牛轮状病毒腹泻诊断技术规范

1牛轮状病毒腹泻诊断技术规范本文件规定了牛轮状病毒性腹泻的临床诊断和实验室诊断技术方法、操作程序和判定标准。本标准适用于牛轮状病毒性腹泻的诊断、监测和检疫等。2规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB19489实验室生物安全通用要求GB/T27401实验室质量控制规范动物检疫3缩略语下列缩略语适用于本文件。BRV：牛轮状病毒（Bovineratovirus）CPE：致细胞病变效应（CytopathicEffect）PBS：磷酸盐缓冲盐水（PhosphateBufferSaline）FBS：胎牛血清（FetalBovineSerum）PCR：聚合酶链式反应（PolymeraseChainReaction）TCID50：半数细胞培养物感染量（MedianTissueCultureInfectiveDose）LD50：半数致死量（MedianLethalDose）MA104细胞：恒河猴肾细胞（Rhesuskidneycell）Vero细胞：非洲绿猴肾细胞（VerdaRenoCell）MDBK细胞：牛肾细胞（MadinDarbyBovineKidneyCell）DMEM：DuLbecco’sModifiedEagleMedium4生物安全措施样品采集的生物安全措施符合GB/T27401的规定。样品处理的生物安全措施符合GB19489的规定。5病原牛轮状病毒属于呼肠孤病毒科，轮状病毒属，病毒颗粒无囊膜，近似球形，直径约70～75nm，具有外、中、内三层衣壳，每层均为20面体对称。基因组为线状双股RNA。26临床诊断6.1流行病学6.1.1传染源病牛和带毒牛是本病自然流行的传染源，隐性感染牛和痊愈牛可持续排毒长达3周。6.1.2传播途径消化道是主要的传播途径。6.1.3易感动物不同年龄和品种牛均可感染BRV，3周龄内牛最易感，多发生于1周龄内的犊牛。6.1.4流行特点有明显季节性，多发生在晚秋、冬季和早春。6.2临床症状犊牛感染后在12～24h引起严重腹泻，发病突然，病初表现为精神不振、厌食、呕吐和腹泻，体温正常或略高，排黄白色、液状粪便，有时排出带有黏液和血液的稀便。病程长者脱水明显，严重者常有死亡。成年牛多呈隐性感染，并在一定时间持续向外界排毒。6.3病理变化牛轮状病毒感染主要表现在消化道，肠腔内充满凝乳块和乳汁，小肠肠壁变薄、半透明，肠内容物呈液状、灰黄或灰黑色，有时小肠黏膜出现广泛出血，肠系膜淋巴结肿大。6.4结果判定易感动物出现上述临床症状和病理变化，可初步判定为牛轮状病毒性腹泻疑似病例。7实验室诊断7.1器材7.1.1CO2细胞培养箱7.1.2T25细胞培养瓶7.1.3漩涡振荡器7.1.4倒置显微镜7.1.5电镜7.1.6电泳仪7.1.7水平电泳槽7.1.8凝胶成像仪7.1.9不同规格可调移液器与枪头7.1.10PCR仪7.1.11台式高速离心机7.1.12低速离心机7.1.13水浴锅7.1.14电子天平7.1.1596孔细胞培养板7.1.16无菌棉拭子7.1.17玻璃珠7.1.18不同规格离心管7.1.19PCR管7.1.20无菌密封袋7.1.21手术刀、手术剪7.1.22无菌镊7.1.23研钵7.1.24分光光度计7.1.25不同规格移液器及枪头7.1.26漩涡振荡器7.1.27温箱7.1.28低温高速离心机7.2试剂7.2.1PBS7.2.2DMEM培养基7.2.3细胞培养液7.2.4细胞维持液7.2.5FBS7.2.6青链霉素7.2.70.25%EDTA-胰酶7.2.8MA104细胞7.2.9Vero细胞7.2.10MDBK细胞7.2.11丙酮7.2.122%磷钨酸7.2.13无酶水7.2.14PCRTaq酶7.2.15电泳缓冲液7.2.16琼脂糖7.2.17DNAMarker7.2.18RNA提取试剂盒7.2.19蒸馏水7.3样品采集与处理7.3.1粪便样品4将棉拭子伸入肛门内刮取新鲜粪便，地上有刚排出的新鲜粪便时无菌采集。分别放入装有3mLPBS的管中，编号并记录相关信息。漩涡振荡器充分振荡，4℃、12000r/min离心5min～8min，取上清编号备用。7.3.2组织样品取病死牛小肠及内容物，置于无菌密封袋内。称取1g样品置于研钵，充分研磨后加5mLPBS，混匀，4℃、8000r/min离心5min，取上清编号备用。7.3.3血液样品一次性采血管采集血液3～4mL，犊牛采用颈静脉采血，成年牛采用尾静脉采血。室温静置30min，3000～4000r/min离心5min～10min。分离血清编号备用。7.4样品运输与保存采集的样品运送时放置冷冻冰袋，尽量12h内运送至实验室。采集或处理后的样品在2℃~8℃保存，一般不超过24h，若长期保存，应置于-70℃以下条件保存。7.5病原学检测7.5.1电镜检查将采集的粪便或肠内容物用PBS制成1:4悬液，装入盛有玻璃珠的管内充分震荡30min，取悬液3000r/min离心30min，取上清液，再以15000r/min离心30min，弃上清，加1～2滴蒸馏水悬浮，2%磷钨酸染色，电镜下观察病毒粒子形态。7.5.2病毒分离鉴定7.5.2.1病毒分离7.5.2.1.1单层细胞制备MA104、Vero和MDBK细胞均可用于牛轮状病毒分离培养。将细胞用0.25%EDTA-胰酶消化，加入至少等体积的细胞培养液终止，吹打混匀，使其分散浓度为1～2×106个/mL，分装到T25细胞培养瓶，置于37℃、5%CO2培养箱中静置培养24h～48h。随时观察细胞生长情况，待细胞铺成单层备用。7.5.2.1.2接种细胞将处理后的样品用细胞维持液制成1:5悬液，漩涡振荡混匀，4℃、3000r/min离心10min，用0.22µm滤膜过滤后取上清，添加浓度为10～20µg/mL胰酶，37℃处理0.5h～1h。每份样品接种3瓶细胞，设置正常细胞对照组。接种前弃去细胞培养瓶中液体，按细胞维持液终体积的10%加入处理好的样品，37℃吸附1h，期间每隔20min摇晃一次，吸附完成后补加含0.5µg/mL～2µg/mL胰酶的细胞维持液。对照组不接种样品，弃去培养液后加入等量细胞维持液。均置于37℃、5%CO2培养箱中静置培养。7.5.2.1.3观察和记录5每天观察细胞状态并记录，连续观察4d～5d。如对照组细胞单层完好，细胞生长正常，接种样品的细胞出现CPE，且80%以上细胞出现时，置-70℃以下冻存。若接种的细胞无CPE出现，反复冻融3次，进行盲传。7.5.2.1.4盲传将第1代无CPE的细胞培养物冻融3次后混合，4℃、5000r/min离心5min～8min，取上清继续接种细胞，进行观察、记录、收毒，盲传第2代。此过程中培养物仍无CPE则按同样的方法继续盲传至第5～7代，若出现CPE，达到80%以上时收毒，置-70℃以下冻存。7.5.2.2中和试验7.5.2.2.1单层细胞制备将细胞浓度制备为1～2×106个/mL，于96孔板培养，每孔100µL，加细胞培养液补齐至1mL/孔，置于37℃、5%CO2培养箱培养24h。7.5.2.2.2固定血清-稀释病毒法用DMEM培养基将病毒液进行梯度稀释（10-1～10-8将不同稀释梯度的病毒液和已灭活的血清等体积混合，37℃水浴感作1h；取混合液200µL分别加至已长成单层细胞的96孔细胞培养板，每个稀释梯度接种4孔；同时设1:10稀释的BRV阳性血清对照、1:5稀释的阴性血清对照和正常细胞对照各4孔。于37℃、5%CO2培养箱培养，每天观察并记录各孔CPE，连续观察5d～7d。7.5.3PCR检测7.5.3.1总RNA提取将采集的样品或细胞培养物进行处理，按RNA提取试剂盒方法提取核酸。在-20℃条件下可短时间保存，若需长期保存，应置于-70℃以下条件，避免反复冻融。7.5.3.2引物合成根据BRVVP6基因设计引物。BRV-VP6-F：GACGGAGCGACTACATGGT；BRV-VP6-R：GTCCAATTCATACCTGGTGG。7.5.3.3反应体系按25µL反应体系配制（见附录C）。一步法：模板2µL，上、下游引物各1µL，OnestepTaq酶12.5µL，RNase-FreeH2O8.5uL。H2O8.5uL。7.5.3.4反应程序一步法：50℃30min；94℃5min；95℃20s，54℃30s，72℃30s，35个循环；72℃10min。两步法：94℃5min；95℃20s，54℃30s，72℃30s，35个循环；72℃10min。7.5.3.5电泳检测制备琼脂糖凝胶，取5～8µLPCR扩增产物加入上样孔，同时加入阳性和阴性对照以及DNAMarker，于1×TAE电泳缓冲液中进行电泳，凝胶成像仪观察结果。67.5.3.6测序分析PCR扩增产物经胶回收纯化后测序分析，序列Blast比对是否为牛轮状病毒VP6基因。7.5.4ELISA检测待检粪便样品按牛轮状病毒抗原诊断ELISA试剂盒方法进行检测。使用分光光度计检测450nmOD值。7.5.5结果判定7.5.5.1电镜检查结果可见略呈球形，直径约70～75nm的病毒颗粒，其形态似典型的“车轮”状，即判定样品为牛轮状病毒阳性。7.5.5.2中和试验结果当正常对照组孔内细胞单层生长良好，阳性血清对照组不出现CPE，阴性血清对照组出现CPE，证明试验成立，可进行结果判定。被检血清的中和指数＞50，有2个或2个以上孔的细胞未出现CPE，即判定为阳性(见附录B.1)。7.5.5.3PCR检测结果阳性对照、PCR产物与预期片段大小一致（380bp），同时阴性对照无条带；即判定为阳性测序分析Blast比对为牛轮状病毒VP6基因，即判定为阳性。7.5.5.4ELISA检测结果按ELISA试剂盒要求进行判定，样品结果符合阳性标准即判定为阳性。7.6血清学检测采用中和试验（固定病毒-稀释血清法）进行血清学检测。7.6.1检测时间发病初期和发病后2周各检测1次。7.6.2血清稀释于1.5mL离心管中加入DMEM培养基，每管100µL；取56℃,30min灭活的血清100µL加入管内，从第一个管开始做10倍连续稀释，从最后一管内弃去100µL液体。7.6.3感作每个不同稀释度的血清内加入等量BRV病毒液，充分混匀，37℃水浴感作1h。7.6.4接种取200µL感作后的液体分别加至已长成单层细胞的96孔细胞培养板中，每个稀释梯度接种4孔；同时设血清毒性对照（细胞内加最低稀释度的血清）、1:10稀释的BRV阳性血清对照、1:5稀释的阴性血清对照和正常细胞对照各4孔及BRV病毒液回归对照100～10-3的4个稀释度，每个稀释度各4孔。77.6.5观察和记录将细胞板置于37℃、5%CO2培养箱培养，连续观察5d～7d，观察并记录各孔CPE。7.6.6结果判定1)当正常对照组孔内细胞单层生长良好，阳性血清对照组不出现CPE，阴性血清对照组出现CPE，证明试验成立。记录血清各稀释度的4个孔中出现CPE的孔数，按照Reed-Muench法(见附录B.2)分别计算血清中和BRV的抗体效价，抗体效价大于1:5时，即为中和试验结果阳性。2)发病初期和发病后2周中和试验结果均为阳性，且发病后2周抗体效价达发病初期的4倍，即判定为牛轮状病毒感染。8综合判定8.1初诊符合流行病学、临床症状和病理变化可初步诊断为牛轮状病毒性腹泻。8.2确诊符合流行病学、临床症状和病理变化，同时病原学检测中任一检测（电镜检查、病毒分离鉴定、PCR检测、ELISA检测）结果判定为阳性可确诊牛轮状病毒性腹泻。符合流行病学、临床症状和病理变化，同时血清学检测（中和试验）结果判定为阳性可确诊牛轮状病毒性腹泻。8试剂配制A.1PBS缓冲液：NaClKClNa2HPO4KH2PO41.44g0.24g蒸馏水定容至800mL，HCl调其pH至7.4左右，加蒸馏水定容至1000mL，121℃15min高压灭菌。A.2细胞培养液：DMEM培养基FBS青链霉素44.5mL混合均匀后，4℃密封保存，建议现配现用。A.3细胞维持液DMEM培养基0.25%EDTA-胰酶消化液青链霉素44.5mL0.25g/mL500µL混合均匀后，4℃密封保存，建议现配现用。A.450×TAE电泳缓冲液三羟甲基氨基甲烷（Tris）EDTA-2Na冰乙酸去离子水242g37.2g57.1mL942.9mLTris和EDTA-2Na溶于800mL去离子水，搅拌均匀；加入冰乙酸，充分溶解；用1moL/LNaOH调pH值至8.3，灭菌去离子水定容至1000mL后，室温保存。使用时稀释50倍即为1×TAE电泳缓冲液9中和试验结果计算方法B.1固定血清-稀释病毒法在固定量的血清中，加入等量但不同稀释度的病毒，用对照组和待检血清同时进行测定，计算每一组的LD50，然后计算中和指数。表B.1中和指数计算示例LD1010根据表B.1计算：中和指数=试验组LD50/对照组LD50中和指数=10-2.2/10-5.5=103.3=1995说明待检血清中和病毒能力为对照血清的1995倍。通常待检血清的中和指数＞50，即可判定