包括氨基酸、维生素、碱基等）的突变型。营养缺陷型是微生物遗传学研究中重要的选择标记和育种的重要手段表型判断的标准：在基本培养基上能否生长特点：在选择培养基（一般为基本培养基）上不生长负选择标记突变株不能通过选择平板直接获得营养缺陷型的表示方法：基因型：所需营养物的前三个英文小写斜体字母表示：hisC（组氨酸缺陷型，其中的大写字母C同一表型中不同基因的突变）表型：同上，但第一个字母大写，且不用斜体：HisC在具体使用时多用hisC-和hisC+，分别表示缺陷型和野生型。（2）抗药性突变型（resistantmutant）使菌株对某种或某几种药物（如抗生素），产生抗性。特点：正选择标记（突变株可直接从抗性平板上获得-----在加有相应抗生素的平板上，只有抗性突变能生长。）表示方法：所抗药物的前三个小写斜体英文字母加上“r”表示strr和strs分别表示对链霉素的抗性和敏感性（3）条件致死突变型（conditionallethalmutant）

在某一条件下具有致死效应，而在另一条件下能正常生长、繁殖的突变型。常用的条件致死突变是温度敏感突变，用ts（temperaturesensitive）表示，这类突变在高温下（如42℃）是致死的，但可以在低温（如25-30℃）下得到这种突变。特点：负选择标记这类突变型常被用来分离生长繁殖必需的突变基因（4）形态突变型（morphologicalmutant）造成形态改变的突变型特点：非选择性突变突变株和野生型菌株均可生长，但可从形态特征上进行区分。举例：产蛋白酶缺陷突变株的筛选菌落颜色变化β半乳糖苷酶基因的插入失活，使重组子菌落为白色而与兰色的非重组子分开。形成芽孢缺陷菌株（5）抗原突变型

由于突变引起的细胞抗原结构发生变异的类型。细胞壁缺陷变异荚膜、鞭毛成分变异（6）产量突变型

通过基因突变而产生的在代谢产物产量上明显有别于原始菌株的突变。正突变（plusmutant）负突变（minusmutant）3）突变的条件和原因自发突变：在自然条件下微生物发生的基因突变。突变率为10-8个左右。诱发突变：人工理化因素处理微生物引起的突变。物理诱变：化学诱变：复合诱变：定向培育和驯化：1）自发性2）非对应性3）稀有性4）独立性5）可诱变性6）稳定性7）可逆性2、基因突变的特点突变性状与突变原因不对应(如何证明)突变基因的性状是稳定的诱变剂可提高突变率，10-106倍不同基因的突变互不影响自发突变几率低，10-6--10-9回复突变证明突变的性状与引起突变的原因间无直接对应关系！三个经典实验变量实验（讲）、涂布实验、影印实验基因突变自发性和非对应性的证明驯养论？？变量实验（fluctuationanalysis）SalvadorLuriaandMaxDelbruck（1943）TheNobelPrizeinPhysiologyorMedicine1969对噬菌体T1敏感的E.coli对数期培养物，稀释至103/mL,分装两试管，各10mL与甲管分装的各小管同时保温24~36h甲管乙管Newcombe的涂布实验（1949）在涂布过的一组中，共长出抗性菌落353个，比未经涂布过的（28个菌落）高得多约繁殖了12.3代选用对T1噬菌体敏感的E.coli，以相等数目涂布于12个平板上影印实验（replicaplating）JoshuaLederbergandEstherLederberg（1952）通过使菌不接触抗性环境而检查其抗性菌落的方法J.LederbergisawardedtheNoblePrizeinMedicineandPhysiologyin19583、基因突变的机制3.1自发突变的机制3.2诱发突变的机制突变真的与选择压力无关吗？？3.1自发突变的机制1）多因素低剂量的诱变效应：2）微生物自身代谢产物的诱变效应：咖啡碱、硫氰化合物、二硫化二丙烯、重氮丝氨酸；H2O23）互变异构效应：正-反的互变：碱基-脱氧核糖键旋转造成。4）环状突变效应：向外环出恢复正常错配3.2诱发突变的机制碱基对的置换移码突变染色体畸变直接间接该类诱变剂与碱基起化学反应，改变碱基的结构，导致错配。亚硝酸：G-CA-T转换互变各种烷化剂：G-CA-T互变羟胺：只引起G-CA-T转换（专一性与C起反应）1）碱基置换——1）直接讲1次2次烷化剂甲基磺酸乙酯（EMS）甲基磺酸甲酯（MMS）硫酸二乙酯（DES）

N-甲基-N’-硝基-N-亚硝基胍

(NTG)氮芥、硫芥环氧乙烷亚硝基胍：诱变作用强，称为超强诱变剂（突变率1%）；能诱发邻近位置的基因同时发生突变，即所谓并发突变。很多烷化剂除了能诱发点突变外，还能诱发染色体畸变。由于染色体畸变常为辐射所诱发，所以这些物质又称为拟辐射物质。

烷化剂作用的主要机理是引起碱基上某些能形成氢键的基团发生烷基化。烷化位点主要在鸟嘌呤的N‐7位和腺嘌呤的N‐3位上，烷化后的碱基也像碱基结构类似物一样能引起碱基配对的错误。烷化剂的另一作用是使嘌呤整个地从DNA链上脱下来，产生一个缺口，在与缺口相对应的位点上就能配上任何一个碱基，从而引起转换或颠换。1）碱基置换——2）间接它们在DNA复制中能掺入DNA分子中，由于其产生异构体的频率高，因此发生的错误配对可引起碱基的置换。

一类与正常碱基结构相似的物质，称为碱基类似物。如：5-BU,8-NG,2-AP等。A-TA-TA-BUA-TG-BUG-CA-BU加入5-BU扁平的三个苯环结构类似于碱基对的化合物，能插入DNA碱基对间，使碱基增加或缺失而造成。吖啶、吖啶黄、吖啶橙，5-氨基吖啶、溴化乙锭。2）移码突变紫外线（UV）

、x射线、γ射线等、亚硝酸及烷化剂3）染色体畸变常用的非电离辐射诱变因子。作用机制：

DNA链的断裂、

DNA双链的交联、嘧啶的水合作用相邻碱基形成嘧啶二聚体（TT,TC,CC）等。

其中最主要的效应是TT的形成(链间、链内)。

影响解链——复制与转录——死亡影响氢键—扭曲变形—碱基配对—突变或死亡DNA紫外损伤的修复系统（研究较详细）光复活作用（讲）切除修复作用重组修复作用紧急呼救（SOS）修复系统光复活作用光解酶“T-T”

结合酶-DNA专一识别黑暗光解光照“T-T”

拆开，酶再释放提高诱变率方法：用紫外线照射菌液后，要在红灯下操作处理，再于暗室中或用黑布包起来培养。原理可见光可大大降低经紫外线照射后微生物死亡率的现象。一种普遍的修复系统。能移去TT和修复大多数引起的DNA扭曲损伤。该修复系统不需要可见光，通过酶切作用移去损伤的碱基（包括损伤位点附近的一些碱基），随后合成一段正常DNA链。

内切核酸酶

4种酶参与外切核酸酶

DNA聚合酶

DNA连接酶切除修复（excisionrepair，又称暗修复）重组修复一种越过损伤而进行的修复。这种修复不将损伤的碱基除去，而是通过复制后，经染色体交换，使子链上的空隙部位不再面对着嘧啶二聚体，而是面对着正常的单链，在这种情况下，DNA聚合酶和连接酶便能起作用，把空隙部分进行修复。留在亲链上的二聚体仍要依靠再一次的切除修复加以除去，或经细胞分裂而稀释掉。这是细胞经诱导产生的一种应急反应.细胞中有许多基因和操纵子受RecA蛋白协同调控和LexA阻遏蛋白的抑制。

SOS修复系统是由RecA蛋白诱导的，由于存在较多DNA损伤时，RecA蛋白构型改变显示出激活态。激活态的RecA蛋白切开LexA阻遏蛋白，从而解脱受抑制的的recA和其他修复基因,对形成的“T-T”进行切除修复。SOS修复系统

诱变剂与致癌物质——Ames试验a）利用各种诱变剂获得各类遗传突变；c）危害人类自身的健康b）对有害微生物进行控制；许多种化学物质，能以各种机制导致DNA的突变补充美国加利福尼亚大学的BruceAmes教授于1966年发明，称为Ames试验生物化学统一性法则：

人和细菌在DNA的结构及特性方面是一致的，能使微生物发生突变的诱变剂必然也会作用于人的DNA，使其发生突变，最后造成癌变或其他不良的后果。超过95%的致癌物质对微生物有诱变作用。90%以上的非致癌物质对微生物没有诱变作用。鼠伤寒沙门氏菌营养缺陷型菌株在基本培养基平板上不能生长；如果该菌株接触化学试剂后再接种到基本培养基平板上能生长；则表明在基本培养基上得到了该菌株的突变株，进而推断所接触的化学试剂具有诱变作用，因而表明其为“三致”试剂。Ames试验原理：Ames试验丙烯酰胺黄曲霉素氨基芴对照回复突变自发回复突变可疑“三致”样品鼠肝匀浆（含加氧酶）保温吸入滤纸片回复突变阳性阴性

由于生物体内、体外可能存在的差异，可在体外加入哺乳动物（如大鼠）微粒体酶系统，使待测物活化，使Ames试验的准确率达80-90%。证明Ames试验重要性的应用实例（自己阅读）：

国外曾开发了一种降低妇女妊娠反应的药物“反应停”，由于其药效显著，在60-70年代十分流行.

但随后人们就发现畸形儿的出生率明显增高，而且生产畸形儿的妇女大多曾服用“反应停”，后来采用Ames试验发现这种物质的确具有很强的致突变作用，因此这种药物被禁止使用.5.3微生物的基因重组基因重组（遗传传递）：指遗传物质从一个微生物细胞向另一个微生物细胞传递(接触或不接触)而达到基因的改变，形成新遗传型个体的过程。原核微生物的基因重组噬菌体的基因重组真核微生物的基因重组1.转化：1928，Griffith2.转导：1951，Lederberg和Zinder3.接合：1946，Lederberg和Tatum4.溶原性转变一、原核微生物的基因重组转化：受体细胞直接吸收供体细胞的DNA片段,并与其染色体同源片段进行遗传物质交换，使受体细胞获得新的遗传性状的现象。

转化（transformation）转化因子受体细胞感受态转化子高1000倍吸附吸收整合(2)转化过程供体(strR)dsDNA感受态受体(strS)酶解与吸收单链同源区段配对单链整合复制与分离转化子(strR)非转化子(strS)转化因子进入细胞

转化因子单链配对与整合

复制

分离

转导（transduction）转导：利用完全或部分缺陷噬菌体为媒介，把供体细胞的小片段DNA携带到受体细胞中，通过交换与整合，使后者获得前者部分遗传性状的现象。

由转导作用而获得供体细胞部分遗传性状的重组受体细胞称为转导子（transductant）

携带供体部分遗传物质（DNA片段）的噬菌体称为转导噬菌体。细菌转导的二种类型：普遍性转导特异性转导1、普遍性转导（generalizedtransduction）

通过极少数完全缺陷噬菌体对供体菌基因组上任何小片段DNA进行误包，而将其遗传性状传递给受体菌的现象，称普遍性转导。(1)意外的发现1951年，JoshuaLederberg和NortonZinder为了证实大肠杆菌以外的其它菌种是否也存在接合作用，用二株具不同的多重营养缺陷型鼠伤寒沙门氏菌LT22A（P22）和LT2

实验：

用“U”型管进行同样的实验时，在供体和受体细胞不接触的情况下，同样出现原养型细菌！沙门氏菌LT22A是携带P22噬菌体的溶源性细菌另一株LT2是非溶源性细菌一个表面看起来的常规研究却导致一个惊奇和十分重要发现的重要例证！基因的传递很可能是由可透过“U”型管滤板的P22噬菌体介导的(在接种LT22A的一端出现了原养型)（普遍性转导这一重要的基因转移途径的发现）沙门氏菌的普遍性转导进入受体的外源DNA通过与细胞染色体的重组交换而形成稳定的转导子（完全转导）如果受体菌通过普遍转导获得了供体菌DNA片段后，在其体内不发生基因的交换、整合和复制，只进行转录、翻译和性状的表达。这种转导被称为流产转导.供体片段单线传递2.特异性转导（specializedtransduction）

定义：通过部分缺陷的温和噬菌体把供体菌的少数

特定基因携带到受体菌中，并与后者的基因组整合、重组，形成转导子的现象。媒介：部分缺陷噬菌体（丢失自身一部分基因，并被同等长度的宿主基因所取代）

只能转导个别特定基因大肠杆菌中λ噬菌体的正常裂解及半乳糖基因转导噬菌体的形成过程galbiogalbiogalbiogalbiobiogal正常误切

溶原性转变（lysogenicconversion）：一个与转导相似又不同的现象定义:温和噬菌体感染细胞后使之发生溶源化，因噬菌体的基因整合到宿主染色体上，而使后者获得了新性状的现象。溶原性转变与转导的不同？a）噬菌体不携带任何供体菌的基因；b）这种噬菌体是完整的，而不是缺陷的；接合(conjugation)通过细胞与细胞的直接接触而产生的遗传信息的转移和重组过程。中间平板上长出的原养型菌落是两菌株之间发生了遗传交换和重组所致！

为减少所培养的结果是回复突变的机会，采用双重或三重营养缺陷型。该实验是建立在不大可能同时发生两种或三种回复突变的设想上的。细菌遗传重组单向过程和F因子的提出

F－菌株F＋菌株F质粒的四种存在方式及相互关系F++F-2F+

F′+F-2F′Hfr+F-

多种情况

Hfr+F-Hfr＋F-（多数情况下;高出几百倍以上

）

Hfr+F-Hfr＋Hfr（少数情况下）

接合的结果F+F-F+F-F+F+F+F+起点接合管断裂进入滚环复制合成互补链分开接合管染色体DNAF因子复制起点，开始复制1条链进入复制互补链重组易断裂二、噬菌体的基因重组烈性噬菌体

噬菌体h+r-×h-r+产生的四种子裔噬菌体形成的噬菌斑透明而小半透明而大半透明而小透明而大温和性噬菌体：溶原现象。无速溶性状,寄主范围扩大寄主范围正常,但具速溶性状1.有性杂交：指性细胞间的接合和随之发生染色体重组，并产生新遗传型后代的一种方式。2.准性生殖：指两个体细胞融合，不经过减数分裂就能导致基因重组的生殖过程。菌丝联结：形成异核体：独立生活。核融合(2倍体)：10-5--10-7分离子的产生：有丝分裂过程中染色体会发生交换和单倍体化。三、真核微生物的基因重组5.4.1自然界工业菌种筛选程序5.4.2诱变育种5.4.3杂交育种5.4.4原生质体育种5.4.5基因工程技术用于工业菌种改良5.4微生物的菌种选育采样

增殖培养

培养分离筛选毒性试验方法、地点、时间和周围环境记录纯种分离的原则就是使培养物获得单个菌落：1．稀释平板(倾注/涂布)分离法2．平板划线分离法

测定代谢产物或其它目的性状一、自然界工业菌种筛选程序目标菌数量少问题？？具体实例/如何鉴定1、步骤和方法原菌株（出发菌株）纯化细胞或孢子悬浮液诱变处理中间培养突变株分离初筛复筛生产性试验诱变预备实验活细胞计数离心收集菌体离心洗涤玻璃珠振荡分散过滤活细胞计数物理方法：紫外线、射线、等离子等化学方法：与碱基反应、碱基类似物、移码突变剂复合法：形态突变：淘汰平皿反应：挑取变异菌株（变色圈、透明圈、生长圈、抑菌圈等）

二、诱变育种90-99.9%变异菌株的初步筛选

纸片培养显色法

透明圈法琼脂块培养法

2.筛选方法（1）抗药性突变型的筛选（2）营养缺陷型突变体的筛选

什么叫营养缺陷型菌株?？？？指某些微生物通过诱变处理使其在一些营养物质的合成能力上出现缺陷，不能合成，只能外源提供。明确几种培养基:基本培养基(MM)完全培养基(CM)补充培养基(SM)⑴基本培养基：凡是能满足某种野生型菌株营养要求的最低成分的合成培养基，称为基本培养基；常以‘[-]’表示；⑵在基本培养基中加入一些富含氨基酸、维生素及含氮碱基之类的天然有机物质如蛋白胨、酵母膏等，以满足该微生物的各种营养缺陷型菌株都能生长繁殖的培养基，称为完全培养基，常用‘[+]’表示；⑶在基本培养基中只是有针对性地加入某一种或某几种营养缺陷成分，以满足相应的营养缺陷型生长的培养基，称为补充培养基，补充培养基可按所加入营养成分相应地用‘[A]’、‘[B]’等来表示。

营养缺陷型菌株筛选步骤诱变处理淘汰野生型菌株(浓缩缺陷型)检出缺陷型确定生长谱抗生素法:诱变处理液在MM中培养短时,野生型生长活化,缺陷型处于“休眠”,加入抗生素,杀死野生型,保存缺陷型.青霉素、制霉菌素。菌丝过滤法：丝状真菌。野生型孢子萌发菌丝而缺陷型不能，过滤除去菌丝，反复几次，达到浓缩。差别杀菌法：细菌芽孢较营养体耐热。①诱变处理:同一般诱变处理.②淘汰野生型菌株：百分之几至千分子几③检出缺陷型：方法四种基本培养基含诱变处理后菌液的基本培养基基本培养基第1次长出的菌落第2次长出的菌落夹层培养法完全培养基（第1次培养后，再倒）逐个检出法完全培养基完全培养基基本培养基影印法限量补充培养法补充培养基(如＜0.01%蛋白胨)含菌的基本培养基④确定生长谱含菌MM含某生长因子MM营养缺陷型菌株的应用（p163-164）1、分析生长因子（如食品中氨基酸、维生素）；2、遗传标记菌种；3、测定微生物的代谢途径，获得更多代谢产物三、杂交育种基因重组是杂交育种的理论基础。前述。亲本菌株（供体和受体）已知性状；有方向性四、原生质体育种将遗传性状不同的两种菌（种内、间、属间）融合为一个新细胞的技术。五、基因工程技术用于工业菌种改良基因工程技术：基因操作、基因克隆、DNA重组。将含目的基因DNA片段经体外操作与载体连接，转入一个受体细胞并使之扩增、表达的过程。目的基因载体选择体外重组导入细胞筛选鉴定分离、合成、逆转为c