结核病实验室检查的临床意义

结核分枝杆菌试验

室检测方法

结核病实验室检查的临床意义第1页主要内容一、结核杆菌病原学基础

二、结合分支杆菌全球流行情况三、结核杆菌试验室检测方法及临床应用结核病实验室检查的临床意义第2页一、结核病病原学基础结核杆菌属:一类细长略带弯曲，有时呈分枝状杆菌，本属细菌多含有抗酸性，又称抗酸杆菌（acid-fastbacillus），细菌体内含有分枝菌酸，细胞壁含有大量脂类，这与分枝杆菌染色性、抵抗力和致病性等亲密相关。本属细菌已经被判定有70各种，可分为三大类:结核分枝杆菌、非经典分枝杆菌、麻风分枝杆菌；按生长速度可分为三类，即迟缓生长菌、快速生长菌和不能培养菌三种类型结核病实验室检查的临床意义第3页结核分枝杆菌群结核分枝杆菌,是人和动物结核病病原体,包含人结核分枝杆菌（Mycobacteriumtuberculosis）、牛分支杆菌（M.bovis）、非洲分支杆菌（M.africanum）和田鼠分枝杆菌（M.microti）,前三种对人类治病,其中人型结核分枝杆菌感染发病率最高。结核分枝杆菌属于迟缓生长分支杆菌结核病实验室检查的临床意义第4页结核病实验室检查的临床意义第5页及时准确诊疗结核病,有效地控制传染源,对预防结核病至关主要。结核病实验室检查的临床意义第6页结核病试验室检查细菌学检验免疫学检验分子生物学检验涂片染色镜检分枝杆菌分离培养分支杆菌药敏试验分枝杆菌菌种判定结核病实验室检查的临床意义第7页最原始最基础检测方法涂片染色镜检结核病实验室检查的临床意义第8页抗酸染色原理分枝杆菌细胞壁内含有大量脂质。包围在肽聚糖外面,所以分支杆菌普通不易着色,需要经过加热或是延长染色时间来促使其着色。但分支杆菌中分支菌酸与染料结合后,就极难被酸性脱色剂脱色,故名抗酸染色。结核病实验室检查的临床意义第9页涂片染色镜检临床价值

适合用于各种标本；操作简便,价格低廉。结核病实验室检查的临床意义第10页涂片镜检临床应用

一、确诊涂阳结核病及开放性结核2份痰标本直接涂片抗酸杆菌镜检阳性；1份痰标本直接涂片抗酸杆菌镜检阳性+影像学检验符合活动性肺结核表现。结核病实验室检查的临床意义第11页涂片镜检临床应用二、肺结核治疗评定主要依据之一治愈:涂阳肺结核患者完成要求疗程，连续2次涂片结果阴性，其中1次是治疗末涂片。治疗失败:新涂阳患者治疗第5个月末或疗程结束时，痰涂片检验阳性，涂阴肺结核患者治疗过程中任何1次痰菌检验阳性，均为治疗失败。结核病实验室检查的临床意义第12页缺点:不能区分结核分枝杆菌和非结核分支杆菌不能区分死菌跟活菌。结核杆菌暴露于异烟肼时,一些条件会失去抗酸性,出现假阴性。检测灵敏度较低（104-105个细菌/毫升）。结核病实验室检查的临床意义第13页分枝杆菌分离培养结核菌培养仍是当前诊疗结核病金标准.尤其是药敏试验结果在指导临床用药及耐药性检测等方面含有主要作用,是判定是否为活菌可靠方法.传统固态培养法需要4～6周才能检测到结核菌生长.而且阳性率也只有30％-40％；特异性差.各种分枝杆菌均可生长。要确定是否为结核菌.需结合分枝杆菌菌种判定和药品敏感性试验。快速培养法:检测细菌生长过程中代谢产生CO2或消耗O2，显微镜直接观察、变色液体培养基等。快速培养法阳性汇报时间大约是1—3周左右，比传统固态培养法快，不过仪器价格太昂贵。结核病实验室检查的临床意义第14页确诊结核病1份痰标本直接涂片抗酸杆菌镜检阳性+1份痰标本结核分枝杆菌培养阳性即可确诊。痰涂片阴性,肺部影像学检验符合活动性肺结核影像学表现+1份痰标本结核分枝杆菌培养阳性结核菌培养临床价值结核病实验室检查的临床意义第15页用于耐多药结核疗效判定治愈:（1）患者完成疗程，且在疗程后12个月，最少最终5次痰培养（每次间隔最少30天）连续阴性。（2）如出现1次痰培养阳性，其后痰培养（间隔最少30天）最少连续3次阴性。失败:治疗最终12个月，5次痰培养中有两次或两次以上阳性；或者在最终3次，培养中有任何一次是阳性。结核病实验室检查的临床意义第16页分离培养优点敏感性较直接涂片法高,理论上10-100条菌/毫升可检出阳性；特异性较直接涂片法高,能够从菌落生长速度、色素产生初步判断非结核分枝杆菌；分离出含有活力纯培养物,为深入药敏试验提供基础。结核病实验室检查的临床意义第17页分离培养缺点需时长,依据接种量大小,普通2-8周才能得到肉眼可见菌落。结果受标本保留运输时间、培养基成份和质量、前处理方法等影响,操作较直接涂片法复杂,需经严格培训,对试验室要求也是较高。成本是直接涂片法7-8倍。结核病实验室检查的临床意义第18页结核病试验室检查细菌学检验免疫学检验分子生物学检验涂片染色镜检分枝杆菌分离培养分支杆菌药敏试验分枝杆菌菌种判定体液免疫学检验细胞免疫学检验结核病实验室检查的临床意义第19页体液免疫学检验（血清学检验）结核抗体测定结核抗原测定循环免疫复合物测定

结核病实验室检查的临床意义第20页血清学诊疗血清学诊疗技术优势:是一个对疾病进行早期诊疗理想方法。无需活细胞培养和特殊仪器设备操作简便结果显示快速当前用于血清学诊疗主要方法:酶联免疫吸附试验(ELlSA)斑点金免疫渗滤法(DIGFA)免疫印迹法(WesternBlotting)等等结核病实验室检查的临床意义第21页年WHO正式公告:因为当前商业血清学试剂在结核检测中存在较大差异，且检测结果很高百分比假阳性和假阴性，所以不提议使用血清学方法作为结核杆菌诊疗试验1。1WHOCommercialSerodiagnosticTestsforDiagnosisofTuberculosis./publications//9789241502054_eng.pdf血清学检测评价原因:因为所用测定方法、使用试剂种类或抗原、抗体不一样等，造成测定结果差异较大，而且缺乏可比性。WHO对来自不一样国家19种试剂盒产品进行评定，结果表明:与痰培养相比，这些试剂盒检测灵敏度为1%~60%，特异度为53~99%1。结核病实验室检查的临床意义第22页结核病细胞免疫学检验结核菌素皮肤试验蛋白水平分子诊疗:γ-干扰素释放试验（IGRA)结核病实验室检查的临床意义第23页迟发型细胞超敏反应1）方法:1:OT或PPD液0.1毫升(5单位)，左前臂屈侧中部皮内注射，48～72h测量皮肤硬结直径。结核菌素试验（PPD试验）结核病实验室检查的临床意义第24页2）判断标准:阴性≤4mm弱阳性5-9mm阳性10-19mm，强阳性≥20mm或局部出现水泡与坏死结核病实验室检查的临床意义第25页3)结核菌素试验意义阴性:无结核菌感染；不能排除结核感染。阳性:曾有结核感染，并不一定现在患病。强阳性:活动性结核病可能

A、变态反应还未建立；

B.免疫抑制如应用皮质激素或营养不良等

结核病实验室检查的临床意义第26页PPD所含抗原为致病性分枝杆菌、环境分枝杆菌及卡介苗菌株所共有,其结果受到卡介苗接种及其它分枝杆菌感染影响,特异性较差。当出现免疫功效低下时可出现假阴性结果,敏感性低。免疫力正常阴性有一定意义。强阳性有一定意义。有结核变态反应、淋巴结核强阳性多。经济、简便,能够用于流行病学大规模筛查和普查,但存在着显著缺点。PPD试验临床价值结核病实验室检查的临床意义第27页结核感染者体内存在特异效应T淋巴细胞，效应T淋巴细胞再次受到结核抗原刺激时会分泌各种细胞因子（IFN-γ）。所以，检测效应T淋巴细胞可用于结核病或结核潜伏感染者诊疗。因为效应T细胞存活时间很短，而且含有特异性，所以能够作为机体是否正处于被感染指标，不论是否有临床症状。基于IGRA原理产品当前已被美国、加拿大、英国、德国、意大利、瑞士、法国、荷兰、日本等二十余个国家写入本国结核诊疗指南中。当前应用进口IGRA主要有两种商品化试剂:1）澳大利亚Cellestis企业QuantiFERON-TBGOLDInTube（QFT-GIT）2）英国OxfordImmunotec企业T-SPOT.TB蛋白水平分子诊疗:γ-干扰素释放试验（IGRA)结核病实验室检查的临床意义第28页T-SPOT®.TB原理T-SPOT®.TB是以拥有专利特异抗原（ESAT-6/CFP-10），经过酶联免疫斑点技术（ELISPOT）检测受试者体内是否存在结核效应T淋巴细胞，从而判断当前该受试者是否感染结核杆菌（现症感染）新方法。结核杆菌特异抗原:早期分泌抗原靶6（EarlySecretedAntigenicRarget6，ESAT-6）培养滤液蛋白10（CultureFiltrateProtein10，CFP10）结核病实验室检查的临床意义第29页T-SPOT®.TB临床性能指标特异性只针对结核分枝杆菌复合群敏感，与绝大多数环境分枝杆菌和卡介苗（BCG）无交叉反应美国FDA数据:特异性97.1%(297/306)国内临床数据:特异性94.1%(478/508)灵敏度基本不受免疫力低下/受抑制影响，在肺外结核患者中有很高检出率美国FDA数据:灵敏度95.6%(175/183)国内临床数据:灵敏度95.3%(624/655)结核病实验室检查的临床意义第30页试验结果解释阴性结果提醒患者体内不存在针对结核杆菌特异效应T细胞。假阴性结果:①感染阶段不一样；②少数免疫系统功效不全患者阳性结果提醒患者体内存在针对结核杆菌特异效应T细胞，患者存在结核感染。不过否是活动性结核病，需结合临床症状和其它检测指标综合判断。假阳性结果:①4种环境分枝杆菌感染时:M.kansasii（堪萨斯）、M.szulgai（苏氏）、M.marinum（海）、M.gordonae（戈登）结核病实验室检查的临床意义第31页方法学优点检测特异性提升帮助临床区分卡介苗接种和环境分枝杆菌感染引发“假阳性”,防止了临床无效用药检测灵敏度提升有利于临床对结核病早发觉、早治疗,防止了疾病传输与扩散快速48小时出结果结核病实验室检查的临床意义第32页方法学局限不能区分活动性TB与潜伏感染不能够提醒临床患者病变部位,需要结合临床判断当前还不能够依据斑点数量多少来判断患者是活动性结核病或是潜伏感染者不适适用于结核病患者治疗疗效监测检测收费高（600-700元/次）结核病实验室检查的临床意义第33页体外r-干扰素释放试验

活动性结核病经过有效抗结核治疗后,结核杆菌载量下降,效应T细胞数量会随之降低,所以理论上IGRA结果应从阳性转变为阴性,但临床实践中发觉IGRA结果转阴率非常低。年发表一篇meta分析中指出,T-SPOT.TB在结核病患者抗结核治疗后转阴率为5.71%-13.93%,说明IGRA在评价抗结核治疗方面作用是有限。

ChiappiniE,FossiF,BonsignoriF,etal.Utilityofinterferon-γreleaseassayresultstomonitoranti-tuberculartreatmentinadultsandchildren.ClinTher,,34:1041-1048.IGRA在评价抗结核治疗中作用是有限结核病实验室检查的临床意义第34页结核病试验室检查细菌学检验免疫学检验分子生物学检验涂片染色镜检分枝杆菌分离培养分支杆菌药敏试验分枝杆菌菌种判定体液免疫学诊疗细胞免疫学诊疗聚合酶链反应（PCR）DNA测序DNA探针技术基因芯片技术结核病实验室检查的临床意义第35页分子生物学检测方法近年来核酸扩增技术和杂交分析技术发展,为分枝杆菌检测、判定和药敏试验提供了极大方便,可将诊疗时间从几周降低到几天甚至是几个小时。研究、应用报道较多结核病基因诊疗技术主要包含聚合酶链反应(PCR)、核酸探针杂交、DNA序列测定、基因芯片、基因分型等。结核病实验室检查的临床意义第36页实时荧光PCR技术本试验室所使用结核分枝杆菌核酸检测试剂盒（荧光PCR法）采取单管单人份分装技术,操作过程非常简便；并引入荧光检测技术,简化了检测步骤,而且整个扩增及扩增后检测都无需打开扩增管盖,从根本上克服了PCR遗留污染。荧光探针PCR检测技术综合了PCR扩增高敏感性、探针杂交高特异性及荧光能量转移实时跟踪特征,使检测准确性大大提升,并可充分确保检测稳定性及重复性。结核病实验室检查的临床意义第37页结核杆菌PCR检测临床意义1.在痰菌阴性结核快速诊疗有主要临床应用价值。在临床工作中,痰菌阴性,经临床综合分析后诊疗为肺结核患者,约占肺结核患者60%-70%。有报道指出痰菌阴性肺结核患者,假如未经抗结核治疗,经过1-3年随访,将有40%-60%患者发展为菌阳甚至更经典肺结核。所以取得病原学诊疗至关主要结核病实验室检查的临床意义第38页结核杆菌PCR检测临床意义年发表在中国防痨杂志中一篇文章研究指出在476例菌阴肺结核病患者中,PCR法检出116例阳性,检测灵敏度为24.4%而菌阳肺结核患者检测灵敏度为97.0%结核病实验室检查的临床意义第39页结核杆菌PCR检测临床意义2.PCR法能够作为临床痰涂片和痰培养补充，为临床诊疗和治疗提供帮助涂片阳性并不能区分是结核分枝杆菌还是非结核分枝杆菌，这二者治疗是有很大差异，NTM对于惯用抗结核药经常都是无效，所以对于涂片阳性标本，很有必要在在做MTB-DNA检测，深入确认是否是真MTB感染。结核病实验室检查的临床意义第40页结核杆菌PCR检测临床意义3.可作为结核性关节炎和泌尿系统结核早期诊疗一个可靠指标。118例疑似结核病患者,其中关节炎患者52例,泌尿系感染患者66例,应用FQ-PCR技术分别检测患者关节腔积液和尿液中TB-DNA,并与抗酸染色法检出率比较。结果52例关节炎患者中,确诊结核性关节炎患者36例,TB-DNA阳性22例,22例全部为确诊病例,阳性率61.1%。抗酸染色阳性只有2例,阳性率5.6%;66例泌尿系统疾病患者中,确诊泌尿系结核患者52例,TB-DNA阳性32例,32例全部为确诊病例,阳性率为61.5%,抗酸染色阳性只有4例,阳性率7.7%。结论应用FQ-PCR技术检测患者关节腔积液和尿液中TB-DNA,含有高度敏感性和特异性,可作为结核性关节炎和泌尿系统结核早期诊疗一个可靠指标。《年发表在中国防痨》杂志结核病实验室检查的临床意义第41页结核杆菌PCR检测临床意义4.PCR用于临床疗效观察比涂片、培养实用，对预计有可能复发病例有一定帮助有些耐药菌或患者经化疗后痰排菌可能转化为Ｌ型结核分枝杆菌，抗酸染色不能有效检测，而ＰＣＲ检测细菌ＤＮＡ，不受其表型改变影响，所以ＰＣＲ较抗酸染色法对Ｍｔｂ有更强检出能力，能更有效地发觉传染源、降低漏诊率，是早期诊疗肺结核比很好指标。L型结核分支杆菌是形成慢性传染源主要原因,也是结核病恶化、复发细菌学根源。所以对年老体弱、合并有其它机体疾病、痰中含菌量多、肺部结核病变广泛、有空洞存在、化疗期满、微生物学检验(涂片加培养)阴转但PCR仍连续阳性患者,应采取继续亲密观察,或同时考虑更改治疗方案或延长治疗时间及随访时间等做法。结核病实验室检查的临床意义第42页结核病实验室检查的临床意义第43页美国CDC提议:在同时取得核酸检测和涂片结果后，

依据其结果不一样可分为4种情况1.对于核酸检测和抗酸杆菌涂片结果均为阳性患者,需高度怀疑结核病,