高三一轮复习生物：基因工程的基本工具和基本操作程序课件

第44讲基因工程的基本工具和基本操作程序[课标要求]1.概述基因工程是在遗传学、微生物学、生物化学和分子生物学等学科基础上发展而来的。2.阐明DNA重组技术的实现需要利用限制性内切核酸酶、DNA连接酶和载体三种基本工具。3.阐明基因工程的基本操作程序主要包括目的基因的获取、基因表达载体的构建、目的基因导入受体细胞和目的基因及其表达产物的检测鉴定等步骤。4.活动:DNA的提取和鉴定。5.活动:利用聚合酶链式反应(PCR)扩增DNA片段并完成电泳鉴定,或运用软件进行虚拟PCR实验。1.基因工程的概念解读考点一重组DNA技术的基本工具目的基因基因重组分子2.基因工程的基本工具(1)限制性内切核酸酶(也称“限制酶”)。原核生物特定核苷酸序列黏性末端(2)DNA连接酶。磷酸二酯键黏性末端黏性末端(3)载体。质粒噬菌体有一个至多个自我复制受体DNA标记[正误辨析]1.切割质粒的限制性内切核酸酶均能特异性地识别6个核苷酸序列。(

)提示:大多数限制酶的识别序列由6个核苷酸组成,也有少数限制酶的识别序列由4个、8个或其他数量的核苷酸组成。2.限制性内切核酸酶、DNA连接酶和质粒是基因工程中常用的三种工具酶。(

)提示:质粒不是工具酶,是工具。××3.E.coliDNA连接酶既可连接平末端,又可连接黏性末端。(

)提示:E.coliDNA连接酶只能连接黏性末端,而T4DNA连接酶能连接平末端和黏性末端。4.DNA聚合酶和DNA连接酶都能催化磷酸二酯键的形成。(

)5.载体质粒通常采用抗生素合成基因作为筛选的标记基因。(

)提示:质粒上常有抗生素抗性基因等特殊的基因作为标记基因,而非抗生素合成基因。×√×[教材微点思考]1.(选择性必修3P71正文拓展)限制酶主要来源于原核生物,为什么不能切割自身的DNA分子?提示:限制酶具有特异性,即一种限制酶只能识别一种特定的核苷酸序列,并在特定位点进行切割。原核生物DNA分子中不存在自身限制酶的识别序列,或其识别序列已被修饰。2.(选择性必修3P72正文拓展)DNA连接酶和DNA聚合酶功能上有何不同?提示:DNA连接酶连接的是两个DNA片段,而DNA聚合酶是把单个的脱氧核苷酸连接到已有的DNA片段上;DNA聚合酶起作用时需要以一条DNA链为模板,而DNA连接酶不需要模板。1.与DNA有关的酶的比较酶种类作用底物作用部位作用结果限制酶DNA分子磷酸二酯键将DNA切成一个或多个片段DNA连接酶DNA分子片段磷酸二酯键将两个DNA片段连接为一个DNA分子DNA聚合酶脱氧核苷酸磷酸二酯键以DNA单链为模板,将单个脱氧核苷酸依次连接到另一条短的单链末端解旋酶DNA分子碱基对中的氢键将双链DNA分子局部解旋为单链,形成两条长链DNA水解酶DNA分子磷酸二酯键将DNA片段水解为单个脱氧核苷酸2.标记基因的作用标记基因可用于检测目的基因是否导入受体细胞。3.限制酶的选择构建基因表达载体时,需要选择合适的限制酶切割含有目的基因的DNA片段和载体。已知限制性内切核酸酶Ⅰ的识别序列和切点是,限制性内切核酸酶Ⅱ的识别序列和切点是,根据图示分析回答下列问题。(1)请用图示法写出限制性内切核酸酶Ⅰ和限制性内切核酸酶Ⅱ切割后形成黏性末端的过程。提示:限制性内切核酸酶Ⅰ限制性内切核酸酶Ⅱ(2)切割图示中的目的基因和质粒应选用哪类限制酶?请说明理由。提示:用限制酶Ⅱ切割目的基因,用限制酶Ⅰ切割质粒。限制酶Ⅰ的识别序列包含限制酶Ⅱ的识别序列,因此限制酶Ⅱ也可切割限制酶Ⅰ的位点,故使用限制酶Ⅱ时,可在目的基因两端同时切割,从而切出“目的基因”,但若使用限制酶Ⅱ切割质粒,会同时破坏质粒中的两个“标记基因”,故只能使用限制酶Ⅰ切割质粒。(1)不破坏目的基因原则:如图甲中可选择PstⅠ,而不选择SmaⅠ。(2)保留标记基因(至少保留一个)、启动子、终止子、复制原点原则:所选择的限制酶尽量不要破坏这些结构,如图乙中不选择SmaⅠ。(3)确保出现相同黏性末端原则:通常选择与切割目的基因相同的限制酶切割质粒,如图中PstⅠ;为避免目的基因和质粒自身环化和随意连接,也可使用不同的限制酶切割目的基因和质粒,如图也可选择PstⅠ和EcoRⅠ两种限制酶。1.(2023·山西沂州期中)如图表示由不同的限制酶切割而成的DNA末端及相关的酶作用位点。下列叙述错误的是(

)A.甲、乙、丙都属于黏性末端B.甲、乙片段可形成重组DNA分子,但甲、丙不能C.DNA连接酶的作用位点在图乙中b处D.切割甲的限制酶不能识别由甲、乙片段形成的重组DNA分子√基因工程中工具酶的应用甲、乙的黏性末端相同,因此可在DNA连接酶的作用下形成重组DNA分子,但甲、丙的黏性末端不同,它们之间不能形成重组DNA分子;DNA连接酶将两个DNA片段连接为一个DNA分子,作用部位是磷酸二酯键,即图乙中a处;切割甲的限制酶的识别序列为GAATTC∥CTTAAG,而甲、乙片段形成的重组DNA分子序列为GAATTG∥CTTAAC,因此切割甲的限制酶不能识别由甲、乙片段形成的重组DNA分子。解析2.(2023·江苏盐城调研)图甲、乙中的箭头表示三种限制性内切核酸酶的酶切位点,AmpR表示氨苄青霉素抗性基因,neoR表示新霉素抗性基因。下列叙述错误的是(

)A.在构建重组质粒时,可用PstⅠ和HindⅢ切割质粒和外源DNAB.在酶切过程中,不能破坏质粒中全部的标记基因C.若只用PstⅠ处理质粒和外源DNA分子片段,无法避免自身环化和反向连接D.导入重组质粒的大肠杆菌可以在含氨苄青霉素的培养基中生长√切割目的基因时,用BamHⅠ切割会破坏目的基因,只用PstⅠ切割目的基因和质粒载体,会出现目的基因和质粒的自身环化,或目的基因和质粒的反向连接,而用PstⅠ和HindⅢ进行酶切,能确保目的基因和质粒的正向连接,并且质粒上保留新霉素抗性基因作为标记基因;在酶切过程中,不能破坏质粒中全部的标记基因,至少需保留其中的一个;用PstⅠ切割后,质粒上氨苄青霉素抗性基因被破坏了,导入重组质粒的大肠杆菌不可以在含氨苄青霉素的培养基中生长。解析3.(2023·辽宁凌源期中)将外源基因送入细胞通常是利用质粒作为载体。下列有关质粒的叙述,正确的是(

)A.质粒上常有特殊的标记基因,以便于重组DNA分子的筛选B.质粒从细胞中提取出来后即可以直接使用,无须人工改造C.质粒是具有自我复制能力的DNA分子,只存在于原核生物中D.质粒一般只有一个限制酶切割位点,以便于目的基因插入√载体的作用和特点质粒一般需要经过人工改造才可以使用;质粒存在于真核细胞和原核细胞中;质粒一般具有一个至多个限制酶切割位点,以供目的基因插入其中。解析1.目的基因的筛选与获取(1)筛选合适的目的基因。①目的基因:在基因工程的设计和操作中,用于改变

或获得

等的基因。主要是指

的基因。②筛选方法:从相关的已知结构和功能清晰的基因中进行筛选是较为有效的方法之一。考点二基因工程的基本操作程序受体细胞性状预期表达产物编码蛋白质引物(2)利用PCR获取和扩增目的基因。脱氧核苷酸耐高温温度两种引物耐高温的DNA聚合酶琼脂糖凝胶电泳(1)在PCR过程中实际加入的为dNTP(即dATP、dGTP、dTTP、dCTP),既可作为合成DNA子链的原料,又可为DNA的合成提供能量。(2)引物是一小段单链的DNA或RNA,作为新子链的合成起点,只能结合在母链的3′端,使DNA聚合酶能从引物的3′端开始连接脱氧核苷酸。(3)真核细胞和细菌的DNA聚合酶都需要Mg2+激活。因此,PCR反应缓冲溶液中一般都要添加Mg2+。2.基因表达载体的构建(1)构建基因表达载体的目的。①使目的基因在受体细胞中稳定存在,并且遗传给下一代。②使目的基因能够

和发挥作用。表达(2)基因表达载体的组成。RNA聚合酶转录启动子、起始密码子、终止子、终止密码子的区别(3)基因表达载体的构建过程。生物种类植物动物微生物常用方法农杆菌转化法、

显微注射法

处理法受体细胞

原核细胞转化过程将目的基因插入Ti质粒的T-DNA中→农杆菌→导入植物细胞→整合到受体细胞的染色体DNA上→表达将含有目的基因的表达载体提纯→取卵(受精卵)→显微注射→受精卵发育→获得具有新性状的动物Ca2+处理细胞→细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态→基因表达载体导入3.将目的基因导入受体细胞花粉管通道法体细胞或受精卵Ca2+受精卵(1)农杆菌特点。①能在自然条件下侵染双子叶植物和裸子植物,而对大多数单子叶植物没有侵染能力。②农杆菌细胞内含有Ti质粒,当它侵染植物细胞后,能将Ti质粒上的T-DNA转移到被侵染的细胞,并且将其整合到该细胞的染色体DNA上。(2)农杆菌转化法中的两次拼接和两次导入:第一次拼接是将目的基因拼接到Ti质粒的T-DNA上,第二次拼接(非人工操作)是指插入目的基因的T-DNA拼接到受体细胞的染色体DNA上;两次导入:第一次导入是将含目的基因的Ti质粒导入农杆菌,第二次导入(非人工操作)是指含目的基因的T-DNA导入受体细胞。(3)导入的目的基因,可能存在于细胞质中,也可能整合到染色体DNA上。存在于染色体DNA上的目的基因有可能通过花粉传播进入杂草或其他作物中,造成“基因污染”。4.目的基因的检测与鉴定[正误辨析]1.用PCR技术扩增目的基因时不必知道基因的全部序列。(

)2.利用PCR扩增目的基因时,要用2种不同但能够互补配对的引物。(

)提示:PCR扩增目的基因时,2种不同的引物不能互补配对。3.外源DNA必须位于重组质粒的启动子和终止子之间才能进行复制。(

)提示:启动子和终止子与外源DNA表达有关,控制转录过程;要进行复制,需要的是复制原点。√××[教材微点思考]1.(选择性必修3P77正文拓展)PCR技术为什么需要引物?为检测胚乳细胞中Wx基因是否表达,科研人员提取胚乳中的总RNA,经逆转录过程获得总cDNA,通过PCR技术可在总cDNA中专一性地扩增出Wx基因的cDNA,原因是什么?提示:DNA聚合酶不能从头开始合成DNA,只能从3′端延伸DNA链。引物是依据Wx基因的一段已知序列设计合成的(或引物能与Wx基因的cDNA特异性结合)。2.(选择性必修3P81“资料卡”拓展)在用农杆菌转化法将目的基因导入植物细胞的过程中,为什么一定要将目的基因插入Ti质粒的T-DNA上?提示:Ti质粒的T-DNA也称为可转移的DNA,可转移至受体细胞,并且整合到受体细胞染色体DNA上。1.PCR技术和DNA复制的比较2.PCR扩增过程中的循环图示与规律循环次数123nDNA分子数2482n含引物A(或B)的DNA分子数1372n-1同时含引物A、B的DNA分子数0=21-22=22-26=23-22n-2共消耗的引物数量2=21+1-26=22+1-214=23+1-22n+1-21.农杆菌Ti质粒上的T-DNA可以转移并随机插入被侵染植物的染色体DNA中。研究者将图中被侵染植物的DNA片段连接成环,并以此环为模板进行PCR,扩增出T-DNA插入位置两侧的未知序列,以此可确定T-DNA插入的具体位置。下列说法错误的是(

)A.PCR扩增依据的是DNA分子双链复制的原理B.进行PCR扩增需要耐高温的DNA聚合酶C.利用图中的引物②③组合可扩增出两侧的未知序列D.通过与受体细胞的基因组序列比对,可确定T-DNA的插入位置√利用PCR获取和扩增目的基因由于DNA的两条链反向平行,且子链从引物的3′端开始延伸,故利用图中的引物①④组合可扩增出两侧的未知序列。解析2.(2023·黑龙江大庆月考)通过引物设计,运用PCR技术可以实现目的基因的定点诱变,如图为基因工程中获取突变基因的过程,其中引物1序列中含有一个碱基T不能与目的基因片段配对,但不影响引物与模板链的整体配对,反应体系中引物1和引物2分别设计增加限制酶a和限制酶b的识别位点。下列有关叙述正确的是(

)A.限制酶a和限制酶b的识别位点分别加在引物1和引物2的3′端B.PCR反应体系中需要加入脱氧核苷酸、模板、Ca2+等C.第2轮PCR中,引物1与图中②结合并形成两条链等长的突变基因D.在第3轮PCR结束后,同时含引物1和引物2的DNA占3/4√DNA的合成方向是从子链的5′端向3′端延伸,据此可知,图中限制酶a和限制酶b的识别位点分别加在引物1和引物2的5′端;PCR反应体系中需要加入模板、脱氧核苷酸、耐高温的DNA聚合酶和扩增缓冲液(含Mg2+)等物质;第3轮PCR中,引物1与图中②结合并形成两条链等长的突变基因;在第3轮PCR结束后,会产生23=8(个)DNA分子,其中含有模板的DNA分子有2个只含有一个引物,则同时含引物1和引物2的DNA占3/4。解析基因工程的基本操作程序3.(2023·北京海淀二模)OsGLO1、EcCAT、EcGCL和TSR四个基因分别编码四种不同的酶,研究人员将这些基因分别与叶绿体转运肽(引导合成的蛋白质进入叶绿体)基因连接,构建多基因表达载体(载体中部分序列如图所示),利用农杆菌转化法转化水稻,在水稻叶绿体内构建了一条新代谢途径,提高了水稻的产量。下列叙述正确的是(

)A.可用抗原—抗体杂交技术检测四种酶在转基因水稻中是否表达B.四个基因转录时都以DNA的同一条单链为模板C.应选用含卡那霉素的培养基筛选被农杆菌转化的水稻细胞D.四个基因都在水稻叶绿体内进行转录翻译√由题图可知,在同一个T-DNA中OsGLO1启动子启动转录的方向与其他三个基因的不同,说明四个基因转录时并不都以DNA的同一条单链为模板;卡那霉素抗性基因不在T-DNA中,而潮霉素抗性基因在T-DNA中,应选用含潮霉素的培养基筛选被农杆菌转化的水稻细胞;由题意知,利用农杆菌转化法转化水稻,可使目的基因插入水稻细胞中染色体的DNA上,所以与叶绿体转运肽基因连接的四个基因,在水稻细胞核内进行转录,在核糖体中进行翻译。解析4.(多选)(2024·湖南衡阳月考)戊型肝炎病毒是一种RNA病毒,ORF2基因编码的结构蛋白(pORF2)位于病毒表面,构成病毒的衣壳。我国科研人员利用基因工程技术,在大肠杆菌中表达pORF2,制备戊型肝炎疫苗,过程如图。下列关于该疫苗的叙述正确的是(

)A.过程①需要的酶是RNA聚合酶,原料是A、U、G、CB.重组基因表达载体上的启动子需来源于大肠杆菌C.过程⑤需要用聚乙二醇处理大肠杆菌使其处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态D.过程⑥大量制备pORF2蛋白前应做相应的检测与鉴定√√戊型肝炎病毒是一种RNA病毒,过程①是以病毒RNA为模板合成DNA,获取目的基因的过程,需要的酶是逆转录酶,原料是四种脱氧核苷酸;启动子是一段有特殊序列结构的DNA片段,其作用是供RNA聚合酶的识别结合以驱动目的基因的转录,启动子具有物种或组织特异性,构建在大肠杆菌细胞内特异表达pORF2的载体时,需要选择大肠杆菌细胞的启动子,而不能选择其他物种的启动子;将目的基因导入微生物细胞的方法是Ca2+处理法,需要用Ca2+处理大肠杆菌,使其处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态。解析1.DNA的粗提取与鉴定(1)基本原理。考点三DNA的粗提取与鉴定、DNA片段的扩增及电泳鉴定不溶于2mol/L二苯胺(2)操作流程。95％沸水提醒加入酒精和用玻璃棒搅拌时,动作要轻缓,以免加剧DNA分子的断裂,导致DNA分子不能形成絮状沉淀。2.DNA片段的扩增及电泳鉴定(1)实验基础。①PCR原理:利用了

原理。②电泳:DNA分子具有可解离的基团,在一定的pH下,这些基团可以带上正电荷或负电荷。在电场的作用下,这些带电分子会向着与它所带电荷

的电极移动,这个过程就是电泳。③PCR的产物一般通过琼脂糖凝胶电泳来鉴定。在凝胶中DNA分子的迁移速率与凝胶的浓度、DNA分子的

等有关。DNA的热变性相反大小和构象(2)PCR实验操作步骤。微量移液器(3)DNA的电泳鉴定:凝胶中的DNA分子通过染色,可以在波长为

的紫外灯下被检测出来。底部300nm[正误辨析]1.用同样方法从等体积兔血和鸡血中提取的DNA量相近。(

)提示:哺乳动物(如兔)成熟的红细胞无细胞核,细胞内基本不含DNA。2.DNA析出过程中,搅拌操作要轻柔以防DNA断裂。(

)3.在凝胶中DNA分子的迁移速率只与DNA分子的大小有关。(

)提示:在凝胶中DNA分子的迁移速率与凝胶的浓度、DNA分子的大小和构象等有关。×√×[教材微点思考]1.(选择性必修3P74“探究·实践”拓展)过滤研磨液用纱布不用滤纸的原因是什么?提示:DNA会吸附在滤纸上,影响提取DNA的量。2.(选择性必修3P85“探究·实践”拓展)如果电泳鉴定结果未出现扩增条带,可能是哪些原因造成的?提示:未出现扩增条带可能的原因有模板DNA含有杂蛋白或TaqDNA聚合酶的抑制剂;TaqDNA聚合酶失活;引物出现质量问题,浓度不合适;Mg2+浓度过低;变性温度低,变性时间短等。1.(2022·山东卷)关于“DNA的粗提取与鉴定”实验,下列说法错误的是(

)A.过滤液沉淀过程在4℃冰箱中进行是为了防止DNA降解B.离心研磨液是为了加速DNA的沉淀C.在一定温度下,DNA遇二苯胺试剂呈现蓝色D.粗提取的DNA中可能含有蛋白质√DNA的粗提取与鉴定低温时DNA酶的活性较低,过滤液沉淀过程在4℃冰箱中进行是为了防止DNA降解;离心研磨液是为了使细胞碎片沉淀;在沸水浴条件下,DNA遇二苯胺试剂呈现蓝色;细胞中的某些蛋白质可以溶于酒精,但可能有的蛋白质不溶于酒精,在95%的冷酒精中与DNA一块儿析出,故粗提取的DNA中可能含有蛋白质。解析2.(2023·山西晋城月考)如图是“DNA的粗提取与鉴定”实验中的两个操作步骤示意图。