苏教版高中生物选修1 第二节分子生物学技术

第二节分子生物学技术

【学习目标】

1.根据DNA复制的原理及过程，理解PCR技术的原理及过程。

2.掌握PCR技术的基本操作。

【学习重、难点】

重点

1.尝试PCR（DNA聚合酶链式反应）技术的基本操作。

2.理解PCR的原理，讨论PCR技术的应用。

难点

1.尝试PCR（DNA聚合酶链式反应）技术的基本操作。

2.体验PCR这一常规分子生物学实验方法。

【学习要点梳理】

一、PCR体外扩增DNA与生物体内DNA复制的比较

体内复制PCR反应

在解旋酶的作用下，细胞提供加热至94℃左右，双链全部解

解旋

不同能量，部分解开开，不需解旋酶

点

可以是RNA或单链DNA分子片

引物小段RNA

段

分别从两条链的引物端开始，都

不同合成在引物基础上，一条链连续合

是连续合成，控制温度在72℃

点子链成，另一条链不连续合成

左右

特点边解旋边复制，半保留复制体外迅速扩增

DNA

需要TaqDNA

聚合需要

聚合酶

酶

循环

受生物体自身控制30多次

次数

不同

点温度体内温和条件高温（可变）

产物完整DNADNA片段

①需提供DNA复制的模板

②以四种脱氧核甘酸为原料

相同点

③都需要一定的缓冲溶液

④子链延伸的方向都是从5,端到3,端

特别提醒①DNA母链的3,端对应着子链的5端，即DNA的两条链是反向平行

的。

②解旋酶的作用是使DNA两条链的氢键断开，而DNA聚合酶与DNA连接酶都

可催化形成磷酸二酯键。

③DNA聚合酶是将单个核甘酸加到已有的单链片段的3,羟基上，需要模板，而

DNA连接酶连接的是两条DNA片段的缺口，不需要模板。

④在PCR反应中，加入的四种脱氧核甘酸实际上是四种脱氧核甘三磷酸，既是

原料，也是能源。

⑤在PCR反应中加入的Mg2+实际上是Taq聚合酶的激活剂。

二、PCR技术相关知识分析

LPCR原理：DNA热变性的原理

双链DNA（变隹（些。）>单链DNA

,退火（温度缓慢降低）

2.PCR引物

(1)弓I物是PCR特异性反应的关键,PCR产物的特异性取决于引物与模板DNA

互补的程度。理论上，只要知道任何一段模板DNA序列，就能按其设计互补的

寡核甘酸链作引物，利用PCR就可将模板DNA在体外大量扩增。

(2)引物3,端的碱基，特别是最末及倒数第二个碱基，应严格要求配对，以避

免因末端碱基不配对而导致PCR反应失败。

(3)引物的特异性：引物应与核酸序列数据库的其他序列无明显同源性。

3.PCR扩增的过程

(1)变性：当温度上升到94℃时，双链DNA解旋为单链，如下图:

3f5,

5'3'

94%：

,「

3।।।।।।।।।।।~55।।।।।।।।।।।-3

(2)退火：温度下降至40〜60℃左右时，两种引物通过碱基互补配对与两条

单链DNA结合，如下图：

.1.1.1.1.1.1..；/1115，5,111；..1..1.1.1.1.1.L.

引物I引物n

(3)延伸：当温度上升至72℃左右，溶液中的四种脱氧核甘酸在DNA聚合酶

的作用下，根据碱基互补配对原则合成新的DNA链，如下图：

1111111111r

引物i引物n

4.PCR扩增数目的理论计算

理论上DNA扩增呈指数增长，若只有一个DNA模板，则复制n次后有2n

个DNA；若一开始有m个DNA模板，则复制n次后有mx2n个DNA。实际操

作过程中，由于无关变量的影响，一般来说，实验值要略小于理论值。从第二轮

循环开始，上一次循环的产物也作为