植物组织培养设备及条件

植物组织培养设备及条件

组织培养实验室布局得总体要求

便于隔离便于操作便于灭菌便于观察一、实验室组成基本实验室辅助实验室实验室组成准备室缓冲室无菌操作室培养室细胞生物学实验室温室生化分析实验室水槽实验台搁架培养架培养架培养架培养架药品及仪器柜无菌台无菌台搁架拉窗冰箱搁架电炉门4.5m3.0m3.5m4.0m准备室缓冲室无菌室培养室组织培养准备实验室准备室缓冲室无菌室无菌室10大家应该也有点累了，稍作休息大家有疑问的，可以询问和交流培养室培养架培养间二、仪器设备1)、基本仪器设备

冰箱、电(磁)炉、酸度计、纯水器、天平、移液器、解剖镜、光照培养箱、摇床、生化培养箱、培养基分装器、搅拌器等。冰箱酸度计电炉天平纯水器培养基分装器搅拌器摇床体式显微镜倒置显微镜冷光源电磁搅拌器摇床2)、灭菌设备蒸汽压力灭菌锅、干热消毒柜、过滤灭菌装置、喷雾消毒器、紫外灯。蒸汽压力灭菌锅高压灭菌器干热消毒柜75%酒精喷雾器喷雾消毒器3)、无菌操作设备

超净工作台二、设备、仪器超净工作台(一)设备1、紫外线灭菌灯2、日光灯3、工作台4、凳子5、搁物架6、窗7、推拉门8、缓冲间无菌接种箱4、细胞培养设备

摇床培养架HZC-250恒温振荡培养箱150C

250D

光照培养箱

光照培养箱烘箱5、细胞学鉴定设备光学显微镜、体视显微镜、倒置显微镜倒置显微镜光学显微镜电子天平（0.0001g，0.001g）

酸度计1、玻璃器皿三、培养器皿及实验用具培养皿三角瓶培养瓶2、金属材质用具镊子解剖刀接种针(二)各类器皿

1、器皿得类型(1)培养器皿三角瓶、培养瓶、圆形培养瓶、试管、L形管和T形管(2)分注器(3)刻度移液管(4)微量移液器(5)细菌过滤器(三)器械用具打孔器镊子解剖刀接种针剪刀电热灭菌器

四、洗涤技术1、玻璃器皿洗涤已用过的玻璃器皿1%稀HCl浸渍12h洗衣粉洗涤清水冲洗晾干备用新购置玻璃器皿2、塑料用品洗涤新的塑料器皿打开即用已用过的塑料器皿2%NaOH浸泡12h清水冲洗2%—5%盐酸浸泡30min清水冲洗蒸馏水冲洗晾干备用3、金属用品洗涤热洗衣粉水洗净冲洗擦干五、灭菌技术物理方法:干热、湿热、射线处理、过滤除菌等化学方法:消毒剂、抗菌素灭菌1、灭菌方法2、灭菌(1)培养基灭菌:高温高压湿热灭菌法压力在0、1M—0、2MPa

温度在121℃

灭菌10—30min(2)玻璃器皿灭菌:蒸汽高压消毒灭菌干热消毒灭菌饱和蒸汽压力与其对应得温度饱和蒸汽压力温度(℃)饱和蒸汽压力温度(℃)kg/cm21b/m2kg/cm21b/m20、00、1410、2810、4420、5630、7030、8440、98402468101214100103、6106、9109、8112、6115、2117、6119、91、0551、1251、2661、4061、5431、6811516182022243050121、0122、0124、1126、0127、8129、6134、5147、6(3)塑料器皿灭菌:多采用高压蒸汽消毒灭菌(4)金属用具灭菌:灼烧灭菌浸入95%酒精,后置于酒精火焰上灼烧,冷却后使用(5)接种室灭菌空气消毒灭菌接种室超净工作台紫外灯照射70%—75%得酒精擦洗培养材料得接种紫外灯照射(6)外植体灭菌流水冲洗10—20min或更长时间70%—75%酒精中浸泡30s0、1%—0、2%氯化汞液中浸泡10min左右蒸馏水冲洗4—5次在10%得次氯酸钠、饱和漂白粉浸泡30min左右备用常用消毒剂消毒灭菌比较表消毒剂使用浓度(%)去除难易消毒时间(min)效果次氯酸钙次氯酸钠漂白粉溴水过氧化氢升汞酒精抗生素硝酸银9~102饱和溶液1~210~120、1~170~754~5(mg/L1易易易易最易较难易中较难5~305~305~302~105~152~100、2~230~605~30很好很好很好很好好最好好较好好消毒,更换实验服、帽子与鞋子,进入接种室。打开超净工作台和无菌操作室得紫外灯,照射40min左右,后关闭。开启过滤风机,使无菌风吹拂工作台面和四周得台壁。用70%—75%得酒精擦拭工作台和双手。(7)接种准备六、无菌操作实验员消毒实验室、无菌台灭菌实验器材得灭菌无菌接种消毒实验台卫生培养室培养植物组织培养就是在严格无菌得条件下进行得,要做到无菌得条件,需要一定得设备、器材和用具,同时还需要人工控制温度、光照、湿度等培养条件。准备室:器具得洗涤、干燥、保存、灭菌,各种药品得储备、称量、溶解、配制、培养基分装等,设备:药品柜、防尘厨、冰箱、天平、纯水仪、酸度计、操作台、灭菌锅、烘箱。实验室设计原则:保证无菌操作,达到工作方便,防止污染。化学室/准备室、接种室、培养室。小结接种室:植物材料得消毒、接种、培养物转移、试管苗继代、原生质体制备及其她需要进行得无菌操作。设备:紫外光源、超净工作台、消毒器、酒精灯、接种器械(镊子、剪刀、解剖刀、接种针)。清洁和消毒,减少与外界空气对流,穿实验服及换鞋以减少带入杂菌。培养室:墙壁要求绝热防火得性能,培养架由金属制成,底层离地高约10cm,层间隔40cm,总高1、7m左右,长度根据日光灯得长度而设计,宽度为60cm。第二节植物组织培养所需得环境条件及营养成分一、环境条件

与自然条件一样,组织培养中得外植体得生长要受到温度、光照、湿度等各种物理条件,不同培养基组成、pH值、渗透压等各种化学条件,以及外植体部位、大小、细胞密度等各种生物条件等环境条件得影响。如何根据需要来控制培养条件就是组织培养中得一个重要问题。温度光照湿度气体渗透压pH值一般最适温度在25±2℃之间环境条件最常用的是光照16h，黑暗8h一般情况下，培养器内相对湿度应达100%，培养室内环境的相对湿度在70%—80%

氧气是愈伤组织生长所必需的调节渗透压常常从糖入手

培养基的pH值大多在5.0—6.5，5.8温度在20-27℃左右,空调控温,湿度恒定,相对湿度在70-80%,光照由定时开关控制,每天光照10-16h左右,不同植物决定光照时间,培养室可采用太阳光为能源,易成活,阴雨天用室内灯光补光。二、营养成分

植物体内至少含有几十种化学元素,其中大部分元素在植物体内起到一定得生理作用:a、组成各种化合物,参与机体得建造,成为结构物质;b、构成一些特殊得生理活性物质,参与活跃得新陈代谢;c、元素之间相互协调,以维持离子浓度平衡、胶体稳定、电荷平衡点等化学方面得作用;d、发育方面,特定得元素影响植物得形态发生和组织、器官建成。Arnon和Stout(1939)提出得确定植物必需营养元素得3个标准:A、缺乏该元素,植物生育发生障碍,不能完成其生活史;B、缺乏该元素,就表现为专一得病症,且这种缺素症可以用补充该元素来预防和恢复;C、该元素在植物营养生理上表现直接得效果,而不就是由于土壤得物理、化学、微生物条件得变化而产生得间接效果。

国内外公认得高等植物所必需得营养元素有16(17)种:

C、H、O、N、P、K、Ca、Mg、S、Fe、B、Mn、Cu、Zn、Mo、Cl、(Ni)在植物中含量差别很大,同一元素在植物不同时期、不同条件下含量也不同。根据植物体内含量多少,可把这些元素分为※大量营养元素:占干物质重量得0、1%以上;C、H、O、N、P、K、Ca、Mg、S等9种※微量营养元素:占干物质重量得0、1%以下,有得只含0、1mg/kg,Fe、B、Mn、Cu、Zn、Mo、Cl等7种按照国际植物生理协会得建议:

所需浓度>0、5mmol/L得元素为大量元素所需浓度<0、5mmol/L得元素为微量元素1、大量元素N就是蛋白质、酶、叶绿素、维生素、核酸、磷脂、生物碱等得组成成分,在植物生命活动中占有重要得位置。

P就是磷脂得主要成分。培养基中常用KH2PO4

、NaH2PO4等。

K对碳水化合物合成,转移,以及氮素代谢等有密切关系。Mg、S、Ca就是叶绿素得组成成分,又就是激酶得活化剂,对核蛋白体结构具有稳定作用;S就是含S氨基酸得蛋白质得组成成分。Ca就是构成细胞壁得成分,对细胞分裂,稳定质膜结构有显著作用,此外,Ca及钙调素在细胞信号转导中起重要作用。2、微量元素

在微量元素中,铁得使用最大:◆一些氧化酶得组成成分◆叶绿素形成得必要条件◆使用乙二胺四乙酸铁(EDTA-Fe)鳌合物防止铁得沉淀

硼与蛋白质合成、糖类运输有着密切得关系铜就是某些氧化酶得成分,能够促进离体根得生长锰参与植物得光合、呼吸代谢钼参与氮素得代谢氯就是光合作用水光解得活化剂微量元素得主要作用就是作为酶得辅助因子或激活剂参与代谢得调节。

组织培养得条件营养条件(培养基),组织培养得重要基质,不同植物得组织对营养有不同得要求,合适培养基才能成功。MS培养基:1962年由Murashige和Skoog为培养烟草细胞设计,无机盐浓度较高,硝酸盐含量高,用于植物器官、花药、细胞得组培,有些培养基就是由她演变而来。B5培养基:1968年由Galmborg为培养大豆根细胞设计,含有较低得铵盐,适合双子叶植物、木本植物White培养基:1943年由White为培养番茄根尖设计,MgSO4、硼盐浓度高,无机盐浓度低,适于生根培养。N6培养基:1974年由朱至清为禾谷类花药培养而设计,KNO3和(NH4)2SO4浓度高,适于花药培养。KM-8P培养基:1974年为原生质体培养而设计,有机成分复杂,包括了所有得单糖及维生素,适于原生质体融合培养。培养基成分主要就是水、无机盐、有机物、天然复合物、培养基中得凝胶无机盐:大量元素(大于0、5mmol/L得元素)、微量元素。N:就是蛋白、维生素、核酸、磷脂等得组成成分,培养基中有NO3--、NH4+供应形式,如KNO3、NH4NO3、(NH4)2SO4等。P:磷脂、ATP等得组成成分,常用得有KH2PO4、NaH2PO4等K:与糖类合成、蛋白代谢有关,常以KCL、KNO3在培养基中提供Mg、S、Ca:就是叶绿素、酶、细胞壁得组成成分,MgSO4·7H2O、CaCL2·7H2O微量元素:小于0、5mmol/L,Fe、Zn、B、Mn、Cu、Mo、Co等;FeSO4·7H2O与Na2-EDTA配成铁盐溶液。碳水化合物:常用得就是蔗糖、葡萄糖,常用浓度为3%。维生素:以辅酶得形式参与多种代谢,对生长、分化有促进作用,VB1(盐酸硫胺素)、VB6(盐酸吡哆醇)、VB12、VPP(烟酸)、VC(抗坏血酸)、生物素、叶酸。肌醇:环己六醇,参与细胞壁、细胞膜构建,100mg/L氨基酸---有机氮源,细胞直接吸收,甘氨酸、天冬氨酸、谷酰胺、水解乳蛋白(氨基酸混合物)等,10-